王志方，陳競，代金平，古麗努爾·艾合買提，王小武，秦新政，李晨華，楊新平

( 1.新疆農(nóng)科院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091；2.中科院新疆生態(tài)與地理研究所，烏魯木齊 830011)

0 引 言

【研究意義】新疆是我國最大棉花主產(chǎn)區(qū)和重要商品棉生產(chǎn)基地，棉花秸稈資源豐富[1]，棉花秸稈中富含 N、P、K等多種營養(yǎng)元素，對資源化利用、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展均具有重要意義[2]。棉秸稈木質(zhì)化程度和C/N比均較高[3]，其資源化利用水平低下；新疆土地較貧瘠，若將棉秸稈直接還田，不僅在短時間內(nèi)難以腐熟[3]，而且易導(dǎo)致C/N比失衡，引起還田秸稈在腐解前期與作物爭氮，影響土壤微生態(tài)環(huán)境[4]。大部分棉秸稈隨意堆置或原位焚燒，微生物在秸稈腐解和養(yǎng)分釋放過程中具有舉足輕重的作用[5]，秸稈降解微生物群落功能多樣性的研究顯得尤為重要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】主坐標(biāo)分析(PCoA，Principal Co-ordinates Analysis)，是通過一系列的特征值和特征向量排序從多維數(shù)據(jù)中提取出最主要的元素和結(jié)構(gòu)?；赪eighted Unifrac距離來進(jìn)行PCoA分析，如果樣品距離越接近，表示物種組成結(jié)構(gòu)越相似，因此，群落結(jié)構(gòu)相似度高的樣品傾向于聚集在一起，群落差異很大的樣品則會遠(yuǎn)遠(yuǎn)分開。秸稈發(fā)酵/腐解是多種微生物菌群共同作用的結(jié)果，并依賴于外部因素進(jìn)行自我調(diào)控的復(fù)雜生化過程[6]。尉良[7]發(fā)現(xiàn)添加微生物菌劑能有效促進(jìn)發(fā)酵過程中有機(jī)物質(zhì)的分解，加快發(fā)酵腐熟進(jìn)程，能在一定程度上提高發(fā)酵產(chǎn)品的肥效；慕永紅等[8]發(fā)現(xiàn)，利用MTS酵素可以加速秸稈腐爛速度，促進(jìn)秸稈中營養(yǎng)元素的釋放，在生物菌劑的作用下，秸稈中速效磷大量釋放期可以提前一個月，以及速效鉀釋放量增加1倍[9]。目前，自然界中存在的某些細(xì)菌、放線菌和真菌等均具有降解秸稈特性，其中因放線菌和細(xì)菌產(chǎn)酶含量低，且二者多產(chǎn)生胞內(nèi)酶，難于分離，故不易大規(guī)模生產(chǎn)。在工業(yè)生產(chǎn)中，主要利用Trichoderma．sp 和Aspergillus．sp 用于降解秸稈。還有研究表明，Coriolus.sp、Poria．sp、Phanerochaete.sp、Sjekandera.spPenicillium.sp 、Acremonium．sp、Myrothecium.sp、Neurospora．sp 、Chaetomium．sp等菌株對秸稈也具有較高的分解能力[10-12]。 【本研究切入點(diǎn)】由于秸稈腐解的快慢與秸稈自身組成、微生物種類和所處的環(huán)境有關(guān)。不同種類的秸稈其大小、C/N ,物質(zhì)組成比例及周圍的環(huán)境條件各不相同，導(dǎo)致秸稈腐解的速度亦有差異[13]。目前關(guān)于棉秸稈降解菌群的報(bào)道較少。研究利用微生物學(xué)和分子生物學(xué)手段篩選和鑒定棉稈自然腐熟過程中的微生物菌群。【擬解決的關(guān)鍵問題】基于高通量測序技術(shù)，研究棉秸稈腐解過程中微生物菌群變化，為篩選棉秸稈高效腐熟菌劑，加快棉秸稈腐解過程，提高棉秸稈還田及基質(zhì)化利用效率提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 棉秸稈

于2017年分別采自新疆吐魯番棉花產(chǎn)區(qū)，用曼大LYS550秸桿粉碎機(jī)將棉稈粉碎成 1～2 cm長度備用。稱取自然風(fēng)干棉秸稈8 kg，加入自來水拌勻至含水量為60%，堆成直徑80 cm，高度60 cm的小堆，表面覆蓋塑料布，在通風(fēng)的室內(nèi)進(jìn)行堆制，室溫在20～28℃范圍內(nèi)，間隔7 d取樣，持續(xù)采樣4次。

1.2 方 法

1.2.1 棉秸稈自然堆制過程中菌群16S rDNA高通量測序1.2.1.1 基因組DNA提取

采用 CTAB 或 SDS 方法對樣本的基因組 DNA 進(jìn)行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。

1.2.1.2 PCR引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增

根據(jù)所擴(kuò)增的16S區(qū)域特點(diǎn)，基于Illumina HiSeq測序平臺，選取16S V4區(qū)引物(515F：GTGYCAGCMGCCGCGGTAA和806R：GGACTACNVGGGTWTCTAA)，與 其它片斷組合成5’Hiseq接頭-barcode-測序引物-特異引物-3’的PCR擴(kuò)增引物，使用New England Biolabs 公司的 Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer，和高效高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為94℃ 2 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s。循環(huán)25次；72℃ 5 min。

1.2.1.3 文庫構(gòu)建和高通量測序

使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，使用HiSeq2500 PE250進(jìn)行上機(jī)測序。

1.2.2 測序數(shù)據(jù)

根據(jù)Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列后使用FLASH對每個樣品的reads進(jìn)行拼接，得到的拼接序列參照Qiime(V1.7.0)構(gòu)成Tags數(shù)據(jù)集，進(jìn)一步過濾掉其中連續(xù)高質(zhì)量堿基長度小于Tags長度75%的Tags。 經(jīng)過以上處理后得到的Tags需要進(jìn)行去除嵌合體序列的處理，Tags序列通過(UCHIME Algorithm)與數(shù)據(jù)庫(Gold database)進(jìn)行比對 檢測嵌合體序列，并最終去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)。

1.2.3 序列1.2.3.1 操作分類單元聚類和物種注釋

利用Uparse 軟件(Uparse v7.0.1001)[14]對所有樣品的全部 Effective Tags進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成為操作分類單元(Operational Taxonomic Units，OTUs)，同時選取OTUs的代表性序列，用Mothur方法與SILVA[15]的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫[16]進(jìn)行物種注釋分析(設(shè)定閾值為0.8～1)，獲得分類學(xué)信息并分別在各個分類水平，統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。

1.2.3.2 樣品復(fù)雜度

使用Qiime軟件(Version 1.7.0)計(jì)算Observed-species，Chao1，Shannon，Simpson，ACE，Goods-coverage 指數(shù)，使用R軟件(Version 2.15.3)繪制稀釋曲線，使用R軟件進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示，運(yùn)用IBM SPSS Statistics 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序

研究表明，5個樣品的有效序列數(shù)在6萬到9萬之間，在97%相似水平下對所有序列進(jìn)行OUT劃分，OUT數(shù)量在200～600。表1

各樣品goods-coverage指數(shù)接近0.97，測序深度已經(jīng)基本能覆蓋該微生物群落中絕大多數(shù)細(xì)菌。稀釋曲線可直接反映測序數(shù)據(jù)量的合理性，間接反映樣品中物種的豐富程度，當(dāng)曲線趨向平坦時，測序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的物種(OTUs)，稀釋曲線趨于平緩，結(jié)合goods coverage指數(shù)，各樣品文庫中包含了棉秸稈堆制過程中的絕大多數(shù)細(xì)菌類群，基本能夠反映群落組成，增加更多的測序數(shù)據(jù)量，只會產(chǎn)生很少量的新的OTU。表2,圖1

表1 棉秸稈自然腐解過程中不同時期樣品高通量測序
Table1 Data of the high-through sequencing results of bacterial community in cotton straw samples from different degradation time

樣品Sample有效序列總數(shù)Total number of valid sequences有效OTU總數(shù)Total number of valid OTUsD060 034216D765 857308D1472 610497D2183 071530D2872 495560

表2 棉秸稈腐解過程中不同時間樣品微生物群落α多樣性
Table 2 α diversity of bacterial community in cotton straw samples from different degradation time

樣品SampleGoods coverage indexShannon indexSimpson indexD00.9983.802±0.797 1c0.785 ±0.071 7 bD70.9986.386±0.330 6b0.959±0.014 1aD140.9977.384±0.140 3ab0.985 ±0.001 8aD210.9977.767±0.057 0a0.989±0.000 0aD280.9977.671±0.142 3a0.984 ±0.002 6a

注: 同列不同字母表示0.05水平差異顯著

Note: Values followed by different small letters in the same column mean significantly different atP<0.05

2.3 棉秸稈自然堆制菌群多樣性

研究表明，堆制7 d后的菌群與初期菌群結(jié)構(gòu)差異明顯，而14 d后的菌群結(jié)構(gòu)與7 d時也有所差異。

Alpha多樣性指數(shù)Shannon、Simpson可以用來估算微生物多樣性，數(shù)值越大，說明菌群多樣性越高，堆制7 d時細(xì)菌群落多樣性與堆制起始時有顯著性差異。堆制后期細(xì)菌群落多樣性差異不顯著。 圖2

圖1 棉秸稈自然腐解過程中不同時期樣品細(xì)菌群落稀釋曲線
Fig.1 Rarefaction curves of bacterial community in cotton straw samples from different degradation time

圖2 棉秸稈腐解過程中不同時間樣品微生物群落主坐標(biāo)
Fig.2 PcoA of bacterial community in cotton straw samples from different degradation time

2.4 棉秸稈堆制過程中細(xì)菌優(yōu)勢屬變化

堆制全過程中共測得325個菌屬，堆制初期為268個菌屬，中期達(dá)到 300個菌屬，末期菌屬為325個，比初期增加21%，堆制后期比初期微生物種類更加豐富。在全過程中始終存在的優(yōu)勢菌屬有鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)、橄欖球菌屬(Olivibacter)、假黃單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)、德沃斯氏菌屬(Devosia)、根瘤菌屬(Rhizobium)。在堆制初始階豐度最高的寡養(yǎng)食單孢菌屬(Stenotrophomonas)在堆制過程中持續(xù)減少。在堆制中后期成為優(yōu)勢菌屬的有短波單胞菌屬(Brevundimonas)、Simiduia屬、纖維弧菌屬(Cellvibrio)。圖3

注：黃色表示細(xì)菌菌屬在腐解過程中一直是優(yōu)勢菌屬；紅色表示細(xì)菌菌在屬腐解過程中豐度持續(xù)下降；藍(lán)色及紫色表示細(xì)菌菌屬腐解過程中后期成為優(yōu)勢屬

圖3 棉秸稈腐解過程中不同時間樣品優(yōu)勢菌屬
Table 3 Dominant bacterial genus in cotton straw samples from different degradation time

3 討 論

3.1 棉花秸稈還田具有培肥地力等優(yōu)勢，由于棉秸稈主要成分為纖維素、半纖維素、木質(zhì)素，還含有單寧、果膠素等，其中木質(zhì)素含量為36%[17]，比其它主要農(nóng)作物高2～3倍，造成棉秸稈難以充分腐解，影響播種質(zhì)量、出苗、作物生長和產(chǎn)量。微生物降解棉稈的過程是在適宜的營養(yǎng)、溫度、濕度、通氣量和pH條件下，通過微生物增殖，把棉秸稈中碳、氮、磷、鉀和硫等分解礦化或形成為簡單有機(jī)物和腐殖質(zhì)過程，大部分微生物只能降解其中的一部分，單一微生物所分泌的酶系統(tǒng)很難達(dá)到對棉秸稈的快速降解，因此，需要由多種不同降解功能的微生物協(xié)同作用來完成棉秸稈的降解。

3.2 目前采用高通量測序技術(shù)研究群落組成及變化的報(bào)道很少，主要集中在篩選一些具有降解棉秸稈纖維素、半纖維素、木質(zhì)素功能的微生物菌株。孫美娜等[3]利用微生物學(xué)和分子生物學(xué)手段篩選和鑒定了棉稈表面附著的真菌，獲得4株具有高效纖維素分解能力的真菌。王益等[18]通過對白腐真菌和噬熱性側(cè)孢霉拮抗試驗(yàn)、白腐真菌和噬熱性側(cè)孢霉復(fù)配對棉花秸稈降解的最優(yōu)條件組合篩選試驗(yàn)、白腐真菌與噬熱性側(cè)孢霉復(fù)配在田間降解秸稈的系列研究進(jìn)行分析。侯敏等[19]篩選得到 24 株纖維素降解菌。詹發(fā)強(qiáng)等[20]從新疆棉秸稈中篩選到二株耐熱真菌，在一定培養(yǎng)條件下對棉秸稈的降解率為53%。但是利用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法選擇性很小，能夠分離到的微生物只有很小一部分，利用高通量測序技術(shù)可最大限度的保留微生物群落原有的群落組成和分布特征，可以有針對性地分離具有秸稈降解功能的土著菌。

3.3 為研究棉秸稈在自然腐解過程中菌群變化規(guī)律，采用16S rDNA高能量測序技術(shù)，對棉秸稈自然堆制過程中的分子生態(tài)學(xué)進(jìn)行分析。將腐解過程按照每7 d為一個階段進(jìn)行取樣分析，共持續(xù)28 d。菌群α多樣性指數(shù)分析顯示，隨著堆制時間的延長，7 d以后菌群多樣性與起始時相比差異顯著，而7～28 d菌群多樣性差異不顯著，說明在自然堆制條件下，7 d后棉秸稈中微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)入相對穩(wěn)定狀態(tài)。在整個堆制過程中始終存在的優(yōu)勢菌屬包括鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)、橄欖球菌屬(Olivibacter)、假黃單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)、德沃斯氏菌屬(Devosia)、根瘤菌屬(Rhizobium)。這些菌屬與徐麗萍等(2018)[21]、令利軍等(2017)[22]采用高通量測序技術(shù)研究降解玉米秸稈降解過程中發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢菌群一致，說明這些菌屬在秸稈降解過程中起到重要作用。

3.4 菌屬功能研究表明，鞘氨醇桿菌屬、橄欖球菌屬具有降解芳香族化合物功能，假黃單胞菌屬同時具有降解芳香族化合物和纖維素功能，而木質(zhì)素是一類含有氧代苯丙醇或其衍生物結(jié)構(gòu)單元的芳香性高聚物[23]，推測這幾類菌屬主要作用是降解棉秸稈中的木質(zhì)素和纖維素。德沃斯氏菌屬具有固氮和降解膠質(zhì)多糖類物質(zhì)的功能，固氮菌屬具有固氮功能。微生物對有機(jī)物降解的適宜C∶N為25∶1[24]，過高或過低均會影響微生物對秸稈的分解和秸稈養(yǎng)分的釋放。而棉秸稈C∶N在120∶1左右，極度缺乏氮素。推測具有固氮功能的細(xì)菌群落在堆制過程中能夠提供氮素，促進(jìn)棉秸稈的降解。在堆制中后期出現(xiàn)的優(yōu)勢菌群短波單胞菌屬 、Simiduia屬具有降解膠質(zhì)多糖類物質(zhì)的功能，有研究顯示，經(jīng)果膠酶處理過的棉秸稈進(jìn)行腐解[25]，后期的菌落總數(shù)與對照相比增長2倍， 推測此類菌群通過降解棉秸稈中的果膠類物質(zhì)促進(jìn)秸稈微生物群落的繁殖，促進(jìn)秸稈的腐解。在堆制起始階段豐度最高的寡養(yǎng)食單孢菌屬隨著堆制時間延長，其豐度持續(xù)下降，隨著腐解過程的進(jìn)行，棉秸稈在微生物的降解下釋放出較多的營養(yǎng)物質(zhì)，抑制了此類菌屬的增殖。

3.5 參與棉秸稈自然腐解過程的細(xì)菌種類繁多，優(yōu)勢菌群的功能集中在纖維素、木質(zhì)素、果膠類物質(zhì)以及固氮作用。相對真菌，細(xì)菌的降解功能較弱，在秸稈降解過程中真菌也具有重要的作用，將繼續(xù)對棉秸稈降解過程中的真菌群落進(jìn)行研究，探討真菌、細(xì)菌群落的協(xié)同作用，對分離棉秸稈降解微生物菌株，制備棉秸稈高效腐熟劑。

4 結(jié) 論

4.1 棉秸稈自然腐解過程中，通過細(xì)菌群落α多樣性分析、PcoA主成分分析，顯示在7 d時細(xì)菌群落多樣性在屬水平上與腐解起始階段有顯著差異，隨著腐解時間延長，菌落多樣性趨于一致。

4.2 在整個腐熟過程中存在一些優(yōu)勢屬，包括鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)、橄欖球菌屬(Olivibacter)、假黃單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)、德沃斯氏菌屬(Devosia)、根瘤菌屬(Rhizobium)，為降解纖維素、木質(zhì)素、果膠類物質(zhì)以及提供氮素營養(yǎng)。