朱雯惠，孟青，江波，張濤

(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

國際稀有糖協(xié)會(International Society of Rare Sugar，ISRS)將稀有糖定義為：自然界中存在但含量極少的一類單糖及其衍生物[1]。例如，L-葡萄糖、D-阿洛酮糖、D-塔格糖、木糖醇和L-木酮糖等都屬于稀有糖[2]。其中，L-木酮糖是一種戊酮糖，還是各種原核和真核生物體內(nèi)的代謝中間產(chǎn)物[3]。雖然它在自然界中含量稀少，但是卻在一些領(lǐng)域發(fā)揮著重要的功能和作用。L-木酮糖是α-葡萄糖苷酶的高效抑制劑[4]，已有以L-木酮糖作為主要成分的降血糖藥物，可以用來降低糖尿病患者血液中的葡萄糖水平[5]。此外，它還可以作為前體物質(zhì)來生產(chǎn)其他稀有糖，如L-來蘇糖[6]、L-木糖[7]和L-核糖[8]。

4-木糖醇脫氫酶又稱為L-木酮糖還原酶(EC 1.1.1.10)，與短鏈脫氫酶/還原酶家族成員有高度相似性[9]，可催化木糖醇與L-木酮糖之間的相互轉(zhuǎn)化。目前，已報道的含有這種酶的細菌分別為噬夏孢歐文氏菌(后改名為菠蘿泛菌)(Pantoeaananatis)[10]、產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes)[11]、蒼白芽孢桿菌(Bacilluspallidus)[12]和巨大芽胞桿菌(Bacillusmegaterium)[13]。基于生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-木酮糖，主要是通過菌體靜息細胞催化氧化底物木糖醇。此方法條件溫和、工藝簡單，且木糖醇價格相對低廉，因此利用4-木糖醇脫氫酶轉(zhuǎn)化木糖醇是生產(chǎn)L-木酮糖的理想方法[14]。

4-木糖醇脫氫酶的工程菌表達宿主主要為大腸桿菌[15-16]，還未有研究表明其在枯草芽孢桿菌中成功表達。并且，我國在稀有糖的研究方面主要集中于木糖醇、赤蘚糖醇等[17-20]，關(guān)于L-木酮糖的研究較少，而其在食品與醫(yī)藥等方面的重要作用不可小覷[21]，因此優(yōu)化具有轉(zhuǎn)化木糖醇生產(chǎn)L-木酮糖能力的菌株，對L-木酮糖的研究具有很大的價值和意義。作者所在課題組前期研究中，實現(xiàn)了4-木糖醇脫氫酶在質(zhì)粒型枯草芽孢桿菌工程菌中的表達。本實驗將對已構(gòu)建的枯草芽孢桿菌工程菌發(fā)酵條件以及靜息細胞反應(yīng)條件進行優(yōu)化以提高酶活，從而提高木糖醇的轉(zhuǎn)化率和木酮糖得率。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)宿主菌株1A751(XDH來源于PantoeaananatisATCC 43072)為實驗室構(gòu)建并保存。

L-木酮糖標品，百靈威公司；木糖醇，上海生工；其他試劑，均購買自國藥集團(分析純)。

1.1.2 培養(yǎng)基

平板分離培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，瓊脂20。121 ℃滅菌15 min，保溫。

(LB)種子培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10。121 ℃滅菌15 min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10。121 ℃滅菌15 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 平板培養(yǎng)

在無菌環(huán)境中，用接種環(huán)蘸取保藏甘油管中的菌體，平板劃線。將平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，封口置常溫保藏。

1.2.2 種子培養(yǎng)

在無菌超凈臺中，挑取平板上的單菌落，接種到含30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，37 ℃，200 r/min搖床過夜培養(yǎng)。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)

在無菌環(huán)境中，將種子液接種1 mL到含30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，37 ℃培養(yǎng)12 h，轉(zhuǎn)速200 r/min。發(fā)酵培養(yǎng)基結(jié)束后，取發(fā)酵液離心(5 000 r/min，8 min)，棄去離心得到的上清，收集菌體，用生理鹽水洗滌2次(5 000 r/min，8 min)，洗去發(fā)酵液，得到待反應(yīng)的靜息細胞。

1.2.4 靜息細胞反應(yīng)

反應(yīng)體系：取1 mL發(fā)酵菌液12 000 r/min離心，2 min后收集菌體，用等體積20 g/L的木糖醇溶液(用pH 10.0,50 mmol/L的甘氨酸-NaOH溶液配制)重懸菌體。反應(yīng)條件：37 ℃水浴，反應(yīng)時間3 h。反應(yīng)結(jié)束后離心(12 000 r/min，2 min)，取上清液，通過半胱氨酸咔唑法[22]測定產(chǎn)物L(fēng)-木酮糖的含量。

酶活力單位定義：每升發(fā)酵液每分鐘產(chǎn)生1 μmolL-木酮糖所需要的酶量為1個活力單位，以U表示。

半胱氨酸咔唑法測定產(chǎn)物L(fēng)-木酮糖的含量：靜息細胞反應(yīng)結(jié)束后離心，取經(jīng)過適當(dāng)稀釋的反應(yīng)上清液，加入0.2 mL 15 g/L的半胱氨酸鹽酸鹽溶液，6 mL體積分數(shù)為70%的硫酸溶液，立即振蕩搖勻，再加入0.2 mL 1.2 g/L咔唑酒精溶液，搖勻后放入60 ℃水浴，保溫10 min，室溫冷卻10 min。以木糖醇及反應(yīng)緩沖液作為空白調(diào)零，在560 nm處測定吸光度[23]。通過標準曲線，計算生產(chǎn)的木糖醇含量，進而計算活力。

1.2.5 菌體生長量的測定

取1 mL發(fā)酵液，離心(12 000 r/min，2 min)后獲得菌體，置于烘箱烘干24 h至恒重，稱重，即菌體生長量。

1.2.6 發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵培養(yǎng)條件的影響

通過單因素優(yōu)化實驗確定菌株XDH發(fā)酵培養(yǎng)基中的最適碳源、氮源、金屬離子、發(fā)酵溫度、初始pH值、裝液量和接種量，以 4-木糖醇脫氫酶活力和菌株生長量(干重)為主要指標。

(1)碳源種類及濃度。選取葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、α-乳糖、D-半乳糖、木糖醇、甘露醇和甘油10種碳源。

(2)氮源種類及濃度。選取硫酸銨、尿素、牛肉膏、胰蛋白胨、酵母膏和氯化銨6種常見微生物發(fā)酵所需氮源。在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入各氮源，以10 g/L胰蛋白胨的含氮量為基準，計算含氮量，使所有氮源含氮量相同。

(3)金屬離子種類及濃度。以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加不同濃度的Mg2+、Mn2+、Fe2+、Ca2+。

(4)發(fā)酵培養(yǎng)溫度。本實驗選取28、37和45 ℃這3個常見的發(fā)酵培養(yǎng)溫度進行實驗。

(5)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值約為5，因此實驗取初始pH值為5、6、7、8、9、10和11。

(6)發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量。分別選取發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為10、20、30、40和50 mL。

(7)發(fā)酵培養(yǎng)基接種量。種子于培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)12 h后，分別取0.3、0.5、1、2、3、4、5、6 mL種子液，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)。

(8)基礎(chǔ)培養(yǎng)條件。接種量1 mL/30 mL，培養(yǎng)溫度：37 ℃，200 r/min，培養(yǎng)時間12 h。

1.2.7 靜息細胞反應(yīng)條件的影響

為獲得較高的轉(zhuǎn)化率，實驗研究了反應(yīng)溫度、緩沖體系pH值以及底物質(zhì)量濃度對轉(zhuǎn)化效果的影響。

底物質(zhì)量濃度。以pH為10.0的甘氨酸-NaOH緩沖溶液配制濃度為5、10、20、50和100 g/L的木糖醇溶液。

反應(yīng)溫度。分別在25、30、35、37、40、45和50 ℃恒溫水浴中反應(yīng)3 h，檢測不同反應(yīng)溫度時的L-木酮糖含量。

緩沖溶液pH值。分別配制pH值為9.0、10.0、11.0的甘氨酸-NaOH緩沖溶液和pH為7.0、8.0、9.0的Tris-HCl緩沖溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 碳源的選擇

以LB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加20 g/L的葡萄糖、果糖、麥芽糖、可溶性淀粉、α-乳糖、D-半乳糖、木糖醇、甘露醇、甘油為外加碳源，測定發(fā)酵酶活以及菌體生長量。以LB培養(yǎng)基為對照，酶活及菌體生長量，結(jié)果如圖1所示。

圖1 碳源種類對發(fā)酵產(chǎn)XDH的影響Fig.1 Effects of carbon sources on the production of XDH

由圖1可以觀察到，首先，與LB培養(yǎng)基相比，外加碳源的菌體生長量均有增長，但增長幅度有所差異；其次，與LB培養(yǎng)基相比，外加葡萄糖、蔗糖、α-乳糖、D-半乳糖、木糖醇、甘油這幾種碳源后，發(fā)酵酶活有所增長?；A(chǔ)LB培養(yǎng)基的酶活為1.57 U/L，其中添加蔗糖一組的酶活最高，為3.64 U/L，提高2.32倍左右。

確定最優(yōu)碳源為蔗糖后，分別測定蔗糖質(zhì)量濃度為5、10、15、20、25、30、40 g/L時發(fā)酵液酶活以及菌體生長量，結(jié)果如圖2。

圖2 蔗糖質(zhì)量濃度對發(fā)酵產(chǎn)XDH的影響Fig.2 Effects of sucrose concentration on the production of XDH

由圖2可知，與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比，加入蔗糖越多，菌體生長量越大，在15 g/L后菌體生長量保持恒定，不因添加量的增大而增大；但是發(fā)酵酶活隨著蔗糖的增加，出現(xiàn)先增加后降低，最后趨于平緩的趨勢。其中，在25 g/L處發(fā)酵酶活最高為4.05 U/L。由此，最優(yōu)碳源為25 g/L蔗糖。

2.1.2 氮源種類及濃度

本實驗選擇硫酸銨、尿素、牛肉膏、胰蛋白胨、酵母膏和氯化銨6種常見微生物發(fā)酵所需氮源進行研究，在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入上述各氮源，以10 g/L胰蛋白胨的含氮量為基準，計算其他各氮源濃度，使所有外加氮源的含氮量相同。對發(fā)酵酶活和菌體生長量進行測定，結(jié)果如圖3。

圖3 氮源種類對發(fā)酵產(chǎn)XDH的影響Fig.3 Effects of nitrogen sources on the production of XDH

由圖3可知，上述6種氮源對發(fā)酵酶活和菌體生長量均有不同程度的影響。其中，就菌體生長量來看，牛肉膏、酵母膏等有機氮源對菌體生長量的提高有顯著影響，而添加了尿素的培養(yǎng)基菌體生長量與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比并無顯著提高，但是得到的發(fā)酵絕對酶活最高；因此，基于顯著提高酶活的目的，選擇尿素作為最優(yōu)氮源。

確定了尿素作為發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)氮源后，以1.0、1.5、3.0、4.5、5.0、10.0、15.0、20.0 g/L尿素為梯度優(yōu)化最適氮源質(zhì)量濃度，結(jié)果如圖4。

圖4 尿素質(zhì)量濃度對發(fā)酵產(chǎn)XDH的影響Fig.4 Effects of urea concentration on the production of XDH

從圖4可以看到，發(fā)酵酶活隨著尿素濃度的增大，呈現(xiàn)出先升高后降低、15 g/L后的酶活趨于平緩的趨勢。其中，濃度在6 g/L時，發(fā)酵酶活顯著高于其他濃度，酶活達到4.73 U/L；尿素濃度高于6 g/L時，可能由于高濃度的尿素導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、失去酶活，因此選擇6 g/L的尿素為最優(yōu)氮源濃度。

2.1.3 金屬離子種類及濃度

以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加0.05 g/L的Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+，接種量1 mL/30 mL，37 ℃、200 r/min條件下，培養(yǎng)12 h。對菌株XDH在不同金屬離子存在條件下的菌體生長量和所產(chǎn)4-木糖醇脫氫酶的酶活進行考察，分析各金屬離子的影響，結(jié)果如圖5。

圖5 金屬離子對發(fā)酵產(chǎn)XDH的影響Fig.5 Effect of metal ions on the production of XDH

由圖5可知，不同的金屬離子對枯草芽孢桿菌的生長及酶活力都會產(chǎn)生一定程度的影響。其中Fe2+會產(chǎn)生顯著影響，可能是因為Fe2+是細胞色素氧化酶和過氧化氫酶的組成部分，也是發(fā)生有氧氧化的必要因素[24]；CaCl2雖然可以降低菌體的自溶，顯著提高菌體生長量，這與Ca2+能在發(fā)酵中控制細胞的透性有關(guān)，但是發(fā)酵酶活幾乎沒有提高[25]。因此，實驗進一步研究了Mg2+、Fe2+和Mn2+濃度對菌體所產(chǎn)生的影響。

選取質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.2、0.4和0.6 g/L的MgSO4來分析不同濃度的Mg2+的影響，結(jié)果如圖6。

圖6 Mg2+質(zhì)量濃度對發(fā)酵產(chǎn)XDH的影響Fig.6 Effect of Mg2+ concentration on the production of XDH

由圖6可知，不同質(zhì)量濃度的Mg2+對發(fā)酵酶活和菌體生長量均有影響。其中，Mg2+從質(zhì)量濃度0.05 g/L繼續(xù)增加會導(dǎo)致發(fā)酵酶活降低，而添加0.05 g/L的Mg2+得到的菌體酶活與空白相比提高近10%。因此，選擇0.05 g/L MgSO4。

此后，又通過實驗分析研究了不同質(zhì)量濃度Fe2+的影響(圖7)。由圖7可以看出，F(xiàn)e2+對發(fā)酵酶活和菌體生長量都會有一定程度的影響，隨著Fe2+質(zhì)量濃度的逐漸增大，發(fā)酵酶活和菌體生長量的變化趨勢都是先提高后降低，兩者的峰值均出現(xiàn)在質(zhì)量濃度為0.01 g/L的點。因此，選擇最適的FeSO4質(zhì)量濃度為0.01 g/L。

圖7 Fe2+質(zhì)量濃度對發(fā)酵產(chǎn)XDH的影響Fig.7 Effect of Fe2+ concentration on the production of XDH

此外，本文同時研究了不同濃度的Mn2+對發(fā)酵酶活和菌體生長量的影響(圖8)。

從圖8可以看出，Mn2+對發(fā)酵酶活和菌體生長量有不同程度的影響。其中，隨著Mn2+質(zhì)量濃度的增大，菌體生長量曲線呈先增長后降低的趨勢，在0.02 g/L出現(xiàn)最高峰，而此處的發(fā)酵酶活遠遠低于0.01 g/L，所以選擇MnSO4的最適添加量為0.01 g/L。

圖8 Mn2+質(zhì)量濃度對發(fā)酵產(chǎn)XDH的影響Fig.8 Effect of Mg2+ concentration on the production of XDH

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)條件的影響

2.2.1 培養(yǎng)溫度

本文選取28、37和45 ℃這3個常見的發(fā)酵培養(yǎng)溫度進行實驗。對菌株XDH在不同溫度下的菌體生長量和所產(chǎn)4-木糖醇脫氫酶的酶活進行考察，分析發(fā)酵溫度的影響。結(jié)果如圖9。

圖9 培養(yǎng)溫度對發(fā)酵產(chǎn)XDH的影響Fig.9 Effect of fermentation temperature on the production of XDH

由圖9可知，3個常見培養(yǎng)溫度條件下，28 ℃的酶活和菌體生長量均為最高值，均遠高于37、45 ℃時，因此選擇28 ℃為最適發(fā)酵培養(yǎng)溫度。

2.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值

基礎(chǔ)培養(yǎng)基的初始pH值約為5，本實驗通過用NaOH溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH至指定值，探究了初始pH對發(fā)酵過程中菌體的生長量以及發(fā)酵酶活的影響，選擇了pH為5、6、7、8、9、10、11的7組發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后進行靜息細胞反應(yīng)測定酶活，同時測定菌體生長量，實驗結(jié)果如圖10。

圖10 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對發(fā)酵產(chǎn)XDH的影響Fig.10 Effect of initial pH of fermentation medium on the production of XDH

由圖10可知，隨著發(fā)酵液初始pH的增大，發(fā)酵細胞酶活和菌體生長量的趨勢近乎相同，先增加后迅速降低；堿性較強的環(huán)境中，發(fā)酵酶活和菌體生長量急劇下降，可能是強堿性環(huán)境嚴重影響了枯草芽孢桿菌的正常生長代謝。因此，選擇峰值處，即pH 8.0為最適發(fā)酵培養(yǎng)的初始pH。

2.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量

培養(yǎng)基的裝液量主要影響的是培養(yǎng)基中的溶氧量，裝液量越大，液體培養(yǎng)基中的氧氣含量越小，由于枯草芽孢桿菌是需氧型微生物，因此裝液量一定程度上會影響枯草芽孢桿菌的呼吸，從而影響生長代謝。本實驗選擇了裝液量10、20、30、40、50 mL進行比較，培養(yǎng)結(jié)束后進行靜息細胞反應(yīng)測定酶活，同時測定菌體生長量選擇最適裝液量，結(jié)果如圖11。

圖11 裝液量對發(fā)酵產(chǎn)XDH的影響Fig.11 Effect of work volume on the production of XDH

由圖11可知，首先，絕對酶活和菌體生長量分別都隨著裝液量的增大先增長后下降，絕對酶活在裝液量40 mL后開始出現(xiàn)下降的趨勢，而菌體生長量在20 mL后就開始下降，可能是液體溶氧量降低無法滿足枯草芽孢桿菌的增值。綜上，選擇裝液量40 mL為最適裝液量。

2.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基接種量

接種量主要影響微生物生長周期中的遲緩期的長短，適宜的接種量可以使發(fā)酵周期縮短，從而提高發(fā)酵產(chǎn)酶效率[24]。種子培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)12 h后，分別以裝液量體積的0.3、0.5、1、2、3、4、5和6 mL/30 mL的接種量接種進行發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后進行靜息細胞反應(yīng)測定酶活，同時測定菌體生長量選擇最適接種量，結(jié)果如圖12。

圖12 30 mL裝液體積下接種量對發(fā)酵產(chǎn)XDH的影響Fig.12 Effect of inoculation quantity on the production of XDH

由圖12可知，菌體生長量隨著接種量的增大先增加后減少；小于3 mL/30 mL時，相對菌體生長量隨著接種量的增大而緩慢增大；大于3 mL/30 mL時，隨著接種量的增大而減少。此外，發(fā)酵酶活隨著接種量的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，以接種量1 mL為基準，可以發(fā)現(xiàn)接種量為0.5 mL/30 mL時，酶活達到峰值；其中，接種量大于0.5 mL/30 mL時，酶活先呈現(xiàn)快速下降的趨勢，后趨于平緩。因此選擇接種量為0.5 mL/30 mL為最適接種量。

2.3 靜息細胞反應(yīng)條件的影響

2.3.1 底物質(zhì)量濃度

反應(yīng)體系底物為木糖醇，分別以甘氨酸-NaOH溶液配制質(zhì)量濃度為5、10、20、50和100 g/L的木糖醇溶液，加入菌體后，于37 ℃水浴3 h，再通過半胱氨酸咔唑酒精法測定產(chǎn)物L(fēng)-木酮糖的濃度，從而反映不同底物濃度條件下產(chǎn)物產(chǎn)量的差異，結(jié)果如圖13。

圖13 反應(yīng)底物濃度對木酮糖產(chǎn)量的影響Fig.13 Effect of substrate concentration on yield ofL-xylulose

反應(yīng)體系菌體含量均為1 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，即細胞含量基本相同，從圖13可以看出，隨著底物質(zhì)量濃度的增加，產(chǎn)物產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。底物質(zhì)量濃度小于30 g/L時，細胞與底物的結(jié)合逐漸飽和，產(chǎn)量呈現(xiàn)逐漸增長的趨勢；底物質(zhì)量濃度大于30 g/L時，細胞與底物的結(jié)合已經(jīng)飽和，產(chǎn)量降低。因此，選擇底物質(zhì)量濃度30 g/L為靜息細胞反應(yīng)的最適底物濃度。

2.3.2 反應(yīng)溫度

酶參與的催化反應(yīng)常常對反應(yīng)溫度非常敏感，溫度過高或過低會導(dǎo)致酶活顯著下降，甚至失活。取反應(yīng)溫度為25、30、35、37、40、45和50 ℃，水浴3 h后通過半胱氨酸咔唑酒精法測定產(chǎn)量，結(jié)果如圖14。

從圖14可以看出，溫度對L-木酮糖的生成有很大的影響。隨著溫度的升高，產(chǎn)量呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢。溫度低于45 ℃時，溫度升高，反應(yīng)速率加快，底物轉(zhuǎn)化量逐漸增大；而溫度高于45 ℃后，可能引起酶的部分變性，導(dǎo)致產(chǎn)量下降。綜上，選擇45 ℃為最適靜息細胞反應(yīng)溫度。

圖14 反應(yīng)溫度對木酮糖產(chǎn)量的影響Fig.14 Effect of reaction temperature on yield ofL-xylulose

2.3.3 緩沖溶液pH值

靜息細胞反應(yīng)過程中需要緩沖溶液來維持體系的pH值的穩(wěn)定性，本實驗選擇pH值為9.0、10.0、11.0的甘氨酸-NaOH緩沖溶液和pH為7.0、8.0、9.0的Tris-HCl緩沖溶液分別配制底物質(zhì)量濃度為20 g/L的反應(yīng)體系進行靜息細胞反應(yīng)，測定產(chǎn)物質(zhì)量濃度，結(jié)果如圖15。

圖15 反應(yīng)緩沖體系對產(chǎn)物產(chǎn)量的影響Fig.15 Effect of buffer system on yield of L-xylulose

由圖15可以看出，用Tris-HCl緩沖溶液所配制的反應(yīng)體系的L-木酮糖的產(chǎn)量都低于甘氨酸-NaOH緩沖溶液所配制的反應(yīng)體系的產(chǎn)量，其中緩沖溶液為pH為10.0的甘氨酸-NaOH緩沖溶液時，產(chǎn)物產(chǎn)量最高，pH低于或高于10.0都呈下降趨勢。因此，選擇pH為10.0的甘氨酸-NaOH緩沖溶液為最適反應(yīng)緩沖溶液。

3 結(jié)論

含Pantoeaananatis來源的4-木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒型枯草芽孢桿菌工程菌進行發(fā)酵的條件：最優(yōu)培養(yǎng)基配方(g/L)：蔗糖25，尿素6，MgSO40.05，MnSO40.01，F(xiàn)eSO40.01；最優(yōu)發(fā)酵條件：初始pH 8.0，裝液量為40 mL，接種量為1.67%，發(fā)酵溫度為28 ℃。通過靜息細胞反應(yīng)得到最優(yōu)的反應(yīng)條件：底物質(zhì)量濃度20 g/L，緩沖溶液為甘氨酸-NaOH溶液(pH 10.0)，反應(yīng)溫度為45 ℃。以上條件下得到的最終酶活為5.183 U/L，與LB培養(yǎng)基相比提高231.2%，轉(zhuǎn)化率達17.74%。先前報道的1株可氧化木糖醇轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-木酮糖的菌株ZN-14，利用該菌株的靜息細胞以木糖醇溶液(20 g/L，pH 9.0)為底物在37 ℃轉(zhuǎn)化24 h，轉(zhuǎn)化率達26.62%。

雖然本研究中枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化率不及巨大芽孢桿菌，但是這株枯草芽孢桿菌為食品級微生物，且在工業(yè)上應(yīng)用廣泛，且使用枯草芽孢桿菌靜息細胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-木酮糖未見相關(guān)研究。通過對重組枯草芽孢桿菌生產(chǎn)L-木酮糖發(fā)酵條件的優(yōu)化及靜息細胞轉(zhuǎn)化木糖醇工藝的研究，為更進一步研究生物轉(zhuǎn)化法制備L-木酮糖提供新材料，這對稀有糖的研究開發(fā)具有重要意義。和化學(xué)法合成L-木酮糖相比，靜息細胞轉(zhuǎn)化法成本低、方法簡單且沒有副產(chǎn)物的干擾，易于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，基于長遠考慮，生物轉(zhuǎn)化法是最具潛力的，也是L-木酮糖生產(chǎn)技術(shù)的主要研究方向。然而，關(guān)于這種稀有糖制備的研究報告并不多見，嚴重制約了這種稀有糖的研究與應(yīng)用，因此進一步提高L-木酮糖的產(chǎn)量是今后研究工作的方向。