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        紅景天有效成分微生物發(fā)酵高值化轉(zhuǎn)化

        2019-05-23 03:36:20吳捷吳傳超顧秋亞余曉斌
        食品與發(fā)酵工業(yè) 2019年9期
        關(guān)鍵詞:紅景天酪氨酸發(fā)酵液

        吳捷,吳傳超,顧秋亞,余曉斌*

        1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122) 2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122)

        紅景天是在高海拔地區(qū)發(fā)現(xiàn)的景天科珍稀植物[1],紅景天苷(salidroside, SAL)和酪醇(tyrosol, TYR)是所有紅景天屬植物的主要生物活性成分[2]。由于其具有抗氧化[3]、抗疲勞[4]、抗衰老[5]和適應(yīng)性[6]等藥理作用,被用作食品作物和民間醫(yī)藥。而酪醇和紅景天苷含量的高低和抗氧化能力強(qiáng)弱常被作為評價(jià)紅景天屬植物藥用價(jià)值的指標(biāo)[7]。

        隨著酪醇和紅景天苷在健康食品、化妝品和制藥工業(yè)中的需求增加,野生紅景天植物被過度開發(fā)[8-9]。然而,紅景天植物的人工栽培一直受到海拔要求的限制,且種植面積大,生產(chǎn)周期長,活性成分含量低[10-12]。近年來,組織和細(xì)胞培養(yǎng)以及化學(xué)合成方法已用于SAL和TYR的生產(chǎn),但這些方法成本高,產(chǎn)量低,對環(huán)境污染嚴(yán)重[13-14]。中藥的發(fā)酵炮制過程實(shí)際上是一個(gè)生物轉(zhuǎn)化的過程,具有選擇性強(qiáng),反應(yīng)條件溫和,轉(zhuǎn)化效率高,副產(chǎn)物少,有效成分破壞少,毒副作用低,下游處理方便等特點(diǎn)[15-17]。

        酪醇的合成途徑被認(rèn)為起源于酪氨酸[18]。微生物轉(zhuǎn)化酪醇及紅景天苷靠的是多酶反應(yīng),其中酪氨酸脫羧酶作為連接反應(yīng)中初生代謝與次生代謝之間重要酶類,影響反應(yīng)的進(jìn)展與速度[19-20]。

        本文利用生物轉(zhuǎn)化的方法合成酪醇,并利用篩選出的菌株發(fā)酵紅景天,以提高其中的紅景天苷含量和抗氧化性。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 菌株及培養(yǎng)基

        菌株:酵母菌株、乳酸菌菌株,由江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏。培養(yǎng)基:YPD培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基;氨基酸脫羧酶選擇培養(yǎng)基:蛋白胨5 g/L,酵母浸粉3 g/L,葡萄糖1 g/L,1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液1 mL,L-酪氨酸5 g/L,pH 6.8。紅景天發(fā)酵培養(yǎng)基:紅景天粉末50 g/L,KH2PO44g/L,尿素4 g/L,(NH4)2SO43 g/L,MgSO40.25 g/L。

        1.1.2 中藥及試劑

        紅景天,無錫市同仁堂藥店;酪醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度均為98%)、紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)品,大連美侖生物技術(shù)公司;甲醇、乙腈為色譜純,其他常用化學(xué)試劑均為市售分析純。

        1.2 菌株的篩選

        1.2.1 菌種初篩

        酪氨酸在酪氨酸脫羧酶的作用下會產(chǎn)生CO2,形成的堿性產(chǎn)物生物胺會使培養(yǎng)基的pH下降,從而使指示劑溴甲酚紫變成紫色[21]。且L-酪氨酸在選擇平板中脫羧形成溶于水的產(chǎn)物酪醇,而L-酪氨酸微溶于水,因此在平板上形成透明圈,可以根據(jù)透明圈的大小和顏色變化程度來判斷微生物轉(zhuǎn)化L-酪氨酸的能力。

        1.2.2 復(fù)篩

        將初篩所得到的菌株接種到50 mL種子液中,培養(yǎng)24 h后按5%(體積分?jǐn)?shù))接種量接于加入酪氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中,在30 ℃、180 r/min下培養(yǎng)72 h。設(shè)置空白對照,不接入菌但加入酪氨酸;將種子液接種到不加入酪氨酸的50 mL的發(fā)酵液中,得到菌種對照;發(fā)酵3 d后,在4 ℃、10 000 r/min下離心10 min,將上清液旋干后用甲醇沉淀其中的蛋白,離心去除沉淀后再用10 mL甲醇定容,過0.22 μm濾膜,得到待檢測的樣品。

        1.3 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分析

        1.3.1 HPLC檢測

        酪醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:準(zhǔn)確稱取20 mg酪醇標(biāo)準(zhǔn)品溶于10 mL甲醇中,并依次稀釋到質(zhì)量濃度為50、100、200、400、800 mg/mL。得到標(biāo)準(zhǔn)方程為Y=3.300 1x+3.792,相關(guān)系數(shù)R2= 0.997 6。色譜條件及設(shè)備:采用SBC-18色譜柱(4.6 mm×150 mm),流動(dòng)相:A 0.1%磷酸∶B甲醇∶C乙腈=75∶20∶5(V∶V∶V),流速1 mL/min,檢測波長276 nm,溫度:30 ℃。

        1.3.2 液質(zhì)聯(lián)用分析

        采用HPLC-ESI-MS測定化合物的相對分子量,根據(jù)圖譜上相對保留時(shí)間以及特征碎片離子推斷化合物的結(jié)構(gòu)骨架及其斷裂方式。

        質(zhì)譜條件:離子方式:ESI-;離子源溫度100 ℃;脫溶劑溫度400 ℃;毛細(xì)管電壓3.5 kV;碰撞能量6 V;檢測器電壓1 800 V;選擇離子掃描范圍m/z在50~1 500。

        1.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

        酵母菌以YPD為基本培養(yǎng)基,加入蔗糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、可溶性淀粉等碳源,添加質(zhì)量濃度分別為15、30、45、60、75 g/L;加入(NH4)2SO4、NH4Cl2、黃豆粉、玉米漿、胰蛋白胨、酵母粉等氮源,添加質(zhì)量濃度分別為15、30、45、60、75 g/L,測定酪醇的產(chǎn)量,酪氨酸底物添加量為4 g/L。

        1.5 應(yīng)用

        1.5.1 紅景天發(fā)酵

        稱取紅景天2.5 g置于250 mL三角瓶中,加水50 mL,混勻,121 ℃滅菌20 min,即得中藥發(fā)酵培養(yǎng)基,將所篩選的菌株按接種量(體積分?jǐn)?shù))10%接種到紅景天發(fā)酵培養(yǎng)基,酵母菌發(fā)酵體系于30 ℃、180 r/min發(fā)酵48 h,乳酸菌發(fā)酵中藥體系于37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h。

        1.5.2 總還原力測定

        參照AGRAWAL等[22]的方法,略有改動(dòng)。吸取0.5 mL待測樣液,向其中加入0.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液及0.5 mL PBS,混勻并置于50 ℃水浴恒溫反應(yīng)20 min,取出放入冰浴中迅速冷卻,再加入0.5 mL 10%三氯乙酸溶液,混勻后離心。取上清液1.0 mL,加入1.0 mL水,再加入1.0 mL 0.1% FeCl3溶液,混勻,室溫靜置10 min后在700 nm處測定其吸光值,吸光值與待測樣品的總還原力呈正相關(guān)。

        1.5.3 DPPH自由基清除能力測定

        參照WANG等[23]方法并加以改進(jìn)。吸取1.0 mL乙醇溶液,加0.5 mL DPPH自由基乙醇溶液(0.1 mmol/L),加1.0 mL樣品溶液,混勻,在室溫下避光放置60 min,然后在517 nm下測定吸光度,并計(jì)算DPPH自由基清除率[14]。

        (1)

        式中:A0, 溶劑空白管吸光值;Ai,樣品管吸光值。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 平板初篩

        從198株菌株中篩選出80株能使平板變色,并具有菌落透明圈的菌株。其中酵母63株,乳酸菌17株。根據(jù)平板變色的時(shí)間和深淺初步判斷微生物產(chǎn)酪氨酸脫羧酶的能力強(qiáng)弱。試驗(yàn)僅觀察平板點(diǎn)種2 d后的平板顏色變化,篩選結(jié)果如圖1。其中圖1-A不能使平板變色,圖1-B和圖1-C都能使平板變色,圖1-C中的菌種長勢旺盛,變色范圍較1-B圖中菌株大。培養(yǎng)2 d后,C圖菌株已經(jīng)能使整個(gè)平板變色。初步判斷其轉(zhuǎn)化能力較強(qiáng)。

        A-不能使平板變色菌株;B-變色圈小菌株(Y1);C-變色圈大的菌株(ww0304) 圖1 平板篩選轉(zhuǎn)化酪氨酸菌株Fig.1 Screen screening of transformed tyrosine strains

        2.2 HPLC檢測

        通過高效液相色譜對上述80株菌株是否能夠轉(zhuǎn)化成酪醇進(jìn)行檢測分析,其中能夠轉(zhuǎn)化成酪醇的有9株,2株為酵母,7株為乳酸菌。并確定了1株轉(zhuǎn)化率最高的菌株WW0304。如圖2所示,紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)品在3.304 min出峰,酪醇保留時(shí)間在4.895 min,其中圖2-B為空白對照組,即不接入菌種只加入底物酪氨酸,且在4.895 min未檢測到吸收峰,而發(fā)酵液圖2-C和圖2-D均在4.895 min處檢測到吸收峰,其中圖2-D為菌株WW0304發(fā)酵液圖譜。初步判斷該菌能夠?qū)⒌孜镛D(zhuǎn)化成酪醇和紅景天苷。

        A-紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)品;B-空白對照;C-菌株Y1的發(fā)酵液;D-ww0304發(fā)酵液;E-酪醇標(biāo)準(zhǔn)品圖2 HPLC對產(chǎn)物的初步鑒定Fig.2 Preliminary identification of the product by HPLC

        2.3 液質(zhì)聯(lián)用檢測結(jié)果

        對預(yù)處理后的發(fā)酵液進(jìn)行進(jìn)一步的液質(zhì)分析,圖3為發(fā)酵液預(yù)處理后在保留時(shí)間4.616 min下的一級質(zhì)譜圖。在m/z為137下的離子峰為[M-H]-,m/z為93下的離子峰猜測為離子碎片,為[M-H-COOH]-。

        圖3 酪醇樣品一級質(zhì)譜圖Fig.3 First-order mass spectrum of tyrosol sample

        圖4為保留時(shí)間4.613 min下的二級質(zhì)譜圖。在能量加大的情況下,物質(zhì)斷裂的更加徹底,137的峰大量斷裂。而酪醇上的苯環(huán)不易斷裂,因此未有新的離子峰出現(xiàn)。

        圖4 酪醇樣品二級質(zhì)譜圖Fig.4 Secondary spectrum of tyrosol sample

        2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

        2.4.1 碳源對酪醇產(chǎn)量的影響

        碳源對酪醇產(chǎn)量的影響結(jié)果如圖5所示。當(dāng)乳糖、淀粉為碳源時(shí),微生物基本不生成酪醇,而當(dāng)葡萄糖為碳源時(shí),酪醇的產(chǎn)量最高。其原因可能是葡萄糖會促進(jìn)菌株產(chǎn)酪氨酸脫羧酶,并且對于菌株合成酪醇來說是必不可少的[24]。其中添加質(zhì)量濃度為20 g/L的葡萄糖,可促使該菌株產(chǎn)酶活性和酪醇的產(chǎn)量最大,為2.3 g/L。

        A-不同碳源對酪醇含量的影響;B-葡萄糖質(zhì)量濃度對酪醇含量的影響圖5 碳源對酪醇產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of carbon sources on tyrosol production

        2.4.2 氮源對酪醇產(chǎn)量的影響

        氮源對酪醇產(chǎn)量的影響結(jié)果如圖6所示。有機(jī)氮源對酪醇的產(chǎn)量有促進(jìn)作用,當(dāng)添加質(zhì)量濃度為30 g/L的玉米漿時(shí),酪醇的產(chǎn)量最高,為2.3 g/L。玉米漿能促進(jìn)產(chǎn)酶和提高產(chǎn)量,可能是因?yàn)槠浜写罅康木S生素和其他微量元素。

        A-不同氮源對酪醇含量的影響;B-玉米漿濃度對酪醇含量的影響圖6 氮源對酪醇產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of nitrogen source on tyrosol production

        2.5 在紅景天發(fā)酵中的應(yīng)用

        將9株能夠轉(zhuǎn)化酪氨酸的菌株接種到紅景天培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵,通過高效液相色譜(圖7-A)對其中TRY和SAL進(jìn)行定量分析。發(fā)酵后酪醇和紅景天苷含量都得到提高,其中菌株WW0304(圖7-B菌株Y2)發(fā)酵后總有效成分提高最多,酪醇產(chǎn)量提高235%,紅景天苷產(chǎn)量提高了109.9%左右。

        A-發(fā)酵液前后液相對比圖;B-不同菌種發(fā)酵有效成分含量對比圖7 不同菌種發(fā)酵液中酪醇和紅景天苷含量對比Fig.7 Comparison of tyrosol and salidroside in fermentation broth of different strains

        以維生素C(Vc)作為陽性對照,對紅景天水提液及WW0304紅景天發(fā)酵液的總還原力進(jìn)行研究(圖8)。在不同的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),紅景天發(fā)酵液總還原力均明顯高于水提液的總還原力。在10.5~52.5 mg/L范圍內(nèi),相同質(zhì)量濃度紅景天發(fā)酵液的總還原力大于Vc溶液的總還原力。

        圖8 紅景天水提液及發(fā)酵液還原力對比Fig.8 Comparison of total reducing power before and after fermentation of Rhodiola

        紅景天發(fā)酵前后的DPPH自由基清除率如圖9所示。紅景天發(fā)酵后其清除DPPH自由基能力增強(qiáng),抗氧化能力增加。在0.42~1.47 g/L,紅景天發(fā)酵液的DPPH自由基清除率高于水提液,空白發(fā)酵液的DPPH自由基清除能力較差。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.42 g/L時(shí),發(fā)酵液的DPPH自由基清除率為7.98%,而當(dāng)質(zhì)量濃度為168 g/L時(shí),紅景天發(fā)酵液的清除率達(dá)到61.01%,在0.42~1.47 g/L隨著紅景天濃度的增高,DPPH自由基清除能力增強(qiáng)。

        圖9 紅景天發(fā)酵前后DPPH自由基清除率對比Fig.9 Comparison of DPPH clearance rate before and after fermentation of Rhodiola

        3 結(jié)論

        酪氨酸和紅景天苷的微生物轉(zhuǎn)化基于多酶反應(yīng),其中酪氨酸脫羧酶在連接反應(yīng)中作為初級代謝和次級代謝之間的重要酶,影響反應(yīng)的速度和進(jìn)程。通過含溴甲酚紫的平板顯色試驗(yàn),篩選出能轉(zhuǎn)化酪氨酸的菌株,并通過搖瓶復(fù)篩判定其轉(zhuǎn)化能力。實(shí)驗(yàn)確定1株轉(zhuǎn)化率較高的菌株WW0304,以葡萄糖為碳源,玉米粉為氮源,且葡萄糖添加的質(zhì)量濃度為20 g/L,玉米漿質(zhì)量濃度為30 g/L時(shí),酪醇產(chǎn)量達(dá)到2.3 g/L。最終將篩選到的菌株應(yīng)用于紅景天發(fā)酵,酪醇產(chǎn)量由發(fā)酵前的0.23 g/L增加為0.78 g/L,提高了235%,紅景天苷產(chǎn)量由發(fā)酵前的0.21 g/L增加到0.43g/L,提高了109.9%。發(fā)酵后的總還原力是發(fā)酵前的1.7倍,DPPH自由基清除能力由發(fā)酵前的35.45%增加到61.01%。本實(shí)驗(yàn)為酪醇的生物合成提供了一種新的思路,并為紅景天的開發(fā)利用提供了新的方向。

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