鐘碧疆

(廈門古龍食品有限公司，福建 廈門 361000)

醬油起源于中國，是一種具有獨特醬香的調味品。醬油中含有多肽、氨基質[1]。目前，我國的醬油生產工藝主要為低鹽固態(tài)發(fā)酵法和高鹽稀態(tài)發(fā)酵法[2]。低鹽固態(tài)法釀造的醬油具有生產周期短、產量大等特點，占我國醬油產量的90%左右。高鹽稀態(tài)法釀造的醬油采用控溫發(fā)酵并在發(fā)酵過程中添加外源菌種，發(fā)酵周期一般為4～6個月，品質優(yōu)于低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油，是釀造中、高品質醬油的發(fā)展趨勢[3]。然而，高鹽稀態(tài)發(fā)酵法與傳統日曬夜露釀造法(6～12個月)相比縮短了周期，因此醬油的色澤、風味等仍存在一定差距[4]。傳統釀造過程中醬醪發(fā)酵采用高鹽稀態(tài)、日曬夜露和微生物復合發(fā)酵，醬油具有色澤紅褐、體態(tài)濃稠、醬香醇厚等特點[5]。本文對醬油日曬夜露高鹽稀態(tài)發(fā)酵過程中的品質變化規(guī)律及其抗氧化特性進行了系統研究，以期為生產高品質醬油提供一定的理論和技術指導。

1 材料

1.1 試驗材料及試劑

黃豆：福建北大荒綠色食品有限公司；食用鹽：福建鹽業(yè)有限責任公司；2,2-聯苯基-1-苦基肼基(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH)、鄰苯二甲醛(OPA)、9-芴甲氧羰基(FMOC)、氨基酸標準品、菲咯嗪：Sigma公司；磷酸氫二鈉、四硼酸鈉：Aladdin公司；乙腈、甲醇：Fisher Scientific公司；水楊酸、硫酸亞鐵：國藥集團化學試劑有限公司；米曲霉菌種：實驗室保藏。

1.2 主要儀器與設備

PHS-25C pH計 上?？祪x儀器有限公司；UV1801紫外-可見分光光度計 瑞利公司；WYT-4糖度計 泉州中友光學儀器有限公司；MA45水分測定儀 美國OHAUS公司；1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司；Kjeltec凱氏定氮儀 丹麥FOCC公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 醬油的制作工藝

醬油生產工藝流程：黃豆→去雜→浸泡→蒸煮→冷卻、出鍋→加種曲和面粉→裝匾制曲→曲室培養(yǎng)→入陶缸日曬夜露發(fā)酵(發(fā)酵1年成熟，抽油沉淀殺菌即為成品)→發(fā)酵過程中抽油取樣于4 ℃冰箱貯藏待測→過濾(快速定性濾紙)→指標檢測。

1.3.2 基本理化指標的測定

pH：每次測定前采用標準液(pH 4.01～7.00)校準，3次讀數取平均值。

色率：參考孫宇霞和李丹等的方法[6,7]，使用最小二乘方回歸法得到標準方程：y=0.2672x-0.0493(R2=0.9994)，式中：y為色率，x為吸光值A0。樣品測定時將醬油原液稀釋到一定倍數k，用分光光度計，以蒸餾水作為空白，測定樣品在520 nm波長下的吸光度A0，將A0值乘以稀釋倍數k后帶入上式得色率。

色深物質含量：參考李瑩等[8]的方法，將醬油稀釋至一定倍數，測定其在420 nm處的吸光值A420，將A420乘以稀釋倍數得色深物質。

紅色指數和黃色指數：參考鄭海燕和秦祖贈等的方法[9,10]，將過濾后的醬油樣品稀釋10倍，分別在波長460，510，610 nm下測定吸光值A1、A2、A3，紅色指數由10×lg(A2/A3)表示，黃色指數由10×lg(A1/A3)表示。

鹽度：參考GB 18186-2000《釀造醬油》中氯化鈉的測定方法。

可溶性無鹽固形物：參考胡志芬等[11]的方法，采用糖度計測定可溶性固形物含量并減去氯化鈉含量，即為可溶性無鹽固形物含量。

總酸：參考ZB/X 66037-87《總酸測定法》測定。

氨基酸態(tài)氮：采用甲醛滴定法[12]。

1.3.3 游離氨基酸的測定

參考安捷倫HPLC氨基酸分析方法。具體步驟為：準確吸取500 μL醬油樣品于2 mL離心管中，加入等體積的10%三氯乙酸(TCA)震蕩均勻，水浴30 min后12000 g離心15 min，上清經0.22 μm濾膜過濾，樣品經過鄰苯二甲醛(OPA)和9-芴甲氧羰基(FMOC)在線衍生后供高效液相色譜分析。色譜條件：色譜柱條件：AdvanceBio-AAA(4.6 mm×100 mm)，粒徑2.7 μm；流動相A：10 mmol/L磷酸氫二鈉和10 mmol/L四硼酸鈉，pH 8.2；流動相B：甲醇∶乙腈∶水為45∶45∶10；流速1.5 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長338，262 nm。脯氨酸檢測波長為262 nm，其他氨基酸檢測為338 nm。標準曲線的制作：將氨基酸混合標準品(2.5 mmol/L)用0.1 mol/L的HCl稀釋成0.1，0.5，1，2.5 mmol/L的混合標準溶液，經在線衍生后供高效液相色譜分析。

1.3.4 醬油產物分子質量分布的測定

醬油樣品分子量的測定參照GB/T 22729-2008《海洋魚低聚肽粉》中測定多肽分子量的方法。其中，標準樣品為：小清蛋白,11950 Da；多肽, 5618 Da；桿菌肽, 1423 Da; GGAT, 451 Da; 酪氨酸，181 Da。色譜條件：所用色譜柱為TSK gel G2000 SWXL (7.8 mm×300 mm)；流動相為乙腈∶水∶三氟乙酸為45∶55∶0.1；進樣體積為10 μL；流速為0.5 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為220 nm。所得數據應用GPC Offline軟件進行分析，確定樣品分子質量分布范圍。

1.3.5 醬油樣品抗氧化的測定

DPPH自由基(DPPH·)清除率的測定：參照Intarasirisawat等[13]的方法并稍作修改，400 μL醬油稀釋樣品和400 μL 0.1 mmol/L DPPH溶液混勻后避光保存20 min，反應結束后5000 g離心10 min，吸取上清在517 nm處測定吸光度。其中，對照組以去離子水代替樣品，空白組用無水乙醇代替DPPH。EC50(mg/mL)表示DPPH·清除率為50%時所需要的樣品干燥物濃度。計算公式：DPPH·清除率(%)=[1-(A樣-A空)/A對]×100，式中：A樣為樣品組所測定的吸光度，A空為空白組所測定的吸光度，A對為對照組所測定的吸光度。

·OH清除能力的測定：參照Saidi等[14]的方法并適當修改，取200 μL樣品、200 μL 9 mmol/L FeSO4、200 μL 9 mmol/L水楊酸和200 μL 8.8 mmol/L H2O2，定容至2.0 mL后于37 ℃條件下反應10 min，測定波長為510 nm。IC50(mg/mL)表示清除50%的羥自由基所需的樣品干燥物濃度。計算公式為：·OH清除率(%)=[(A對-A樣)/A對]×100，式中：A樣為樣品的吸光值，A對為對照組的吸光值。

1.3.6 感官評定

參考馮杰等[15-17]的方法，感官評定由8名實驗室專業(yè)人士組成，分別從色澤、氣味、滋味和體態(tài)方面進行評分，評定過程為先觀色，再聞香，后品味，最終取8人評分結果的平均值為試驗結果，感官評定的項目權重和評分分值范圍見表1和表2。

表1 醬油感官評分項目的權重分配Table 1 Weight allocation of soy sauce sensory scoring items %

表2 醬油感官評定評分表Table 2 Soy sauce sensory evaluation scale

2 結果與分析

2.1 醬油釀造過程中成分的變化情況

由GB 18186-2000《釀造醬油》可知，色澤、可溶性無鹽固形物、鹽度、氨基酸態(tài)氮等指標是評價醬油等級的重要指標。

醬油發(fā)酵過程中色澤指標變化情況見表3。

表3 醬油釀造過程中色澤指標變化情況Table 3 Changes of color indexes in soy sauce brewing process

注：表中均值上標不同字母表示均值差異(P<0.05)。

由表3可知，醬油的色率、色深物質隨著發(fā)酵時間的延長而不斷增加，紅色指數在發(fā)酵前3個月增加明顯，3個月后增加不顯著；黃色指數在發(fā)酵前5個月增加明顯，后期增加不明顯(P<0.05)。醬油蛋白質分解主要在第1個月，且醬油發(fā)酵過程被分解的還原糖、氨基酸、肽及蛋白質反應生成氨基糖，并經過一系列的化學反應，最終生成呈現棕紅色的類黑色素。

醬油發(fā)酵過程中理化指標變化情況見表4。

表4 醬油釀造過程中基本理化指標變化情況Table 4 Changes of basic physical and chemical indexes in soy sauce brewing process

注：表中均值上標不同字母表示均值差異(P<0.05)。

隨著發(fā)酵時間從1～12個月，氨基酸態(tài)氮略微增加但不顯著(P<0.05)，可能是醬油中蛋白質的分解主要發(fā)生在1個月內?？偹崧晕⒃黾拥伙@著(P<0.05)，發(fā)酵前5個月pH明顯降低后變慢(P<0.05)，可能與日曬夜露為敞開式發(fā)酵，發(fā)酵過程中空氣中的野生型乳酸和酵母菌等耐鹽耐酸型菌落在發(fā)酵前期逐漸增多，產酸菌產酸有關。該醬油為日曬夜露式發(fā)酵，發(fā)酵過程中水分不斷蒸發(fā)，并不斷補充食鹽水，故醬油的鹽度逐漸增加。在補鹽水過程中，鹽度增加，可溶性無鹽固形物略微降低[18]。

2.2 醬油中氨基酸含量

不同釀造階段醬油中的氨基酸含量變化情況見表5。

表5 發(fā)酵階段醬油中的游離氨基酸組成分析Table 5 Analysis of free amino acids in soy sauce during fermentation g/dL

續(xù) 表

隨著發(fā)酵時間的延長，醬油中游離氨基酸的總量不斷上升，12月份的值最高，含量均在8 g/dL以上。該結果表明醬油中蛋白質的分解主要發(fā)生在1個月內，后期增加不顯著。同時，天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸隨著發(fā)酵時間的延長逐漸增加，組氨酸、精氨酸和賴氨酸則減少。為了進一步探討醬油的呈味性，對鮮味氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸)、甜味氨基酸(絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、蘇氨酸)；苦味氨基酸(組氨酸、精氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸)進行分類討論[19]。結果發(fā)現發(fā)酵1～12個月，鮮味氨基酸含量呈波動式上升，總增加20.45%，占總氨基酸的比例由16.00%增加至18.60%；甜味氨基酸含量呈上升趨勢，總增加16.00%，占總氨基酸的比例由21.21%增加至23.74%；而苦味氨基酸含量降低3.98%，占總氨基酸的比例由48.72%降至45.14%，降低3.58%。此結果表明，在發(fā)酵過程中，醬油的滋味變好。

2.3 醬油產品分子量成分測定

采用高效凝膠過濾法對不同釀造階段的醬油進行分子質量分布測定，并應用GPC Offline軟件進行分析。

表6 不同釀造階段醬油分子量分布Table 6 Molecular weight distribution of soy sauce at different brewing stages

結果顯示，隨著發(fā)酵時間的延長，醬油多肽的變化不明顯，各月份醬油多肽小于1000 Da均大于95%。該結果表明日曬夜露釀造醬油過程中，大豆蛋白的分解可能主要集中在第1個月內，結果與氨基酸態(tài)氮、固形物、氨基酸含量變化一致。

2.4 醬油成分抗氧化活性

DPPH可用來評價抗氧化物質的供氫能力，在517 nm處有特征吸收峰，可根據吸光度值來評價對自由基的清除能力。

圖1 不同釀造階段醬油的DPPH·清除率(A) 和·OH清除率(B)變化情況Fig.1 The DPPH·scavenging rate(A)and·OH scavenging rate(B)of soy sauce at different brewing stages

由圖1中A可知，日曬夜露高鹽稀態(tài)釀造醬油具有較強的DPPH·清除能力。隨著釀造時間的延長，醬油產品DPPH·清除率逐漸加強。DPPH·清除能力的EC50由1個月時的1.66 mg/mL降低至0.66 mg/mL。同時，·OH清除率研究表明隨著醬油釀造時間的延長，IC50下降明顯，由1個月的0.50 mg/mL降至12個月的0.20 mg/mL。該結果表明日曬夜露釀造的醬油具備較好的抗氧化性。

2.5 感官分析

對不同發(fā)酵月份的醬油進行感官評分，評分結果見表7。

表7 醬油的感官評價特性Table 7 Sensory evaluation characteristics of soy sauce

注：表中均值上標不同字母表示均值差異(P<0.05)。

結果表明，隨著發(fā)酵時間的延長，醬油體態(tài)愈濃厚，色澤鮮艷度及光澤度愈好，醬香及酯香愈濃，滋味鮮美，醇厚度愈好，評分結果同色值、色率、紅色指數、黃色指數及鮮、甜味氨基酸含量隨釀造時間延長總體上升趨勢相一致。

3 結論

日曬夜露式高鹽稀態(tài)釀造醬油在發(fā)酵過程中，醬油的色率、色深物質隨著時間的延長而增加，紅色指數在發(fā)酵前3個月增加明顯。在發(fā)酵前5個月，黃色指數明顯增加，且pH明顯降低(P<0.05)。氨基酸態(tài)氮及總酸略微增加但不顯著(P<0.05)。

日曬夜露高鹽稀態(tài)釀造醬油，對比發(fā)酵1個月的原油及發(fā)酵12個月的成熟原油，鮮味氨基酸含量增加20.45%，甜味氨基酸含量增加16.00%，苦味氨基酸含量降低3.98%，醬油滋味變好，與感官評價結果一致。

隨著發(fā)酵時間增加，日曬夜露高鹽稀態(tài)發(fā)酵法醬油DPPH·清除能力的EC50及·OH清除率的IC50降低明顯，體外抗氧化能力逐漸增強。