俞 燕，蔡夢杭，徐 燦，黃家風(fēng)

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意義】由大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaeKleb.)侵染所引起的棉花黃萎病, 每年給我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來經(jīng)濟(jì)損失[1]。大麗輪枝菌具有寄主廣泛、變異頻繁、微菌核在土壤中存活時(shí)間長的特點(diǎn)，常規(guī)防治方法很難對其進(jìn)行有效防治，控制黃萎病的為害，已成為當(dāng)前影響棉花生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵問題。研究外界碳氮營養(yǎng)比例的變化對大麗輪枝菌主要生物學(xué)性狀及致病力造成的影響，對大田生產(chǎn)中通過調(diào)整施肥比例，減少大麗輪枝菌對作物造成的為害有重要意義。【前人研究進(jìn)展】碳(C)和氮(N)是植物必需的主要養(yǎng)分，碳和氮之間的相互作用調(diào)節(jié)著植物的生長發(fā)育[2]。不同C/N處理能增強(qiáng)煙草葉片葉綠素的合成，影響煙草的生長發(fā)育，提高光合速率，加速光合產(chǎn)物的積累，更好的為植株形態(tài)建成提供物質(zhì)支持[3-4]。C/N對微生物生長發(fā)育也極為重要,碳氮比低時(shí)，有利于微生物在土壤中分解有機(jī)質(zhì)，增加有效氮的釋放；碳氮比高時(shí)，微生物分解有機(jī)質(zhì)能力受限，有效氮的釋放減少，導(dǎo)致微生物與植物爭奪土壤中的無機(jī)氮，從而不利于植物的生長及 NPP(凈初級生產(chǎn)力)的增加[5]。王瑞等[6]研究表明，不同碳氮比對少孢節(jié)叢孢菌(Arthrobotrysoligospora)菌絲的生長產(chǎn)生明顯的影響，菌絲生長最適合的碳氮比值為5∶1，碳氮比為80∶1時(shí)，菌絲的生長率最低，隨著碳氮比值的增大，菌絲生長率下降。不同C/N對球孢白僵菌(Beauveriabassiana)的產(chǎn)孢能力、菌絲生長量、毒力以及酶活性都有影響，在較低C/N營養(yǎng)條件下球孢白僵菌的產(chǎn)孢能力、菌絲生物量、毒力及酶活性最強(qiáng)[7-9]。Hoffland等[10]研究發(fā)現(xiàn)，番茄灰霉病(Botrytiscinerea)引起的發(fā)病率與番茄葉片碳水化合物含量及C/N比之間呈正相關(guān)關(guān)系，番茄葉片碳水化合物合成增加，葉片的C/N增加，會促進(jìn)病原菌的侵染。碳氮比營養(yǎng)條件不僅對植物的生長有影響，對病原菌的生長繁殖及致病力也產(chǎn)生一定的影響。【本研究切入點(diǎn)】目前關(guān)于大麗輪枝菌與碳氮營養(yǎng)元素之間的研究，僅僅是通過觀察大麗輪枝菌在不同碳源和氮源培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀，尋找大麗輪枝菌生長最適的碳源及氮源培養(yǎng)基[11-12]，并未研究碳氮營養(yǎng)元素含量的變化對大麗輪枝菌造成的影響。研究不同碳氮比營養(yǎng)條件對大麗輪枝菌生物學(xué)性狀及致病力造成的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對培養(yǎng)基組分進(jìn)行改進(jìn)，調(diào)整查氏培養(yǎng)基中的C/N，記錄大麗輪枝菌的培養(yǎng)性狀、生長發(fā)育及致病力，分析C/N營養(yǎng)條件變化對大麗輪枝菌生物學(xué)性狀及致病力造成的影響，為大麗輪枝菌的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株及供試植株

棉花大麗輪枝菌落葉型菌株V592和非落葉型菌株I6，分離、鑒定，經(jīng)過單孢純化，于-80℃超低溫冰箱進(jìn)行保存。供試植株選用對棉花黃萎病感病的品種軍棉1號和對棉花黃萎病抗病的品種中植棉2號。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

根據(jù)常規(guī)的查氏培養(yǎng)基[13]計(jì)算出培養(yǎng)基中30 g蔗糖的含碳量為12.62 g，2.0 g硝酸鈉的含氮量為0.33 g[14]，含鈉量為0.54 g，試驗(yàn)為減少變量因素影響，分別用含氮量為0.33 g的硝酸銨和含鈉量為0.54 g的氯化鈉替代硝酸鈉，其余的培養(yǎng)基成分和含量均不變。試驗(yàn)中蔗糖作為唯一碳源，硝酸銨作為唯一氮源。試驗(yàn)所有處理均在組分改進(jìn)后的培養(yǎng)基中進(jìn)行，各處理碳氮比(C/N)是在蔗糖一定的基礎(chǔ)上通過改變硝酸銨的含量進(jìn)行調(diào)整的，處理分別為：處理1(CM1)：C/N為25∶1；處理2(CM2)：C/N為30∶1；處理3(CM3)：C/N為35∶1；處理4(CM4)：C/N為40∶1；處理5(CM5)：C/N為45∶1；處理6(CM6)：C/N為50∶1。

1.2 不同碳氮比營養(yǎng)條件下大麗輪枝菌生物學(xué)性狀的測定

1.2.1 不同碳氮比查氏固體培養(yǎng)基上大麗輪枝菌培養(yǎng)性狀的觀察

將PDA平板上培養(yǎng)7 d的大麗輪枝菌用打孔器取直徑5 mm的菌絲塊，分別接種于不同C/N查氏固體培養(yǎng)基上，置于26℃條件下黑暗培養(yǎng)，每隔1 d觀察菌落形態(tài)。在菌落生長的第5和第9 d，采用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算菌落生長速度，菌落生長速度=(第9 d平均菌落直徑-第5 d平均菌落直徑)/4，并在第15 d進(jìn)行拍照記錄。每個(gè)處理設(shè)5次重復(fù)，測定結(jié)果進(jìn)行顯著性分析。

1.2.2 不同碳氮比查氏液體培養(yǎng)基對大麗輪枝菌產(chǎn)孢量、萌發(fā)率及菌絲量的測定

將PDA平板上培養(yǎng)7 d 的菌株用10 mm 的打孔器取10塊菌餅，放入查氏液體培養(yǎng)基中搖培3 d，用高溫滅菌過的4層紗布過濾收集分生孢子，再用無菌水調(diào)整孢子濃度至1.0×106cfu/mL。吸取100 μL孢子懸浮液，分別接種至盛有100 mL不同C/N查氏液體培養(yǎng)基中，26℃、200 /min搖培，分別在1 、2 、3 、4 、5 、6 d取樣進(jìn)行孢子濃度的測定，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，測定結(jié)果進(jìn)行顯著性分析。吸取1 mL上述搖培至第7 d的孢子懸浮液裝入2 mL的離心管中，分別在0、6、12、48、72 h觀察分生孢子萌發(fā)情況，每個(gè)處理重復(fù)3次，測定結(jié)果進(jìn)行顯著性分析。然后將搖培到第7 d的菌液用濾紙過濾，將濾紙上的菌絲體轉(zhuǎn)至稱量紙上稱重(濕重)，室溫過夜或烘干，稱其重量(干重)，每個(gè)處理重復(fù)3次,測定結(jié)果進(jìn)行顯著性分析。

1.3 不同碳氮比營養(yǎng)條件對大麗輪枝菌致病性的測定

將PDA平板上培養(yǎng)7 d的菌株用10 mm的打孔器取10塊菌餅，放入不同C/N查氏液體培養(yǎng)基中26℃，200 r/min 搖培5 d，4層紗布過濾收集各處理的分生孢子，用清水調(diào)整孢子濃度至1.0×107cfu/mL，浸根接種法接種兩葉一心期棉花幼苗[15]。開始發(fā)病后，采用5級分級法進(jìn)行病情調(diào)查，病級分級標(biāo)準(zhǔn)：0級：健株；1級：子葉出現(xiàn)病狀；2級：1～2片真葉嚴(yán)重發(fā)病；3級：3片真葉以上表現(xiàn)病狀 ；4級 ：植株生長點(diǎn)死亡或全株枯死[12,16]；分別在10、15、20、25 d記錄病情指數(shù)，病情指數(shù)(病指)=[(1×1級發(fā)病株數(shù))+(2×2級發(fā)病株數(shù))+(3×3級發(fā)病株數(shù))+(4×4級發(fā)病株數(shù))]/[總株數(shù)×4(即最高病級)]。每個(gè)處理重復(fù)3次，測定結(jié)果取3次的平均值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳氮比查氏培養(yǎng)基對大麗輪枝菌培養(yǎng)性狀的影響

研究表明,落葉型和非落葉型2種不同致病類型的菌株形成相似的菌落形態(tài)，氣生菌絲均勻分布在菌落表面，菌落中央形成黑色微菌核，菌落生長速度無明顯差異；但2個(gè)菌株產(chǎn)生的微菌核存在明顯不同，非落葉型菌株I6在各處理中微菌核產(chǎn)量沒有差異，落葉型菌株V592形成的微菌核隨著培養(yǎng)基中碳氮比的增加呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，CM1和CM2處理中形成的微菌核明顯多于CM5和CM6處理中形成的微菌核。不同碳氮比營養(yǎng)條件明顯影響大麗輪枝菌落葉型菌株微菌核的形成，低的碳氮比(25∶1～30∶1)有利于微菌核形成，高的碳氮比(45∶1～50∶1)不利于微菌核形成。圖1

注：A：落葉型菌株V592的菌落形態(tài)，B：落葉型菌株V592的菌落生長速度；C：非落葉型菌株I6的菌落形態(tài)，D：非落葉型菌株I6的菌落生長速度 同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示經(jīng)Duncan檢驗(yàn)差異極顯著(P< 0.05)，下同

A: Colony morphology of defoliating strain V592, B: Colony growth rate of defoliating strain V592; C: Colony morphology of non-defoliating strain I6, D: Colony growth rate of non-defoliating strain I6.The different small letters after the figure in a column mean differences extremely significant by Duncan test (P<0.05), the same as below

圖1 大麗輪枝菌在不同碳氮比查氏培養(yǎng)基上性狀
Fig.1 Cultural characteristics ofVerticilliumdahliaeon Czapek’s media with different C/N ratios

2.2 不同碳氮比查氏培養(yǎng)基對大麗輪枝菌產(chǎn)孢量、菌絲量及孢子萌發(fā)率的影響

研究表明，大麗輪枝菌的產(chǎn)孢量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而逐漸增加，從第3 d起產(chǎn)孢量開始表現(xiàn)明顯差異。第6 d時(shí)，落葉型菌株V592和非落葉型菌株I6在CM1處理中的產(chǎn)孢量顯著高于其它各處理的產(chǎn)孢量，孢子濃度分別為196.67×106cfu/mL，150.00×106cfu/mL，其次在CM2處理中的產(chǎn)孢量較高，孢子濃度分別為166.67×106cfu/mL ，129.56×106cfu/mL，2個(gè)菌株在CM3-CM6處理中的產(chǎn)孢量明顯減少。低碳氮比(25∶ 1)更有利于大麗輪枝菌產(chǎn)孢，當(dāng)碳氮比高于35∶ 1不利于大麗輪枝菌產(chǎn)孢。圖2

2個(gè)菌株的菌絲濕重和菌絲干重均隨培養(yǎng)基中碳氮比的升高呈明顯下降趨勢，在CM1處理中的菌絲量明顯高于其它各處理中的菌絲量。碳氮比越低越有利于大麗輪枝菌菌絲生長。圖3

2個(gè)菌株都是在CM4處理中孢子萌發(fā)率最高，顯著高于其它各處理中的孢子萌發(fā)率。由此說明，不同碳氮比營養(yǎng)條件明顯影響大麗輪枝菌的孢子萌發(fā)，40∶ 1的碳氮比更有利于大麗輪枝菌的孢子萌發(fā)。圖4

注：A：落葉型菌株V592的產(chǎn)孢量；B：非落葉型菌株I6的產(chǎn)孢量

A: Conidial production ofdefoliating strain V592; B: Conidial production of non-defoliating strain I6

圖2 大麗輪枝菌在不同碳氮比查氏培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量
Fig.2 Conidial productionofV.dahliaeonCzapek’smediawithdifferentC/Nratios

注：A, B：落葉型菌株V592的菌絲量；C, D：非落葉型菌株I6的菌絲量

A, B: Mycelial yield of defoliating strain V592; C, D: Mycelial yield of non-defoliating strain I6

圖3 大麗輪枝菌在不同碳氮比查氏培養(yǎng)基上菌絲量
Fig.3 Mycelial yield ofV.dahliaeon Czapek’s media with different C/N ratios

注：A, B：落葉型菌株V592的菌絲量；C, D：非落葉型菌株I6的菌絲量

A, B: Mycelial yield of defoliating strain V592; C, D: Mycelial yield of non-defoliating strain I6

注：A：落葉型菌株V592的分生孢子萌發(fā)率；B：非落葉型菌株I6的分生孢子萌發(fā)率

A: Conidial germination rate of defoliating strain V592; B: Conidial germination rate of non-defoliating strain I6

圖4 大麗輪枝菌在不同碳氮比查氏培養(yǎng)基上分生孢子萌發(fā)率
Fig.4 Conidial germination rate ofV.dahliaeon Czapek’s media with different C/N ratios

注：A：落葉型菌株V592導(dǎo)致發(fā)病的病情指數(shù)；B：非落葉型菌株I6導(dǎo)致發(fā)病的病情指數(shù)；C：接種落葉型菌株V592后第20 d 的發(fā)病癥狀；D：接種非落葉型菌株I6后第20 d 的發(fā)病癥狀

A: Disease index of cotton plants inoculated with defoliating strain V592; B: Disease index of cotton plants inoculated with non-defoliatingstrain I6; C: Disease symptoms of cotton plants infected with defoliating strain V592 at 20 dpi; Disease symptoms of cotton plants infected with non-defoliating strain I6 at 20 dpi

圖5 不同碳氮比查氏培養(yǎng)基培養(yǎng)的大麗輪枝菌在感病品種上的致病力
Fig.5 Disease severity and symptoms in susceptible cotton variety infected withV.dahliaecultured in Czapek’s media with different C/N ratios

2.3 不同碳氮比查氏培養(yǎng)基培養(yǎng)對大麗輪枝菌致病力的影響

用不同碳氮比營養(yǎng)條件培養(yǎng)大麗輪枝菌，分別接種不同抗性的棉花品種。在感病品種軍棉1號上，不同碳氮比處理的落葉型和非落葉型菌株均在接種10 d時(shí)表現(xiàn)發(fā)病癥狀，接種15 d后，不同處理的病情指數(shù)開始表現(xiàn)明顯差異，CM1和CM2處理的病情指數(shù)顯著高于其它處理的病情指數(shù)。接種25 d時(shí)，CM1和CM2處理的病株葉片萎蔫、脫落、甚至整株枯死，V592的病情指數(shù)分別高達(dá)98.05和90.37，I6的病情指數(shù)分別為93.03和84.00，而其它處理的病情指數(shù)都顯著低于CM1和CM2處理的病情指數(shù)。在感病品種上，不同碳氮比營養(yǎng)條件對大麗輪枝菌落葉型菌株和非落葉型菌株的致病力影響一致，低碳氮比(25:1)有利于大麗輪枝菌致病，當(dāng)碳氮比高于35:1大麗輪枝菌致病力明顯減弱。圖5

在抗性品種中植棉2號上，不同碳氮比處理的2個(gè)菌株也是在接種10 d時(shí)表現(xiàn)發(fā)病癥狀，但是病情指數(shù)明顯低于在軍棉1號上的病情指數(shù)。從不同時(shí)段調(diào)查的病情指數(shù)來看，落葉型菌株V592和非落葉型菌株I6均在CM3處理中的病情指數(shù)最高，并且明顯高于其它處理的病情指數(shù)。在抗病品種上，只有合適的碳氮比(35∶1)才有利于大麗輪枝菌致病，碳氮比過高或過低都不利于大麗輪枝菌致病。圖6

注：A：落葉型菌株V592導(dǎo)致發(fā)病的病情指數(shù)；B：非落葉型菌株I6導(dǎo)致發(fā)病的病情指數(shù)；C：接種落葉型菌株V592后第20 d 的發(fā)病癥狀；D：接種非落葉型菌株I6后第20 d 的發(fā)病癥狀

A: Disease index of cotton plants inoculated with defoliating strain V592; B: Disease index of cotton plants inoculated with non-defoliatingstrain I6; C: Disease symptoms of cotton plants infected with defoliating strain V592 at 20 dpi; Disease symptoms of cotton plants infected with non-defoliating strain I6 at 20 dpi

圖6 不同碳氮比查氏培養(yǎng)基培養(yǎng)的大麗輪枝菌在抗病品種上的致病力
Fig.6 Disease severity and symptoms in resistant cotton variety infected withV.dahliaecultured in Czapek’s media with different C/N ratios

3 討 論

已有研究表明，大麗輪枝菌在不同氮含量培養(yǎng)基上形成的菌落顏色、質(zhì)地?zé)o明顯區(qū)別，但對大麗輪枝菌微菌核的產(chǎn)生量有影響，氮元素的缺乏會使大麗輪枝菌微菌核的產(chǎn)生量減少[17]。研究發(fā)現(xiàn)，不同碳氮比營養(yǎng)條件對大麗輪枝菌落葉型菌株的微菌核形成有影響，低碳氮比有利于微菌核的形成，高碳氮比不利于微菌核的形成。

在少孢節(jié)叢孢菌(Arthrobotrysoligospora)的研究中發(fā)現(xiàn)，菌絲在不同碳氮比培養(yǎng)基中的生長速度有明顯的變化，隨著碳氮比值的增大，菌絲生長率下降[6]。對球孢白僵菌(Beauveriabassiana)的研究發(fā)現(xiàn)，低碳氮比的營養(yǎng)條件有利于菌絲的生長和孢子的形成[7]。研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，不同碳氮比營養(yǎng)條件對大麗輪枝菌的產(chǎn)孢能力和菌絲生長有影響，低碳氮比有利于大麗輪枝菌的產(chǎn)孢和菌絲生長。

不同碳氮比營養(yǎng)條件對大麗輪枝菌的致病力有影響，在感病品種中，低碳氮比有利于大麗輪枝菌致病，這可能與大麗輪枝菌在低碳氮比中菌核形成，分生孢子產(chǎn)生，菌絲生長等繁殖能力強(qiáng)有關(guān)。Safavi等[8]對球孢白僵菌(Beauveriabassiana)的研究發(fā)現(xiàn)，低C/N營養(yǎng)條件培養(yǎng)的球孢白僵菌，其毒力最強(qiáng)，與研究結(jié)果一致。Hoffland等[10]研究番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)發(fā)現(xiàn)，灰霉菌在番茄上的發(fā)病率與番茄葉片中的C/N呈正相關(guān)關(guān)系，隨著番茄葉片C/N比的增加，越有利于病原菌的侵染。上述研究結(jié)果說明，外界碳氮比的變化與寄主自身碳氮比的變化都會影響真菌的致病力。研究發(fā)現(xiàn)，在抗病品種中，大麗輪枝菌只有在碳氮比合適的情況下才最有利于致病，這一結(jié)果與大麗輪枝菌在感病品種中的致病力結(jié)果存在差異，造成這種差異的原因可能與抗病品種中存在一些抗性基因有關(guān)，也可能是寄主品種之間的碳氮比不同所導(dǎo)致的，但這種差異究竟是如何造成的，還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

不同碳氮比營養(yǎng)條件對大麗輪枝菌落葉型菌株和非落葉型菌株的生長、繁殖及致病力都有影響，低碳氮比(25∶1)有利于大麗輪枝菌的菌核形成、分生孢子產(chǎn)生和菌絲生長，在感病品種上表現(xiàn)出較強(qiáng)致病性；高碳氮比(高于40∶1)不利于大麗輪枝菌生長、繁殖和致病。