陸海濤，李雪飛，劉利君，何磊，段昕所

黑色素瘤病因不明，已成為發(fā)病率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤，具有高度的轉(zhuǎn)移性和侵襲力，且預(yù)后差［1-2］。順鉑是治療多種腫瘤的一線用藥，但腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性可明顯削弱其療效［3］。腫瘤的基因治療越來(lái)越受到關(guān)注，已經(jīng)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。有研究表明，T-鈣黏蛋白可抑制黑色素瘤的增殖和侵襲力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡［4-5］。另有研究認(rèn)為，上調(diào)腫瘤的某些鈣黏蛋白分子表達(dá)可提高腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒性藥物的敏感性［6］。T-鈣黏蛋白能否逆轉(zhuǎn)耐藥黑色素瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，尚鮮見相關(guān)報(bào)道。本研究擬建立對(duì)順鉑耐藥的黑色素瘤細(xì)胞株（CDDP-R B16F10），并轉(zhuǎn)染T-鈣黏蛋白基因獲得穩(wěn)定表達(dá)T-鈣黏蛋白的黑色素瘤順鉑耐藥株，觀察T-鈣黏蛋白聯(lián)合順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響。

1 資料與方法

1.1 主要試劑與儀器 黑色素瘤B16F10細(xì)胞株由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部提供。Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞外基質(zhì)膠（extracellular matrix gel）和順鉑購(gòu)自Sigma 公司。T-鈣黏蛋白一抗購(gòu)自Santa Cruz公司。T-鈣黏蛋白二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。 pEGFP-N1、脂質(zhì)體2000（LipofectamineTM2000）和 TRIzol 購(gòu)自 Invitrogen 公司。AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq 酶購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。孔徑為8μm的transwell小室購(gòu)自Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 黑色素瘤B16F10順鉑耐藥細(xì)胞株（CDDP-R B16F10）的建立及增殖能力測(cè)定 （1）細(xì)胞培養(yǎng)。B16F10 細(xì)胞株在37 ℃、5%CO2及10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)，采用大劑量沖擊和逐步增加劑量相結(jié)合的方法誘導(dǎo)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期B16F10 細(xì)胞，1 mg/L 順鉑作用24 h 后換為正常RPMI-1640 培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)后再加藥，如此反復(fù)誘導(dǎo)、換液，最終使B16F10細(xì)胞能夠在含有1 mg/L順鉑的培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)。再依次加入含有2、4 mg/L 順鉑的RPMI-1640培養(yǎng)基，重復(fù)上述步驟，最終使得B16F10細(xì)胞能夠在含有 4 mg/L 順鉑的 RPMI-1640 培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)。（2）MTT 法檢測(cè)CDDP-R B16F10 的增殖能力。取前述培養(yǎng)后細(xì)胞，分為CDDP-R B16F10細(xì)胞組和B16F10組（未發(fā)生順鉑耐藥）。細(xì)胞以2×105/mL 的密度接種于96 孔板，每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液。采用MTT 法，每日各組測(cè)定5 個(gè)孔的光密度（OD）值，連續(xù)4 d后繪制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.2.2 T-鈣黏蛋白基因轉(zhuǎn)染CDDP-R B16F10及篩選 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，應(yīng)用LipofectamineTM2000 將pEGFP-N1 空載體及本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的T-鈣黏蛋白真核表達(dá)載體pEGFPN1-T-cadherin 轉(zhuǎn)染 CDDP-R B16F10 細(xì)胞［7］。pEGFP-N1 質(zhì)粒攜帶G418抗性基因，上述細(xì)胞培養(yǎng)48 h后加入G418，使其藥物濃度為800 mg/L，進(jìn)行篩選，2周后獲得可穩(wěn)定表達(dá)T-鈣黏蛋白的CDDP-R B16F10細(xì)胞。采用有限稀釋法挑選轉(zhuǎn)染成功的單個(gè)細(xì)胞，反復(fù)篩選和傳代，挑選在抗性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好的細(xì)胞。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測(cè)轉(zhuǎn)染后T-鈣黏蛋白mRNA 的表達(dá) 按照Trizol 試劑說(shuō)明書抽提細(xì)胞總RNA，檢測(cè)RNA濃度及純度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后行PCR反應(yīng)。PCR 反應(yīng)體系為50 μL：5 μL 10×Reaction Buffer，上、下游引物（10 μmol/L）各 1 μL，2 μL 模板 cDNA，4 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.5μL Taq Plus，36.5 μL雙蒸水。引物序列見表1。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 45 s，34 個(gè)循環(huán)；最后 72 ℃ 5 min。PCR 的產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠（含0.5μg/mL溴化乙錠），70 V，電泳2 h，凝膠成像系統(tǒng)照相，進(jìn)行分析。

Tab.1 Primer sequence of each purpose gene表1 各自的基因引物序列

1.2.4 免疫組化SP法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后T-鈣黏蛋白的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞，胰酶消化，稀釋成濃度1.5×105/mL。將細(xì)胞懸液滴加至載玻片，每孔0.2 mL，放置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，甲醇固定。3%過(guò)氧化氫去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，胎牛血清封閉非特異性抗原，一抗4 ℃過(guò)夜，二抗37 ℃1 h，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，自來(lái)水沖水返藍(lán)，中性樹脂封片，拍照觀察T-鈣黏蛋白的表達(dá)情況，在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色視為T-鈣黏蛋白陽(yáng)性。

1.2.5 Wound-healing 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的遷移情況 腫瘤細(xì)胞接種到6 孔板，每孔的培養(yǎng)體積為3 mL，細(xì)胞密度約5×105/mL，5%CO2、37 ℃、飽和濕度條件下孵育12 h。用200μL 移液器在已經(jīng)鋪滿的單層細(xì)胞上劃痕，PBS 清洗3次，洗掉漂浮的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為6組。（1）空白對(duì)照組（CDDPR B16F10細(xì)胞）。（2）pEGFP-N1組，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1空載體。（3）pEGFP-N1-T-cadherin組，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-T-cadherin。（4）順鉑組，培養(yǎng)基加入順鉑，終濃度4 mg/L。（5）pEGFP-N1聯(lián)合順鉑組，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1 空載體，并加入順鉑，終濃度4 mg/L。（6）pEGFP-N1-T-cadherin 聯(lián)合順鉑組，轉(zhuǎn)染pEGFPN1-T-cadherin，并加入順鉑，終濃度4 mg/L。在培養(yǎng)0 h、24 h拍照，計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞侵襲力 實(shí)驗(yàn)分組同1.2.5。參照文獻(xiàn)［8］，調(diào)整細(xì)胞密度至2×105/mL，取200 μL加入上室，空白對(duì)照組、pEGFP-N1組和pEGFP-N1-T-cadherin組的上室為無(wú)血清RPMI-1640 培養(yǎng)基，順鉑組、pEGFP-N1聯(lián)合順鉑組和pEGFP-N1-T-cadherin聯(lián)合順鉑組上室為含4 mg/L順鉑的無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基。6組的下室均加入600μL 含30%血清的培養(yǎng)基。24 h 后取出小室，PBS 洗2遍，棉簽擦去ECM 膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，100%甲醇固定15 min，蘇木素染色，顯微鏡下觀察，隨機(jī)抽取5 個(gè)視野計(jì)數(shù)，取每組的平均值表示腫瘤細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，析因分析確定各因素的單獨(dú)效應(yīng)及有無(wú)交互作用。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黑色素瘤順鉑耐藥細(xì)胞株（CDDP-R B16F10）培養(yǎng)結(jié)果 成功建立黑色素瘤順鉑耐藥細(xì)胞株。MTT法結(jié)果顯示，在不含有順鉑的培養(yǎng)液中，CDDPR B16F10組和B16F10組的生長(zhǎng)趨勢(shì)相近，見圖1。

Fig.1 Proliferative ability of CDDP-R B16F10圖1 CDDP-R B16F10的增殖能力

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染24 h 后，pEGFP-N1-T-cadherin 和pEGFP-N1 空載體的轉(zhuǎn)染效率分別為（31.02±2.83）%和（35.62±3.35）%,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.35，P＞0.05），見圖2。

2.3 轉(zhuǎn)染后T-鈣黏蛋白mRNA 的RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果 轉(zhuǎn)染 pEGFP-N1 -T-cadherin 的 CDDP-R B16F10 細(xì)胞擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中呈明顯條帶，其大小為208 bp，內(nèi)參對(duì)照β-actin 片段大小為435 bp，證實(shí)T-鈣黏蛋白成功轉(zhuǎn)染于腫瘤細(xì)胞，見圖3。

2.4 轉(zhuǎn)染后T-鈣黏蛋白的免疫組化SP 法檢測(cè)結(jié)果 轉(zhuǎn)染 pEGFP-N1-T-cadherin 的 CDDP-R B16F10 細(xì)胞的T-鈣黏蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)。未轉(zhuǎn)染的CDDP-R B16F10 細(xì)胞、轉(zhuǎn)染 pEGFP-N1 空載體的CDDP-R B16F10細(xì)胞T-鈣黏蛋白的表達(dá)均呈陰性，見圖4。

Fig.2 The expression of green fluorescence in cells under fluorescence microscope圖2 熒光顯微鏡下細(xì)胞內(nèi)綠色熒光的表達(dá)情況

Fig.3 The expression of T-cadherin mRNA圖3 T-鈣黏蛋白mRNA的表達(dá)情況

2.5 Wound-healing 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞遷移情況 T-鈣黏蛋白可抑制黑色素瘤細(xì)胞及其順鉑耐藥細(xì)胞遷移（P＜0.05）。T-鈣黏蛋白與順鉑聯(lián)合對(duì)耐藥細(xì)胞遷移的抑制有交互作用（P＜0.05），見圖5、表1。

2.6 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力 T-鈣黏蛋白可抑制黑色素瘤細(xì)胞及其順鉑耐藥細(xì)胞的侵襲力（P＜0.05）。T-鈣黏蛋白與順鉑聯(lián)合對(duì)耐藥細(xì)胞侵襲力的抑制有交互作用（P＜0.05），見圖6、表1。

3 討論

侵襲轉(zhuǎn)移是腫瘤脫離原發(fā)灶，到達(dá)遠(yuǎn)處繼續(xù)生長(zhǎng)，并形成轉(zhuǎn)移灶的過(guò)程，是影響腫瘤患者預(yù)后的重要因素。鈣黏蛋白的表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間黏附功能喪失，使細(xì)胞易脫落，從而造成腫瘤的轉(zhuǎn)移，因此，其在多種腫瘤的增殖、遷移過(guò)程中起重要的作用。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)某些鈣黏蛋白分子可提高腫瘤對(duì)細(xì)胞毒性藥物的敏感性［9-10］。T-鈣黏蛋白屬于鈣黏蛋白超家族。目前，相關(guān)研究已經(jīng)在人類乳腺癌［11］、肺癌［12］等多種惡性腫瘤中檢測(cè)到T-鈣黏蛋白的表達(dá)異常。有研究表明，T-鈣黏蛋白在黑色素瘤中的表達(dá)缺失可阻礙腫瘤細(xì)胞的凋亡［13］。T-鈣黏蛋白可通過(guò)抑制β1整合素來(lái)降低腫瘤的侵襲性［14］。因此，T-鈣黏蛋白被認(rèn)為是一種抑癌基因。順鉑為細(xì)胞周期非特異性細(xì)胞毒性藥物，作為傳統(tǒng)的腫瘤化療藥物，已經(jīng)在多種腫瘤治療中出現(xiàn)耐藥性。耐藥是一個(gè)多因素參與、多基因作用的復(fù)雜過(guò)程，如藥物去活作用增強(qiáng)，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)藥物的減少［15］，DNA損傷修復(fù)［16］和凋亡通路以及一些間接信號(hào)通路的變化等。

Tab.1 The effects of T-cadherin combined with cisplatin on migration and invasion of CDDP-R B16F10表1 T-鈣黏蛋白聯(lián)合順鉑對(duì)CDDP-R B16F10遷移和侵襲力的影響 （n=3，±s）

Tab.1 The effects of T-cadherin combined with cisplatin on migration and invasion of CDDP-R B16F10表1 T-鈣黏蛋白聯(lián)合順鉑對(duì)CDDP-R B16F10遷移和侵襲力的影響 （n=3，±s）

＊P＜0.05；a 與 pEGFP-N1-T-cadherin組比較，b 與 pEGFP-N1-T-cadherin聯(lián)合順鉑組比較，P＜0.05

組別空白對(duì)照組pEGFP-N1組pEGFP-N1-T-cadherin組順鉑組pEGFP-N1聯(lián)合順鉑組pEGFP-N1-T-cadherin聯(lián)合順鉑組F基因轉(zhuǎn)染F順鉑F交互細(xì)胞遷移率（%）67.90±1.54ab 68.33±1.96ab 51.87±1.56b 67.97±1.21ab 68.43±0.59ab 20.60±1.18 1 034.589＊245.416＊249.377＊穿膜細(xì)胞數(shù)（個(gè)/視野）23.67±1.53ab 24.00±1.73ab 12.67±0.50b 23.33±2.52ab 23.00±2.65ab 4.33±0.58 139.655＊14.500＊9.172＊

本研究成功建立黑色素瘤順鉑耐藥株CDDP-R B16F10。將構(gòu)建的pEGFP-N1-T-cadherin 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CDDP-R B16F10 后結(jié)果顯示，pEGFP-N1-T-cadherin 聯(lián)合順鉑組細(xì)胞遷移率及穿膜細(xì)胞數(shù)均低于其他組，且T-鈣黏蛋白與順鉑聯(lián)合對(duì)CDDP-R B16F10的遷移與侵襲力的抑制均有正交互作用，表明T-鈣黏蛋白聯(lián)合順鉑可抑制CDDP-R B16F10 的遷移和侵襲能力，T-鈣黏蛋白與順鉑聯(lián)合有協(xié)同抗腫瘤作用，考慮可能原因?yàn)門-鈣黏蛋白在腫瘤細(xì)胞重新表達(dá)，恢復(fù)了細(xì)胞間的黏附作用，也可能通過(guò)T-鈣黏蛋白的信號(hào)傳遞功能［13］，最終降低了CDDPR B16F10的侵襲能力。

另外，有研究顯示PI3K/AKT信號(hào)通路可以通過(guò)補(bǔ)償順鉑引發(fā)的致死信號(hào)，從而導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生［17］。作為一種腫瘤抑制因子，T-鈣黏蛋白可拮抗PI3K/AKT 信號(hào)通路［13］。筆者將 T-鈣黏蛋白轉(zhuǎn)染CDDP-R B16F10 后，可能阻斷了上述補(bǔ)償通路，從而恢復(fù)了順鉑對(duì)CDDP-R B16F10 遷移及侵襲力的抑制作用。這為腫瘤的聯(lián)合治療及解決腫瘤化療中耐藥性的問(wèn)題提供了思路。T-鈣黏蛋白逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性的機(jī)制，以及T-鈣黏蛋白聯(lián)合順鉑后所表現(xiàn)出的協(xié)同抗腫瘤的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究和證實(shí)。此外，T-鈣黏素主要介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞間黏附，其表達(dá)定位于胞漿和胞核，出現(xiàn)胞核的易位可以作為日后研究的方向；過(guò)表達(dá)T-鈣黏素后，可觀察腫瘤細(xì)胞間連接通訊情況以及細(xì)胞內(nèi)藥物檢測(cè)；另外耐藥株過(guò)表達(dá)T-鈣黏素后抑制遷移和侵襲，可通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞增殖和凋亡以及藥物敏感情況加以驗(yàn)證，這些均可以作為研究的方向。

Fig.4 The expression of T-cadherin protein(immumohistochemical staining,×400)圖4 T-鈣黏蛋白的表達(dá)情況（免疫組化染色，×400）

Fig.5 The effect of T-cadherin combined with cisplatin on migration of CDDP-R B16F10(×100)圖5 -鈣黏蛋白聯(lián)合順鉑對(duì)CDDP-R B16F10遷移的影響（×100）

Fig.6 The effect of T-cadherin combined with cisplatin on invasion of CDDP-R B16F10(hematoxylin staining,×200)圖6 T-鈣黏蛋白聯(lián)合順鉑對(duì)CDDP-R B16F10侵襲力的影響（蘇木素染色，×200）