李敏敏，李寬,2，孫昕,2，吳琦,2，陳懷永,2△

氣道上皮黏膜由多種細(xì)胞組成，豐度較高的細(xì)胞群主要包括纖毛細(xì)胞和Club細(xì)胞（也稱Clara細(xì)胞或氣道祖細(xì)胞）。纖毛細(xì)胞特異性表達(dá)乙酰化微管蛋白（Acylated tubulin，Act）和叉頭框轉(zhuǎn)錄因子 J1（Forkhead box J1，F(xiàn)oxJ1），負(fù)責(zé)清除吸入的顆粒物。Club 細(xì)胞特異性表達(dá)Clara 細(xì)胞分泌蛋白（Clara cell secretory protein，CCSP），此外還分泌多種抗菌物質(zhì)。氣道上皮細(xì)胞彼此緊密連接形成肺與外界重要的保護(hù)屏障。氣道上皮黏膜的異常與慢性阻塞性肺疾病（COPD）和支氣管哮喘等多種肺部疾病相關(guān)［1-2］。COPD 患者氣道上皮黏膜顯著增厚，導(dǎo)致氣道狹窄和氣流受限；而支氣管哮喘氣道上皮黏膜明顯破損，與氣道慢性炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)［3］。因此，及時(shí)而有效地修復(fù)氣道上皮黏膜損傷對(duì)于肺穩(wěn)態(tài)的維持至關(guān)重要。研究表明，氣道上皮黏膜存在干細(xì)胞vClub細(xì)胞，其具有分化成Club細(xì)胞的潛能。而Club細(xì)胞也可分化成纖毛細(xì)胞和杯狀細(xì)胞［4］。杯狀細(xì)胞特異性表達(dá)氯化物通道鈣活化家族成員3（Chloride channel accessory 3，Clca3）和叉頭框轉(zhuǎn)錄因子a3（Forkhead box a3，F(xiàn)oxa3），分泌多種黏液蛋白。在正常情況下，氣道上皮黏膜杯狀細(xì)胞豐度較低，但是在支氣管哮喘等肺損傷中豐度增加，是氣道黏液增加的主要因素。mTOR信號(hào)通路在支氣管哮喘中發(fā)揮重要作用［5］，有研究表明，mTOR 通過(guò)下游分子核糖體蛋白S6 激酶 1（S6K1）促進(jìn)細(xì)胞生存［6］。而S6K1是否調(diào)控氣道上皮干/祖細(xì)胞的再生功能目前尚鮮見(jiàn)研究。本研究采用類器官培養(yǎng)模型研究S6K1 特異性抑制劑 PF-4708671 對(duì)小鼠 vClub 和Club細(xì)胞增殖與分化功能的影響，明確S6K1信號(hào)通路對(duì)氣道上皮再生的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料 選取健康C57BL/6小鼠10只，8～12周齡，體質(zhì)量25 g 左右，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，飼養(yǎng)于天津市海河醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［許可證號(hào)：SYXK（津）2016-0002］。熒光定量 PCR 儀（Light Cycler 96，Roche），酶標(biāo)儀（Multiskan Go，Thermo），倒置顯微鏡（Olympus 公司），Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TIANGEN 生物公司，3D 培養(yǎng)小室購(gòu)自 Corning 公司，SYBR Green PCR 擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自Roche 公司，流式抗體CD24-PE、EpCAM-PECyanine、Sca1-APC、CD31-Biotin、CD34-Biotin、CD45-Biotin、Streptavidin APC-eFluor780抗體和7-AAD均購(gòu)自eBioscience 公司，PF-4708671 購(gòu)自 Sigma 公司。彈性蛋白酶購(gòu)自Worthington公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠氣道干/祖細(xì)胞分離與鑒定 用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉C57BL/6小鼠，收集小鼠肺組織，從氣管注入彈性蛋白酶進(jìn)行消化，切碎肺組織，獲得肺單細(xì)胞懸液。離心后用預(yù)冷的漢克平衡鹽溶液（Hank's balanced salt solution，HBSS）重懸細(xì)胞，加入熒光標(biāo)記的抗體CD24、EpCAM、Sca-1、CD31、CD34 和 CD45 冰上孵育后，利用流式細(xì)胞儀鑒定。vClub 細(xì)胞分子表型特征為CD31-CD34-CD45-EpCAM+CD24+Sca-1-，Club細(xì)胞為CD31-CD34-CD45-EpCAM+CD24+Sca-1+，后者表達(dá)Sca-1，而前者不表達(dá)。

1.2.2 類器官培養(yǎng)模型的建立 將分選出來(lái)的氣道干/祖細(xì)胞和小鼠肺成纖維細(xì)胞（MLg）混合于Matrigel 基質(zhì)膠中，然后轉(zhuǎn)移到小室中進(jìn)行共培養(yǎng)（每個(gè)小室接種3 000個(gè)vClub細(xì)胞或 5 000 個(gè) Club 細(xì)胞），將小室置于 24 孔板中，構(gòu)成 3D 體外氣道干細(xì)胞類器官培養(yǎng)模型。接種細(xì)胞后，在小室下面加上分別含有0、4、20、100 nmol/L PF-4708671的干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，每2天換液1次，分別設(shè)為0、4、20、100 nmol/L PF-470867 處理組，每組5 個(gè)復(fù)孔。在培養(yǎng)第8 天時(shí)用倒置顯微鏡對(duì)克隆拍照并分別統(tǒng)計(jì)4組樣本的克隆形成數(shù)量（直徑大于50μm的球狀結(jié)構(gòu)）。

1.2.3 熒光定量PCR檢測(cè)S6K1激酶基因和氣道上皮細(xì)胞特征分子的表達(dá) 在培養(yǎng)到第10天時(shí)，用Trizol法裂解氣道干/祖細(xì)胞并提取總RNA，測(cè)定濃度和純度后，取200 ng 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：10×PCR buffer 5 μL、MgCl215μL、dNTP-Mix 1 μL、Hexamers 1 μL、RNA 酶抑制劑0.5 μL、H2O補(bǔ)足至50 μL。 逆轉(zhuǎn)錄條件：25 ℃ 10 min；48 ℃ 40 min；95 ℃5 min；4 ℃恒溫。按照RT-PCR反應(yīng)體系中各種溶液用量配制反應(yīng)體系，混勻后置于實(shí)時(shí)定量PCR儀分析目的基因表達(dá)量。RT-PCR 擴(kuò)增體系為 20 μL，包括 cDNA 2.5 μL、SYBR 10μL、上下游引物各0.5μL、H2O 6.5μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸10 s，循環(huán) 45 次。熔解曲線分析：95 ℃ 10 s，65 ℃ 1 min，97 ℃ 1 s，37 ℃30 s。分別檢測(cè)S6K1激酶基因Rps6kb1和Club細(xì)胞標(biāo)志物Cyp2f2，纖毛細(xì)胞標(biāo)志物Act和Foxj1，杯狀細(xì)胞標(biāo)志物Clca3和Foxa3的基因表達(dá)情況，以 E-cadherin 作為內(nèi)參，相關(guān)引物由華大基因合成，引物序列見(jiàn)表1。各實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)量變化倍數(shù)用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Tab.1 The primers for real-time PCR表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 氣道干/祖細(xì)胞分選與類器官培養(yǎng)模型的建立 流式結(jié)果顯示，成功分離了vClub 和Club 細(xì)胞（圖1A～C），上述細(xì)胞分別與支持細(xì)胞MLg 細(xì)胞混合于Matrigel 基質(zhì)膠里，轉(zhuǎn)入Transwell 小室后置于24孔板上進(jìn)行3D培養(yǎng)（圖1D）。本研究建立這種類器官培養(yǎng)來(lái)研究氣道上皮干細(xì)胞的功能與調(diào)控。類器官培養(yǎng)后，vClub 細(xì)胞克隆形態(tài)是緊縮的球體，Club細(xì)胞克隆形態(tài)是中空的球體（圖1E）。

2.2 PF-4708671 對(duì) vClub 和 Club 細(xì)胞中 S6K1 激酶基因的抑制作用 RT-PCR 分析結(jié)果顯示，與0 nmol/L組相比，20 nmol/L和100 nmol/L 的 PF-4708671 均可抑制 vClub 細(xì)胞和 Club 細(xì)胞Rps6kb1的mRNA的表達(dá)（P＜0.05），但是沒(méi)有明顯劑量依賴性，見(jiàn)表2。

Tab.2 The effect of PF-4708671 on Rps6kb1 expression表2 PF-4708671對(duì)Rps6kb1表達(dá)的影響 （n=4，±s）

Tab.2 The effect of PF-4708671 on Rps6kb1 expression表2 PF-4708671對(duì)Rps6kb1表達(dá)的影響 （n=4，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，a與0 nmol/L 比較，b與4 nmol/L 比較，c與 20 nmol/L比較；P＜0.05；各組有1孔數(shù)據(jù)過(guò)大，予以剔除

組別0 nmol/L組4 nmol/L組20 nmol/L組100 nmol/L組F Rps6kb1 mRNA相對(duì)表達(dá)量vClub 1.04±0.31 0.61±0.45 0.18±0.06a 0.31±0.27a 5.115＊Club 1.02±0.25 0.07±0.03a 0.47±0.15ab 0.04±0.03ac 18.710＊＊

2.3 PF-4708671 對(duì)小鼠氣道 vClub 和 Club 細(xì)胞克隆形成的影響 類器官培養(yǎng)結(jié)果顯示，不同濃度PF-4708671組間vClub細(xì)胞克隆形成數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。4、20、100 nmol/L PF-4708671濃度組Club細(xì)胞克隆形成數(shù)量均較0 nmol/L組減少（P＜0.05），但沒(méi)有劑量依賴性，見(jiàn)表3。

2.4 PF-4708671 對(duì)小鼠氣道vClub 分化功能的影響 RT-PCR 分析結(jié)果顯示，4組間vClub 細(xì)胞克隆內(nèi)Cyp2f2mRNA表達(dá)水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖2。

Fig.1 Sorting strategy of mouse airway stem/progenitor cells and organoid cultures of these stem/progenitor cells圖1 小鼠氣道干/祖細(xì)胞的分選策略與類器官培養(yǎng)模型

Tab.3 The inhibitory effects of PF-4708671 on colony forming ability of mouse airway vClub cells and Club cells表3 PF-4708671對(duì)小鼠氣道vClub和Club細(xì)胞克隆形成的抑制作用 （n=5，±s）

Tab.3 The inhibitory effects of PF-4708671 on colony forming ability of mouse airway vClub cells and Club cells表3 PF-4708671對(duì)小鼠氣道vClub和Club細(xì)胞克隆形成的抑制作用 （n=5，±s）

＊P＜0.05，a與0 nmol/L組比較，b與4 nmol/L組比較，P＜0.05

組別0 nmol/L組4 nmol/L組20 nmol/L組100 nmol/L組F克隆個(gè)數(shù)（個(gè)/視野）vClub 87±13 84±14 73±6 67±12 2.364 Club 189±24 141±26a 143±28a 151±32a 3.244＊

Fig.2 The effects of PF-4708671 on the differentiation of mouse airway vClub cells圖2 PF-4708671對(duì)小鼠氣道vClub細(xì)胞分化功能的影響

2.5 PF-4708671 對(duì)小鼠氣道Club 細(xì)胞分化功能的影響 RT-PCR 分析結(jié)果顯示，不同濃度的PF-4708671對(duì)Club細(xì)胞克隆內(nèi)Foxj1、Act、Clca3和Foxa3的mRNA表達(dá)無(wú)明顯影響，各組間上述特征分子mRNA表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表4。

Tab.4 The effects of PF-4708671 on the differentiation of mouse airway Club cells表4 PF-4708671對(duì)小鼠氣道Club細(xì)胞分化功能的影響（n=5，±s）

Tab.4 The effects of PF-4708671 on the differentiation of mouse airway Club cells表4 PF-4708671對(duì)小鼠氣道Club細(xì)胞分化功能的影響（n=5，±s）

均P＞0.05

組別0 nmol/L組4 nmol/L組20 nmol/L組100 nmol/L組F纖毛細(xì)胞標(biāo)志物相對(duì)表達(dá)量Foxj1 1.00±0.05 0.71±0.12 0.99±0.18 1.12±0.35 2.957 Act 1.01±0.15 0.84±0.10 0.99±0.05 0.92±0.20 1.171杯狀細(xì)胞標(biāo)志物相對(duì)表達(dá)量Clca3 1.03±0.26 1.26±0.68 1.31±0.44 1.39±0.27 0.488 Foxa3 1.02±0.25 1.01±0.36 1.21±0.17 1.21±0.41 1.857

3 討論

氣道上皮黏膜是機(jī)體與外環(huán)境直接接觸的第一道屏障，完成氣體交換功能的同時(shí)，還要抵御外源物質(zhì)（微生物或有害顆粒及氣體）的侵害，所以維持氣道上皮的完整性尤為重要［7］。氣道上皮黏膜存在干/祖細(xì)胞，其中vClub 具有干細(xì)胞特性，具有分化成Club細(xì)胞的潛能［8］。Club細(xì)胞又能分化產(chǎn)生纖毛細(xì)胞和杯狀細(xì)胞［9］。正常情況下，小鼠和人的氣道上皮黏膜中vClub 豐度較低，Club 細(xì)胞和纖毛細(xì)胞的豐度較高。在過(guò)敏反應(yīng)時(shí)杯狀細(xì)胞豐度顯著增加。mTOR 是哺乳動(dòng)物雷帕霉素的靶蛋白，可通過(guò)S6K1調(diào)控細(xì)胞的代謝、增殖、分化和自噬。PF-4708671是S6K1 的抑制劑，可通過(guò)抑制S6K1 阻遏mTOR 通路。本研究發(fā)現(xiàn)，PF-4708671 能夠抑制S6K1 激酶基因Rps6kb1的表達(dá)。在vClub細(xì)胞中，不同濃度的PF-4708671 對(duì)其增殖能力無(wú)明顯影響。而在Club細(xì)胞中，即使低濃度（4 nmol/L）的PF-4708671 也能明顯抑制Club細(xì)胞的增殖。這很可能是vClub細(xì)胞對(duì)PF-4708671 的耐受力較高，低濃度的PF-4708671 并不能影響vClub 細(xì)胞的增殖能力。說(shuō)明mTOR/S6K1信號(hào)通路促進(jìn)氣道上皮黏膜再生能力。既往研究也發(fā)現(xiàn)，在肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中利用水楊酸苷阻斷mTOR 通路也能夠抑制細(xì)胞的增殖能力［10］。利用miR-101抑制PI3K/Akt/mTOR通路激活能夠顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖能力［11］。這與本研究的結(jié)果相似，說(shuō)明在不同的細(xì)胞中，mTOR的促增殖功能比較保守。

氣道上皮穩(wěn)態(tài)的維持是氣道干/祖細(xì)胞增殖和分化能力相互協(xié)調(diào)的結(jié)果。氣道干/祖細(xì)胞分化功能異常時(shí)，也會(huì)引起氣道上皮黏膜損傷。如在支氣管哮喘時(shí)，杯狀細(xì)胞增生、分泌增強(qiáng)［12］。在COPD、囊性肺纖維化等疾病中，上皮細(xì)胞黏膜功能受到損害將增加感染率和死亡率［13-14］。本研究發(fā)現(xiàn)，PF-4708671 處理組與對(duì)照組相比克隆形成能力下降，但是Act和Foxj1的表達(dá)量沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明PF-4708671 對(duì)纖毛細(xì)胞的分化影響甚微。此外，PF-4708671處理組與對(duì)照組相比Clca3和Foxa3的表達(dá)量沒(méi)有變化，說(shuō)明對(duì)杯狀細(xì)胞的分化也沒(méi)有影響，提示S6K1主要是通過(guò)調(diào)節(jié)氣道干/祖細(xì)胞的增殖功能維持氣道上皮黏膜的再生。近來(lái)的研究顯示，作為S6K1 的上游元件，mTOR 被硫化氫激活后可緩解LPS 誘導(dǎo)的肺損傷［5］。有研究顯示 S6K1與 COPD 和支氣管哮喘氣道平滑肌肥大有關(guān)［15-16］。氣道上皮細(xì)胞缺失mTOR后導(dǎo)致LPS誘導(dǎo)的肺損傷減弱［17］。抑制mTOR調(diào)節(jié)蛋白可通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞自噬來(lái)減輕高氧引起的肺損傷作用［18］。這可能與mTOR 下游存在S6K1 以外的多個(gè)作用靶點(diǎn)有關(guān)，另外S6K1 的上游信號(hào)也不止mTOR信號(hào)。研究不同肺損傷中氣道上皮細(xì)胞等S6K1 活性的變化對(duì)于其病生理機(jī)制的揭示至關(guān)重要。

綜上所述，本研究采用類器官培養(yǎng)模型發(fā)現(xiàn)S6K1可能與小鼠氣道上皮vClub/Club細(xì)胞的增殖功能密切相關(guān)，有助于維持氣道干細(xì)胞的再生能力。與氣道干/祖細(xì)胞功能低下相關(guān)的疾病中，激活S6K1信號(hào)通路或許能給臨床治療這些疾病提供新思路。