彭昌梅,趙俊鶯,王艷

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電針復合七氟烷麻醉干預斷尾大鼠核c-fos蛋白表達的應激調控機制

彭昌梅1,趙俊鶯2,王艷3

(1.重慶開州光明骨科醫(yī)院,重慶 405400;2.西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院,西安 710077;3.重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院,重慶 400010)

分析電針復合七氟烷麻醉干預斷尾大鼠核c-fos蛋白表達的應激調控機制,為臨床患者診療提供一些實驗室依據(jù)。50只SPF級Wistar雄性大鼠,隨機分為麻醉組、針刺組、觀察組、對照組與正常組,每組10只。除正常組外,其他各組大鼠制備急性應激模型,麻醉組和觀察組大鼠行七氟烷麻醉,針刺組和觀察組大鼠行電針治療,對照組和正常組大鼠不進行任何干預。采用ELISA法檢測血清皮質酮(CORT)、促腎上腺皮質激素(ACTH)含量,Western blot檢測大鼠下丘腦c-fos蛋白表達狀況,流式細胞分析儀檢測外周血T淋巴細胞亞群含量。與正常組比較,對照組大鼠血清CORT、ACTH含量和c-fos蛋白表達上升(＜0.05);與對照組比較,針刺組、麻醉組及觀察組大鼠CORT、ACTH含量和c-fos蛋白表達下降(＜0.05);與針刺組、麻醉組比較,觀察組大鼠血清CORT、ACTH含量和c-fos蛋白表達下降(＜0.05)。與正常組比較,對照組大鼠血清CD3﹢、CD4﹢、CD8﹢及CD4﹢/CD8﹢含量下降(＜0.05);與對照組比較,針刺組和觀察組大鼠血清CD3﹢、CD4﹢、CD8﹢及CD4﹢/CD8﹢含量上升(＜0.05)。電針復合七氟烷麻醉可顯著改善斷尾大鼠機體應激狀況,降低核c-fos蛋白分泌和血清ACTH、CORT含量,提升大鼠機體免疫功能。

針刺療法;電針;應激;c-fos蛋白;大鼠

應激為機體對于不同刺激所形成的非特異性反應,一般經過下丘腦-垂體-腎上腺皮質(HPA)軸所產生應激激素來適應并調節(jié)應激反應[1-2]。血清皮質酮(CORT)與促腎上腺皮質激素(ACTH)含量為HPA調控應激反應的主要外周指標,而中樞調控應激敏感因子為c-fos蛋白。全身麻醉結合電針能夠使肺切除患者在圍手術期內應激反應下降,頸叢阻滯結合電針也可以使甲狀腺患者在圍手術期內應激反應下降[3-4]。因此,本研究經過分析電針復合七氟烷麻醉對斷尾大鼠核c-fos蛋白分泌及應激調控機制,為臨床患者診療提供一些實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗大鼠

SPF級Wistar雄性大鼠50只,6周齡,購自成都達碩實驗動物有限公司,許可證號為[SCXK(川):2018- 23],體質量90～120 g,平均(113.51±12.39)g。常規(guī)飼養(yǎng)1周后開始實驗,大鼠分籠飼養(yǎng),每個籠內5只,室溫維持在22℃～26℃,相對濕度在55%～65%,晝夜循環(huán),保持12 h光照,大鼠添加飼料及換水等都由專人進行。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑

SAB試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司), CORT、ACTH試劑盒(華美Cusabio公司),鼠抗b-actin (北京中杉金橋公司生產,1:1000),兔抗人多克隆c-fos抗體(美國Santa Cruz公司,1:1000),DAB(美國Sigma公司),山羊抗兔辣根標記二抗(美國Sigma公司, 1:5000)、山羊抗小鼠辣根標記二抗(美國Sigma公司, 1:5000)。

1.2.2 主要儀器

IPP6.0凝膠成像系統(tǒng)、麻醉氣體監(jiān)護儀(美國Datex-Ohmeda公司),華佗牌電子診療儀(蘇州醫(yī)療用品廠,型號SDZ-Ⅱ),ALC-V8動物呼吸機(上海奧爾特生物公司),七氟烷揮發(fā)罐、Bio-Rad電轉膜儀及Bio- Rad蛋白電泳系統(tǒng)(美國Datex-Ohmeda公司)。

1.3 動物分組

采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為麻醉組(10只)、針刺組(10只)、觀察組(10只)、對照組(10只)與正常組(10只)。

1.4 模型制備

除正常組外,其他各組大鼠依據(jù)Xu B等[5]方法使用低位尾干切斷(ICTR)法制備急性應激模型,大鼠固定后,橫切尾端尾干部位(即S3與S4脊髓神經間)。

1.5 干預方法

依據(jù)Lee HT等[6]實驗方法,麻醉組和觀察組大鼠通入七氟烷(體積分數(shù)為2%)。大鼠置入玻璃麻醉箱內,石灰鋪滿箱底,七氟烷使用Ohmeda揮發(fā)罐給予麻醉誘導與麻醉維持,氣管導管接至Datex麻醉氣體監(jiān)護儀上,對呼氣末七氟烷含量監(jiān)測,玻璃箱內保持七氟烷含量在2%。同時對針刺組和觀察組大鼠行電針,在大鼠翻正反射消失以后,快速從麻醉箱內取出,電針連接后再放入麻醉箱內。依據(jù)《實驗針灸學》[7]選取足三里所對應后三里,在膝關節(jié)外側的腓骨小頭下緣5 mm位置脛腓骨之間,直刺7 mm,行疏密波,參數(shù)為3 Hz、3 V、 2 ms,電針刺激每30 min進行1次,間隔30 min進行,共行4次。對照組和正常組大鼠不進行任何干預。大鼠在末次刺激后斷頸處死,取外周血6 mL,同時取下丘腦組織保存于液氮內。

1.6 觀察指標

1.6.1 血清CORT、ACTH含量

各組大鼠外周血加入到抗凝管內,室溫放置2 h, 4000 r/min離心10 min后取上清液,ELISA法檢測血清CORT、ACTH含量,標準品稀釋后加入至酶標板標準品孔內,樣品加入到樣品孔內,每個孔內10mL,膠紙將反應孔封住,37℃下孵育2 h,洗板5次,再加入10mL生物素化抗體工作液,37℃下孵育1 h,洗板5次,加入10mL酶結合物工作液,37℃下避光孵育30 min,洗板5次,每孔加入10mL顯色液,37℃下避光孵育20 min,最后加入終止液,混勻后檢測OD450數(shù)值,標準品濃度當做橫坐標,OD數(shù)值當做縱坐標,繪制標準曲線,依據(jù)樣品OD數(shù)值于標準曲線內查看其濃度。

1.6.2 大鼠下丘腦c-fos蛋白表達

采用Western blot檢測,下丘腦加入比例為5mg/mL組織裂解液,勻漿以后離心機13000 r/min離心后選取上清液檢測其總蛋白含量。選取蛋白質40mg,加熱變性,蛋白采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,凝膠內蛋白質采用電轉膜儀至聚二偏氟乙烯膜內,Tris緩沖液(含有0.1%Tween-20及10%脫脂奶粉)封閉1 h,而后行免疫雜交反應。兔來源c-fos抗體1:1000加入,在4℃下孵育過夜。Tris緩沖液洗滌以后將羊抗兔二抗加入,滴度是1:5000,在室溫下孵育78 min。Tris緩沖液洗滌,暗室下降增強化學發(fā)光劑加入,壓X線片。Western雜交膜將c-fos條帶顯示以后,PVDF膜使用Tris緩沖液洗滌30 min,b-actin條帶使用同樣方法顯示,當做加樣內參照。X線片內條帶在經過凝膠成像系統(tǒng)將灰度值讀取,定量。c-fos/b-actin條帶灰度數(shù)值對上樣量偏差進行糾正, c-fos蛋白含量使用灰度比值表示。

1.6.3 T淋巴細胞亞群(CD3﹢、CD4﹢、CD8﹢)含量

取大鼠外周血5 mL,抗凝后加入對應熒光MoAb 10mL,避光放置20 min。再加入2 mL裂解液,搖勻后避光放置10 min,紅細胞全部裂解后離心機1200 r/min離心6 min,PBS洗滌3次后采用流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群(CD3﹢、CD4﹢、CD8﹢)含量。

1.7 統(tǒng)計學方法

使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示,組間比較采用獨立樣本檢驗。以＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清CORT、ACTH含量比較

與正常組比較,對照組大鼠血清CORT、ACTH含量上升(＜0.05);與對照組比較,針刺組、麻醉組及觀察組大鼠CORT、ACTH含量下降(＜0.05);與針刺組、麻醉組比較,觀察組大鼠血清COPR、ACTH含量下降(＜0.05)。詳見圖1。

注:與正常組比較1)P＜0.05;與對照組比較2)P＜0.05;與麻醉組比較3)P＜0.05;與針刺組比較4)P＜0.05

2.2 各組大鼠下丘腦c-fos蛋白表達比較

與正常組比較,對照組大鼠下丘腦c-fos蛋白表達上升(＜0.05);與對照組比較,針刺組、麻醉組及觀察組大鼠下丘腦c-fos蛋白表達下降(＜0.05);與針刺組、麻醉組比較,觀察組大鼠下丘腦c-fos蛋白表達下降(＜0.05)。詳見圖2-3。

圖2 各組大鼠下丘腦c-fos蛋白表達比較

注:與正常組比較1)P＜0.05;與對照組比較2)P＜0.05;與麻醉組比較3)P＜0.05;與針刺組比較4)P＜0.05

2.3 各組大鼠外周血清T淋巴細胞亞群含量比較

與正常組比較,對照組大鼠血清CD3﹢、CD4﹢、CD8﹢及CD4﹢/CD8﹢含量下降(＜0.05);與對照組比較,針刺組和觀察組大鼠血清CD3﹢、CD4﹢、CD8﹢及CD4﹢/CD8﹢含量上升(＜0.05)。詳見圖4。

注:與正常組比較1)P＜0.05;與對照組比較2)P＜0.05

3 討論

急性應激一方面經過交感神經興奮,釋放兒茶酚胺類物質,可造成外周血內血糖、CORT及ACTH等快速上升,另一方面可經過傷害性感受器刺激各種炎性介質釋放,如P物質、組胺、緩激肽及前淚腺激素等,同時激活多種體液級聯(lián)系統(tǒng),抑制或者阻礙上述通路就可有效降低其應激強度。臨床一般將機體神經元興奮標志視為c-fos蛋白表達狀況,若機體處于非應激狀況,其腦部c-fos蛋白的表達含量非常低[8-9]。張云東等[10]研究顯示,機體受到創(chuàng)傷前期應激狀況下下丘腦內c-fos表達量迅速升高,而促腎上腺素釋放激素(CRH)表達則比c-fos表達略慢,這說明在機體創(chuàng)傷以后應激反應下其下丘腦內前期c-fos表達對CRH基因表達有激活影響。相關研究顯示,傳入急性疼痛應激以后,下丘腦室旁核的c-fos mRNA轉錄被激活,c-fos蛋白表達,導致下丘腦釋放大量CRH到垂體內并進入血中,進而使HPA軸啟動[11-14]。

本研究顯示,觀察組和對照組大鼠進行斷尾急性刺激以后,其血清內CORT、ACTH含量快速上升,同時下丘腦內c-fos表達量也上升,說明急性應激模型成功制備,而后對觀察組大鼠行七氟烷吸入聯(lián)合電針刺激,其下丘腦內c-fos表達量下降,其作用機制可能為電針結合七氟烷可降低大鼠下丘腦內激活c-fos神經元,那么轉錄形成CRH數(shù)量也同樣降低。HPA軸被CRH激活后所釋放到血清內ACTH含量下降,腎上腺皮質受ACTH刺激所形成的CORT含量也隨之下降,交感神經興奮通路抑制和傷害性感受器刺激各種炎性介質釋放數(shù)量降低,從而起到降低應激強度作用,患者應激狀況得以調節(jié)。相關研究顯示,對神門、百會等穴位行電針刺激可使血清內ACTH、CORT含量降低,其影響原理可能和電針對HPA軸功能調節(jié)有聯(lián)系,另外,臨床神經外科手術中采用電針復合七氟烷麻醉也證明了其對患者術后前期恢復與鎮(zhèn)痛效果理想[15-16]。本研究顯示,觀察組大鼠在進行電針和七氟烷麻醉影響后,其血清內CORT、ACTH含量明顯降低,說明七氟烷吸入麻醉結合電針調控應激影響有效,同時觀察組大鼠下丘腦組織內c-fos表達量下降也驗證了HPA軸受下丘腦調控作用和c-fos表達量降低有緊密聯(lián)系。交感腎上腺素受興奮迷走膽堿能神經纖維抑制,對激素含量改變有調整影響;同時還能夠將鎮(zhèn)痛機制激活,痛覺信號傳遞受到抑制,進而起到鎮(zhèn)痛影響,使患者疼痛所誘發(fā)應激反應下降[17-19]。機體應激狀態(tài)可經過體液系統(tǒng)、神經系統(tǒng)改變并影響機體免疫系統(tǒng)識別力,降低免疫功能。Keller T等[20]利用強度電刺激當做應激因子,發(fā)現(xiàn)應激可降低外周血內淋巴細胞數(shù)目,血清內淋巴細胞轉化受到抑制,其抑制效應和應激強度成正比。T淋巴細胞為機體免疫功能最重要免疫細胞,其中CD3﹢反映了總T淋巴細胞水平,而CD4﹢、CD8﹢和CD4﹢/CD8﹢在一定程度內可表示輔助性T淋巴細胞和抑制性T淋巴細胞及其比值。本文研究顯示,與正常組比較,對照組大鼠血清CD3﹢、CD4﹢、CD8﹢及CD4﹢/CD8﹢含量下降;與對照組比較,針刺組和觀察組大鼠血清CD3﹢、CD4﹢、CD8﹢及CD4﹢/CD8﹢含量上升,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.05),說明在應激狀態(tài)下大鼠免疫功能受到抑制,而針刺可有效改善大鼠因應激所造成免疫功能抑制。

綜上所述,電針復合七氟烷麻醉可顯著改善斷尾大鼠機體應激狀況,降低核c-fos蛋白分泌和血清ACTH、CORT含量,提升大鼠機體免疫功能。

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Stress-regulation Mechanism of Electroacupuncture plus Sevoflurane Anesthesia via Intervening Nuclear C-fos Protein Expression in Caudal Resection Rats

-1,-2,3.

1.,405400,; 2.’,’710077,; 3.,400010,

To analyze the stress-regulation mechanism of electroacupuncture plus sevoflurane anesthesia via intervening nuclear C-fos protein expression in caudal resection rats, and to provide laboratory evidence for the diagnosis and treatment in clinical practice.Fifty SPF-grade male Wistar rats were randomized into an anesthesia group, an acupuncture group, an observation group, a control group and a normal group, with 10 rats in each group. The rats were established into acute stress models except those in the normal group. Rats in the anesthesia group and observation group received sevoflurane anesthesia, the acupuncture group and observation group received electroacupuncture, and the control and normal groups did not receive any intervention. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the contents of corticosterone (CORT) and adrenocorticotropic hormone (ACTH) in serum; Western blot was adopted to examine the protein expression of C-fos in hypothalamus; flow cytometry apparatus was used to detect the T-lymphocyte subsets in peripheral blood.Compared with the normal group, the contents of CORT and ACTH in rat’s serum and the protein expression of C-fos increased in the control group (＜0.05); compared with the control group, the contents of CORT and ACTH and the protein expression of C-fos in the acupuncture group, anesthesia group and observation group decreased (＜0.05); compared with the acupuncture and anesthesia groups, the contents of CORT and ACTH in rat’s serum and the protein expression of C-fos declined in the observation group (＜0.05). Compared with the normal group, the contents of CD3﹢, CD4﹢, CD8﹢and CD4﹢/CD8﹢in serum declined in the control group (＜0.05); compared with the control group, the contents of serum CD3﹢, CD4﹢, CD8﹢and CD4﹢/CD8﹢increased in the acupuncture and observation groups (＜0.05).Electroacupunc- ture plus sevoflurane can significantly improve the stress state in caudal resection rats, down-regulate the secretion of nuclear C-fos protein and the contents of serum ACTH and CORT, and enhance the rat’s immune function.

Acupuncture therapy; Electroacupuncture; Stress; C-fos protein; Rats

1005-0957(2019)05-0560-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2019.05.0560

2018-12-29

彭昌梅(1978—)女,主治醫(yī)師,Email:seainglong23@163.com