陳心悅，哈 偉，師彥平

(1.中國科學院蘭州化學物理研究所 中國科學院西北特色植物資源化學重點實驗室 甘肅省天然藥物重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；2.中國科學院大學，北京 100039)

鐵元素是地球上含量最豐富的元素之一，也是人體必需的過渡金屬元素[1]。三價鐵離子(Fe3+)作為機體內(nèi)鐵元素的存在形式，是氧和電子的運輸載體，承擔著轉(zhuǎn)運血紅蛋白的重任，同時也作為輔助因子應(yīng)用于多數(shù)氧化還原酶反應(yīng)中[2]。Fe3+具有生物毒性，因此在機體內(nèi)的含量需嚴格控制，其細胞毒性與阿爾茨海默氏癥、亨廷頓舞蹈癥及帕金森氏癥等重大疾病密切相關(guān)[3]。機體內(nèi)Fe3+含量較低會導(dǎo)致輸送到細胞的氧氣量不足，誘發(fā)神經(jīng)疲勞、貧血[4]、肝腎損傷、免疫力下降、機體易感染等諸多問題[5]；而細胞中過量的Fe3+會催化活性氧的產(chǎn)生，從而破壞脂質(zhì)、核酸和蛋白質(zhì)[6]，因此對Fe3+含量的動態(tài)監(jiān)控至關(guān)重要。目前已有多種鐵離子的檢測方法，如原子吸收光譜法(AAS)、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)、伏安法及熒光法等[7-10]。這些方法準確靈敏，重復(fù)性高，但大多需要昂貴的儀器、復(fù)雜的樣品前處理過程以及專業(yè)的操作人員，耗時長且不能實時在線檢測，不利于Fe3+的動態(tài)監(jiān)測[1]，因此亟需研發(fā)一種價廉、簡單快速、操作方便且可實時動態(tài)監(jiān)測Fe3+的方法。

金納米粒子(AuNPs)由于其特殊的理化性質(zhì)、量子尺寸效應(yīng)及表面等離子光學特性[11]而備受關(guān)注。AuNPs具有制備方法簡單、反應(yīng)靈敏快速、能可視化分析等優(yōu)點[12]，被廣泛應(yīng)用于比色檢測體系中。近年來，基于AuNPs的Fe3+比色檢測方法的報道逐漸增多。其中，最常見的是檸檬酸鈉直接修飾的AuNPs檢測Fe3+的方法，該法通過Fe3+與AuNPs表面的羧酸根(—COO—)發(fā)生螯合作用導(dǎo)致分散的粒子聚集和溶液顏色變化。還有用多種功能基通過Au—S，Au—N或靜電作用等表面全修飾的AuNPs檢測Fe3+的方法[13]。這些方法采用表面全修飾，實現(xiàn)了特異性基團與目標物盡可能多的識別而誘導(dǎo)團聚迅速發(fā)生。但上述傳統(tǒng)的AuNPs團聚方式非定向且不可控，極易導(dǎo)致大規(guī)模團聚體在溶液中沉降和顏色迅速褪去，大大降低檢測的穩(wěn)定性、對外界環(huán)境的抗干擾能力和定量檢測的準確性，且線性范圍較窄[14-15]。另外，傳統(tǒng)體系一般采用較小粒徑的AuNPs(10～20 nm)用于Fe3+比色檢測，其靈敏度較低，不利于實際樣品中痕量Fe3+的檢測。

圖1 聚乙二醇(PEG)與檸檬酸根不對稱修飾的“兩面神”型金納米粒子(Janus AuNPs)比色檢測Fe3+的示意圖Fig.1 Principle of PEG and citrate asymmetrically modified gold nanoparticles(Janus AuNPs)-based colorimetric sensor for detection of Fe3+

為了解決上述問題，對AuNPs表面進行功能化改性，使其具備特殊的性能是重要措施之一。惰性基團聚乙二醇(PEG)能有效穩(wěn)定AuNPs，將PEG不對稱地修飾在AuNPs表面，可提高粒子在溶液中的穩(wěn)定性和抗干擾能力。已有文獻報道僅在檢測目標物的量多于AuNPs時才能實現(xiàn)比色檢測，而增大粒子尺寸，可有效降低AuNPs摩爾數(shù)量，實現(xiàn)低濃度目標物的檢測[14]。為此，本文設(shè)計制備了一種較大尺寸的PEG與檸檬酸根不對稱修飾的“兩面神”型金納米粒子(Janus AuNPs)用于Fe3+的比色檢測。如圖1所示，將檸檬酸根修飾的AuNPs(下文以AuNPs表示)固定在玻片上，利用“l(fā)igand exchange”合成策略將惰性的PEG通過巰基形成的Au—S鍵修飾在該AuNPs未與玻片接觸的面上，借用玻片掩蔽AuNPs表面檸檬酸根位點，當從玻片表面剝離后，即得到PEG與檸檬酸根修飾的Janus AuNPs。以該Janus AuNPs比色檢測Fe3+時，一方面，Janus AuNPs表面修飾的惰性PEG基團可有效穩(wěn)定大尺寸的AuNPs，提高靈敏度的同時也使其保持穩(wěn)定狀態(tài)；另一方面，限定區(qū)域的檸檬酸根識別Fe3+，使粒子以定向可控的方式發(fā)生團聚，多數(shù)粒子以二聚體或三聚體的形式穩(wěn)定存在于溶液中，有效拓寬了檢測的動態(tài)范圍。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

冷場發(fā)射型掃描電鏡(JSM-6701F，日本電子株式會社)；激發(fā)光動態(tài)散射儀(Zetasizer Nano 3600，英國馬爾文儀器有限公司)；紫外-可見分光光度計(Lambda 35，美國珀金埃爾默股份有限公司)；透射電子顯微鏡(TF20，美國FEI公司)；實驗室級超純水器(OKP-S210超低有機型，上海淶科實業(yè)發(fā)展有限公司)。

檸檬酸三鈉(北京化工工業(yè)集團有限責任公司)；三水合氯金酸(HAuCl4·3H2O)(Sigma-Aldrich公司)；巰基聚乙二醇(mPEG-SH，分子量350，上海炎怡生物科技有限公司)；3-氨基丙基-三甲氧基硅烷(C9H23NO3Si，APTES，阿拉丁生化科技股份有限公司)；FeCl3(天津市百世化工有限公司)；實驗用水均來自超純水機(18.2 MΩ· cm-1)。

1.2 金納米粒子合成

參考文獻中檸檬酸鈉還原氯金酸的方法[16-18]，通過調(diào)節(jié)還原劑用量，制備不同粒徑的AuNPs。利用冷場發(fā)射型掃描電鏡測量了30個粒子的大小，獲得AuNPs的平均尺寸約為13、25、35 nm。利用紫外分光光度計測定了各自的特征吸收峰，分別為519、524、529 nm。為了優(yōu)化AuNPs的粒徑，將一系列濃度的Fe3+(10 μL)添加到檸檬酸根穩(wěn)定的3種不同粒徑的AuNPs中(90 μL)，混合混勻后，裸眼觀察顏色變化并利用紫外分光光度計迅速記錄吸收光譜變化，以免形成團聚體發(fā)生沉降。

1.3 Janus AuNPs制備

參考文獻方法[17-18]制備PEG與檸檬酸根不對稱修飾的Janus AuNPs。其消光系數(shù)為7.66×109L/mol/cm[19]，利用朗伯比爾定律計算可得Janus AuNPs溶液濃度為0.5 nmol/L。

1.4 Janus AuNPs表征

利用激光動態(tài)散射儀記錄溶液電位值；場發(fā)射掃描電子顯微鏡獲得粒子形貌圖像；紫外分光光度計記錄反應(yīng)后紫外吸收光譜圖的變化；透射電子顯微鏡表征粒子結(jié)構(gòu)和得到能譜圖。

1.5 AuNPs粒徑優(yōu)化

將一系列濃度的Fe3+(10 μL)分別加入粒徑為13、25、35 nm的檸檬酸根修飾的AuNPs溶液中(90 μL)，利用旋渦混勻器充分混勻，裸眼觀察顏色變化并利用紫外分光光度計迅速記錄實驗結(jié)果。

1.6 Janus AuNPs比色檢測Fe3+

選擇35 nm Janus AuNPs作為最優(yōu)比色傳感器，并用于后續(xù)實驗中。將一系列梯度濃度的Fe3+(10 μL)加入新鮮制備的Janus AuNPs(90 μL,0.5 nmol/L)溶液中，利用旋渦混勻器混勻，F(xiàn)e3+終濃度分別為1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L、1 mmol/L、10 mmol/L；此外，將1 mmol/L Fe3+(10 μL)溶液分別加入35 nm AuNPs及Janus AuNPs的溶液中，考察PEG非對稱修飾前后傳感器的穩(wěn)定性，裸眼觀察溶液顏色變化并記錄紫外吸收光譜結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 AuNPs粒徑優(yōu)化

AuNPs粒徑是影響比色檢測的關(guān)鍵性因素。本文通過制備3種不同粒徑的AuNPs，考察其檢測Fe3+的靈敏度。在13、25、35 nm的檸檬酸根穩(wěn)定的AuNPs溶液中分別加入不同濃度的Fe3+得到的溶液顏色變化和紫外吸收光譜圖如圖2，圖3所示。結(jié)果顯示，13、25、35 nm檸檬酸根穩(wěn)定的AuNPs對Fe3+的裸眼檢出限分別為500、250、1 μmol/L。隨著粒徑的增大，F(xiàn)e3+的裸眼檢出限從500 μmol/L降低至1 μmol/L，紫外光譜圖的變化同樣證實了這一結(jié)果。說明增大AuNPs粒徑可顯著提高比色檢測Fe3+的靈敏度。雖然35 nm的上述AuNPs對Fe3+的檢測反應(yīng)靈敏，檢出限低，但由于粒子易形成大規(guī)模團聚體而發(fā)生沉降，導(dǎo)致溶液顏色不斷變淺，30 min內(nèi)溶液顏色即變?yōu)闊o色透明，紫外分光光度計難以在恰當?shù)臅r間內(nèi)捕捉光譜信號的變化，不能準確定量目標物(圖3)。本文以玻片為載體，制備了惰性基團PEG與檸檬酸根不對稱修飾的大粒徑Janus AuNPs，實現(xiàn)了粒子的定向聚集，同時利用空間位阻使團聚體穩(wěn)定存在于溶液中。

2.2 Janus AuNPs的表征

對所制備的Janus AuNPs進行表征。如圖4A所示，固定在玻片上的35 nm Janus AuNPs表面呈紫色，與AuNPs溶液顏色基本一致，說明帶負電荷的AuNPs通過靜電作用成功修飾在玻片上。AuNPs和Janus AuNPs的電位值結(jié)果如圖4B所示，AuNPs電位值約為-44 mV，Janus AuNPs電位值約為-20 mV，說明修飾后不帶電荷的PEG基團占據(jù)了粒子表面大部分檸檬酸根位點，使粒子表面電負性減弱。利用紫外分光光度計得到35 nm AuNPs和Janus AuNPs的吸收光譜圖(圖4C)，35 nm AuNP在529 nm處具有特征等離子體共振峰，表面非對稱修飾PEG后，特征吸收峰紅移到536 nm。這是由于PEG在AuNPs表面產(chǎn)生了致密的單分子層，直接影響了局域表面等離子體共振的散射半徑，從而顯著增加了粒子表面局部折射率所致[20-21]。

圖2 13 nm(A)和25 nm(B)檸檬酸根穩(wěn)定的AuNPs檢測不同濃度Fe3+的照片及吸收光譜圖，以及不同粒徑AuNPs體系中吸光度比值隨Fe3+濃度變化的趨勢(C)Fig.2 Photographs and optical absorption spectra of 13 nm(A) and 25 nm(B) citrate-stabilized AuNPs in the presence of different concentrations of Fe3+ and the calibration curves of absorption ration versus concentrations of Fe3+(C)concentrations of Fe3+：A:0 μmol/L,500 μmol/L,1 mmol/L,10 mmol/L；B:0 μmol/L,250 μmol/L,500 μmol/L,1 mmol/L,10 mmol/L；A0 represents the absorbance of the absorption peak of blank AuNPs while A represents the intensity of the newly generated absorption peak after adding Fe3+(13 nm AuNPs,A/A0=A790/A519;25 nm AuNPs,A/A0=A820/A524)

對比了AuNPs，PEG全修飾的AuNPs(PEG-AuNPs)及Janus AuNPs的TEM透射電鏡圖(圖5)，由圖可知，AuNPs表面沒有PEG分子層(圖5A)，PEG修飾的AuNPs表面明顯包裹著1～2 nm厚度的PEG分子層(圖5B)；而Janus AuNPs形成的三聚體在有限區(qū)域發(fā)生定向聚集，表面大部分區(qū)域包裹PEG分子層(圖5C)。對比結(jié)果說明PEG在Janus AuNPs表面成功實現(xiàn)了非對稱修飾。進一步觀察能譜圖(圖6)，發(fā)現(xiàn)AuNPs表面含有氧元素而不含硫元素，說明只存在檸檬酸根，而Janus AuNPs表面有硫元素和氧元素，說明PEG已通過Au—S鍵修飾到粒子表面。上述表征結(jié)果證實了Janus AuNPs為惰性基團PEG非對稱修飾的粒子結(jié)構(gòu)，其表面檸檬酸根可在限定區(qū)域與Fe3+產(chǎn)生螯合作用，誘導(dǎo)粒子定向聚集，實現(xiàn)目標物穩(wěn)定、準確的定量檢測。

圖5 35 nm AuNPs(A)、PEG-AuNPs(B)及Janus AuNPs(C)的TEM透射電鏡圖Fig.5 Transmission electron microscopyic(TEM) images of 35 nm AuNPs(A),PEG-AuNPs(B) and Janus AuNPs(C)

2.3 Janus AuNPs比色檢測Fe3+的靈敏度

探討Janus AuNPs比色檢測Fe3+的靈敏度并與35 nm AuNPs在相同條件下進行對比。在Janus AuNPs溶液中加入系列梯度濃度(1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L、1 mmol/L、10 mmol/L)的Fe3+，溶液顏色由紫色明顯變化到灰色，同時其在536 nm處的特征吸收峰吸光度值逐漸降低，因粒子團聚形成的750 nm處的吸光度值逐漸增加，結(jié)果如圖7A所示。掃描電鏡圖(圖7B)顯示，當加入1 mmol/L目標物后Janus AuNPs大多以定向可控的方式進行團聚，形成二聚體或三聚體并穩(wěn)定存在于溶液中，出現(xiàn)750 nm處的吸收峰。隨著Fe3+濃度的增加，形成的寡聚體數(shù)目增加，750 nm處吸光度值逐漸上升。根據(jù)紫外光譜圖可得到750 nm與536 nm處的吸光度比值A(chǔ)750/A536(y)與Fe3+濃度(x)在1 μmol/L～10 mmol/L范圍的校正曲線，二者在較寬的濃度范圍內(nèi)呈線性，線性方程為y=0.129x+0.317，相關(guān)系數(shù)r為0.98(圖7C)。根據(jù)檢出限計算公式LOD=3σ/S得到LOD為715 nmol/L，比同等條件下13 nm AuNPs檢出限降低500倍左右。在相同條件下將同等濃度的Fe3+加入到35 nm AuNPs溶液中，結(jié)果如圖3所示。當加入1 μmol/L低濃度Fe3+時，溶液顏色迅速改變，粒子發(fā)生團聚，說明增大粒子尺寸可顯著提高檢測靈敏度。由于表面未修飾PEG基團，AuNPs以非定向不可控的方式發(fā)生團聚[17]，形成如圖3B所示的易于發(fā)生沉降的大規(guī)模團聚體。當Fe3+濃度高于10 mmol/L時，AuNPs溶液顏色變化基本一致，均由紫色變?yōu)榛疑?，?50 nm處吸光度值基本保持恒定(圖3A，3C)。該結(jié)果說明團聚行為已達到飽和，無新的團聚體形成。根據(jù)紫外光譜圖中得到吸光度比值A(chǔ)750/A529與Fe3+濃度在1 μmol/L～10 mmol/L的變化曲線，發(fā)現(xiàn)二者呈非線性的變化趨勢，無法得到線性方程用于準確定量目標物濃度(圖3C)。這是由于粒子以非定向方式團聚后形成的大規(guī)模團聚體極易發(fā)生沉降，導(dǎo)致溶液顏色迅速消失，紫外分光光度計難以在恰當?shù)臅r間捕捉檢測信號。但Janus AuNPs團聚后粒子大多以寡聚體形式存在，團聚體數(shù)目隨著Fe3+濃度的上升而不斷增加，使溶液顏色穩(wěn)定變化并得到相應(yīng)的紫外吸收光譜，可用于目標物的準確定量。

2.4 Janus AuNPs比色檢測Fe3+的穩(wěn)定性

對比研究了Janus AuNPs與AuNPs傳感器的穩(wěn)定性。在同樣條件下將1 mmol/L Fe3+分別加入兩類傳感器中，監(jiān)測溶液顏色和吸光度值A(chǔ)750隨時間的變化，結(jié)果如圖8所示。AuNPs溶液中粒子迅速團聚形成大規(guī)模團聚體，且溶液顏色迅速變?yōu)榛疑?50 nm處的吸光度值在10 s內(nèi)迅速上升，但1 min后即發(fā)生沉降，溶液顏色不斷褪去，吸光度值亦迅速下降，60 min后溶液已呈無色透明狀態(tài)，吸光度值接近于零(圖8A，8C)。相比之下，Janus AuNPs溶液中團聚體多以寡聚體形式存在，溶液顏色逐漸變?yōu)榛疑?，?50 nm處的吸光度值穩(wěn)定變化，5 min內(nèi)即達到恒定值，溶液顏色和吸收峰值在60 min內(nèi)無明顯下降，形成的團聚體不易沉降(圖8B,8C)。這是由于PEG對AuNPs具有很強的穩(wěn)定作用，不僅能維持AuNPs寡聚體的穩(wěn)定還能抵抗外界環(huán)境的干擾。上述結(jié)果足以證實惰性的PEG基團在AuNPs表面的非對稱修飾極大地提高了傳感器的穩(wěn)定性。此外，與文獻中利用納米粒子比色傳感器檢測Fe3+的工作相比(表1)，本方法檢出限低，線性范圍寬。

圖7 Janus AuNPs檢測不同濃度Fe3+的照片和吸收光譜圖(A)，Janus AuNPs檢測1 mmol/L Fe3+的掃描電鏡圖(B)與檢測不同濃度Fe3+時的吸光度比值與濃度的動態(tài)響應(yīng)范圍(C)Fig.7 Photographs and absorption spectra of Janus AuNPs after the addition of different concentrations of Fe3+(A)，the representative SEM image of Janus AuNPs for detection of 1 mmol/L Fe3+(B) and the calibration curve of absorption ratio versus concentrations of Fe3+(C)concentrations of Fe3+:0 μmol/L,1 μmol/L,10 μmol/L,100 μmol/L,1 mmol/L,10 mmol/L

Nanoparticle probeLinear range detected by UV-Vis spectra(μmol/L)Detection limit(μmol/L)YearPyrophosphate functionalized AuNPs10～60 5.6 2011[6]Label-free AuNPs3.84～19.23 1.923 2013[22]β-Alanine dithiocarbamate functionalized AgNPs2.49～69.8 6.082014[23]Acetyl salicylic acid derived AuNPs0.3～2.1 0.0512018[24]p-Phenylenediamine functionalized AgNPs0.99～11.5 1.29 2013[25]Oxamic acid and p-aminobenzoic acid functionalized AuNPs10～400 5.832016[26]Polyethylene glycol(PEG) and citrate asymmetrically modified 35 nm AuNPs1～10 0000.715This work

3 結(jié) 論

本文設(shè)計制備了一種新型的惰性PEG與檸檬酸根不對稱修飾的大粒徑Janus AuNPs比色傳感器。該傳感器可顯著提高Fe3+檢測的靈敏度，比傳統(tǒng)小粒徑AuNPs的檢出限降低500倍左右；其原理在于PEG基團占據(jù)了AuNPs表面的大部分位點，剩余少量的檸檬酸根位點與Fe3+產(chǎn)生螯合，在限域里誘導(dǎo)粒子發(fā)生定向可控聚集，并形成寡聚體存在于溶液中，從而顯著提高了比色檢測的穩(wěn)定性，并拓寬了線性范圍。