舒慧萍，張冬星，張海月，單曉楓*，錢愛東*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 長(zhǎng)春 130118；2.敦化市畜牧業(yè)管理局，吉林 敦化 133700)

目前，常用食品益生菌中以乳酸菌最為常見，乳酸菌在自身代謝生長(zhǎng)過程中分泌的有機(jī)酸和細(xì)菌素能夠抑制食品中病原菌的生長(zhǎng)繁殖[1]，防止食品腐敗，延長(zhǎng)保質(zhì)期[2]，因而可將乳酸菌應(yīng)用于新型天然食品防腐劑的研發(fā)，以代替化學(xué)防腐劑。同時(shí)，乳酸菌在發(fā)酵過程中能夠降低pH值，進(jìn)而改善蔬菜制品的風(fēng)味，可作為風(fēng)味和口感增強(qiáng)劑[3，4]，從而減少香精、香料的使用，使產(chǎn)品更趨于天然、綠色[5]。

而發(fā)酵泡菜作為一種由乳酸發(fā)酵的蔬菜制品，具有悠久的歷史，并已被世界公認(rèn)為一種健康的發(fā)酵食品。參與發(fā)酵的乳酸菌在發(fā)酵過程中起主導(dǎo)作用，對(duì)人體具有改善腸道不適，增強(qiáng)結(jié)腸功能與穩(wěn)定性，降低血液膽固醇以及抗癌等保健作用[6]，且能夠提高蔬菜制品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，基于乳酸菌的上述生物學(xué)特性，使其在食品行業(yè)中被廣泛應(yīng)用。因而本實(shí)驗(yàn)旨在從發(fā)酵泡菜中分離獲得具有抑菌特性及抗逆性的乳酸菌優(yōu)勢(shì)菌株，為日后實(shí)際應(yīng)用該乳酸菌提供了理論基礎(chǔ)，以期運(yùn)用到食品中提高食品品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌(Escherichiacoli)CVCC233、CVCC236、CVCCK88；沙門氏菌(Salmonella)CVCC3383、CVCC3780、CVCC3775、CVCC503、CVCC79102；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CVCC-519：以上均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

乳酸菌瓊脂培養(yǎng)基(MRS瓊脂)、Luria-Bertani瓊脂培養(yǎng)基(LB瓊脂)：均購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；革蘭氏染色試劑盒、生理生化管：購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒及PCR擴(kuò)增試劑盒等：均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品收集與保存

樣品為購(gòu)自延邊朝鮮族的自家發(fā)酵泡菜，低溫運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，于-80 ℃下甘油保存。

1.2.2 乳酸菌的分離純化

稱取1 g發(fā)酵泡菜與10 mL的PBS充分混合均勻，對(duì)混合液進(jìn)行連續(xù)十倍倍比稀釋，將不同梯度稀釋液涂布至MRS固體培養(yǎng)基表面，37 ℃下厭氧靜置培養(yǎng)72 h[7]，觀察不同細(xì)菌形態(tài)，挑取邊緣整齊，顏色為乳白色的圓形實(shí)心單菌落于MRS肉湯中，37 ℃厭氧靜置培養(yǎng)48 h，在MRS固體平板上對(duì)其進(jìn)行劃線純化。

1.2.3 生理生化實(shí)驗(yàn)

首先將純化的菌株進(jìn)行革蘭氏染色及過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)，選取革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性菌進(jìn)行硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、吲哚(靛基質(zhì))實(shí)驗(yàn)、硫化氫實(shí)驗(yàn)和糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第八版)[8]、《乳酸細(xì)菌的分類鑒定與實(shí)驗(yàn)方法》及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行菌種的綜合判定。

1.2.4 乳酸菌分子鑒定

提取分離株DNA，采用16S rDNA通用引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)，PCR反應(yīng)體系參照文獻(xiàn)[9]，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)16S rDNA 擴(kuò)增片段。由吉林長(zhǎng)春庫(kù)美有限公司對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。將所得16S rDNA序列結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的相關(guān)序列進(jìn)行相似性分析，并通過Blast 程序多重比對(duì)，采用Mega 6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[10]。

1.2.5 抑菌實(shí)驗(yàn)1.2.5.1 牛津杯法

本實(shí)驗(yàn)采用牛津杯法。在董雨馨等人的操作方法上進(jìn)行改進(jìn)，具體操作方法如下：將已活化的指示菌株大腸桿菌(Escherichiacoli)CVCC233、CVCC236、CVCCK88；沙門氏菌(Salmonella)CVCC3383、CVCC3780、CVCC3775、CVCC503、CVCC79102和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CVCC-519的濃度調(diào)整至106cfu/mL，涂布于LB平板，采用牛津杯法進(jìn)行打孔，向牛津杯中加入分離株培養(yǎng)上清，于37 ℃下培養(yǎng)12 h，以加入等量MRS液體作為對(duì)照，量取并記錄抑菌圈直徑[11]。

抑菌活性判定標(biāo)準(zhǔn)為：12.00 mm≥抑菌圈直徑>8.00 mm表示弱抑菌性，16 mm≥抑菌圈直徑>12 mm表示中度抑菌性，20 mm>抑菌圈直徑>16 mm表示較強(qiáng)抑菌性，抑菌圈直徑 ≥20 mm表示強(qiáng)抑菌性[12]。

1.2.5.2 共培養(yǎng)法

通過共培養(yǎng)法，進(jìn)一步研究乳酸菌的胞外上清液對(duì)病原菌的抑制作用。將已活化的濃度為106cfu/mL的指示菌按1%接種至LB液體培養(yǎng)基中，同時(shí)按5%接入分離株濾過上清液，于37 ℃震蕩培養(yǎng)12 h，以接入等量PBS緩沖溶液作為對(duì)照，采用平板計(jì)數(shù)法記錄指示菌的活菌數(shù)量，并計(jì)算指示菌的存活率。存活率按下式計(jì)算：

存活率=log(實(shí)驗(yàn)組菌液濃度)/log(對(duì)照組菌液濃度)×100%。

1.2.6 抗逆性實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)研究了分離株對(duì)酸、膽鹽的耐受性，在Mattika等人的操作方法上進(jìn)行改進(jìn)，具體操作方法如下：將活化好的分離株菌液濃度調(diào)整至106cfu/mL，按10%接入pH 2.0的 MRS肉湯中，以接入等量pH 6.8的PBS作為對(duì)照，37 ℃下厭氧靜置培養(yǎng)2 h；另按10%接入含0.3%膽鹽的MRS-bile肉湯培養(yǎng)基中，以接入等量PBS作為對(duì)照，37 ℃下厭氧靜置培養(yǎng)4 h，采用平板計(jì)數(shù)法分別記錄活菌數(shù)量，并計(jì)算存活率[13]，存活率按下式計(jì)算：

存活率=log(實(shí)驗(yàn)組菌液濃度)/log(對(duì)照組菌液濃度)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落及菌體形態(tài)觀察

實(shí)驗(yàn)獲得3株生長(zhǎng)迅速的疑似乳酸菌菌株，分別命名為L(zhǎng)1、L2和L3，其菌落形態(tài)見圖1，可見形態(tài)為邊緣整齊、中央有突起或扁平的乳白色圓形菌落，大小不一。

圖1 分離株菌落形態(tài)觀察Fig.1 Observation on colony morphology of isolated strains

注: A為菌株L1;B為菌株L2;C為菌株L3。

分離株革蘭氏染色結(jié)果見圖2。分離株為G+菌，呈短桿狀，單個(gè)或呈短鏈狀排列。

圖2 分離株革蘭染色結(jié)果Fig.2 Gram staining results of isolated strains

注：A為菌株L1;B為菌株L2;C為菌株L3。

2.2 理化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

生理生化鑒定結(jié)果顯示：過氧化氫實(shí)驗(yàn)中3株分離株均無氣泡產(chǎn)生，表明呈過氧化氫陰性；滴加硝酸鹽還原試劑甲、乙液后，不變色；加入微量鋅粉后，L1、L2、L3均呈紅色，表明硝酸還原陰性；明膠液化實(shí)驗(yàn)結(jié)果：4 ℃呈固態(tài)，即明膠液化陰性；滴加靛基質(zhì)試劑后反應(yīng)呈黃色，表明吲哚陰性；與硫化氫反應(yīng)后呈無色，表明硫化氫陰性；綜上，L1、L2、L3均不能發(fā)生過氧化氫實(shí)驗(yàn)、硝酸還原實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)，均不能產(chǎn)生吲哚及硫化氫，由此可初步判定3株菌為乳酸桿菌屬。進(jìn)一步進(jìn)行糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 分離株生理生化測(cè)定結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical determination results of isolated strains

注：“+”表示菌株反應(yīng)呈陽性；“-”表示菌株反應(yīng)呈陰性。

2.3 乳酸菌分子鑒定

圖3 分離株16S rDNA序列擴(kuò)增檢測(cè)Fig.3 Detection of 16S rDNA sequence of isolated strains by amplification

注：M為DL-2000 Markers;1～3為分離株L1、L2、L3 的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖4 分離株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.4 The phylogenetic trees of isolated strains

分離株16S rDNA 基因PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖3?？梢娫?500 bp左右出現(xiàn)條帶。對(duì)分離株L1、L2、L3的16S rDNA基因進(jìn)行序列測(cè)定及采用Mega 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，均分別與Lactobacillusfermentum，Lactobacilluscasei，Lactobacillusplantarum位于同一發(fā)育分支，且與上述模式菌株同源性為96%、99%、89%(見圖4)。經(jīng)理化及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果綜合判定，分離株L1、L2、L3分別為發(fā)酵乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌。

2.4 抑菌實(shí)驗(yàn)

2.4.1 牛津杯法抑菌實(shí)驗(yàn)

分離株培養(yǎng)上清液對(duì)指示菌的抑制作用見表2。經(jīng)測(cè)定，L1、L2、L3培養(yǎng)上清液均能對(duì)指示菌表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，其中L2、L3對(duì)9株指示菌表現(xiàn)出了強(qiáng)抑制性，抑菌圈直徑最大分別達(dá)到25，23 mm；而L1與L2、L3相比，對(duì)指示菌的抑制作用相對(duì)較弱，最大抑菌圈達(dá)16 mm。

表2 分離株對(duì)指示菌的抑制效果Table 2 The inhibition effect of isolated strains on indicator bacteria

注：L1′、L2′、L3′為乳酸菌過濾培養(yǎng)上清液。抑菌圈直徑包含牛津杯外徑(7.80 mm)；“+”為抑菌圈直徑8.00～12.00 mm；“++”為抑菌圈直徑12.00～16.00 mm；“+++”為抑菌圈直徑16.00～20.00 mm；“++++”為抑菌圈直徑20.00～24.00 mm。

2.4.2 共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

分離株培養(yǎng)上清液分別與指示菌菌液進(jìn)行共培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。

圖5 分離株與指示菌共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.5 The results of co-culture test for isolated strains and indicator bacteria

注：A為 L1上清液與指示菌共培養(yǎng);B為L(zhǎng)2上清液與指示菌共培養(yǎng);C為L(zhǎng)3上清液與指示菌共培養(yǎng)。

大腸桿菌、沙門氏菌及金黃色葡萄球菌與L2、L3培養(yǎng)上清液共培養(yǎng)后，其存活率可分別降至66.31%、56.2%、72.07%與65.69%、56.18%、72.75%，可見L2、L3培養(yǎng)上清液對(duì)指示菌有較強(qiáng)的抑制作用，而指示菌菌液與L1培養(yǎng)上清液共培養(yǎng)后存活率分別為85.98%、97.41%、88.73%，可見L1培養(yǎng)上清液對(duì)指示菌的抑制作用相對(duì)L2、L3較弱，與打孔法抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

2.5 抗逆性實(shí)驗(yàn)

分離株L1、L2、L3抗逆性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6。

圖6 分離株抗逆性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.6 The results of stress tolerance test of isolated strains

注：A為分離株對(duì)pH 2的耐受性；B為分離株對(duì)0.3%膽鹽的耐受性。

分離株L1、L2、L3在pH 2的環(huán)境中培養(yǎng)2 h后，存活率分別為82.58%、48.34%、48.49%，可見L1相較L2、L3差異極顯著，耐酸性能力更高；在含0.3%膽鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h后，存活率分別為66.56%、54.8%、70.62%，可見L1、L2、L3均具有較強(qiáng)的耐膽鹽能力，其中L3的耐膽鹽能力最強(qiáng)，且與L1、L2相比差異極顯著。

3 結(jié)論

乳酸菌作為發(fā)酵劑被廣泛應(yīng)用于泡菜、酸奶、發(fā)酵肉制品及功能性食品等食品工業(yè)中，因而本實(shí)驗(yàn)從可食用泡菜中分離乳酸菌菌株，具有一定的食品安全性。杜曉華等從四川發(fā)酵泡菜中獲得1株植物乳桿菌；周光燕等從發(fā)酵泡菜汁樣品中分離得到8株植物乳桿菌、4株干酪乳桿菌和2株雙發(fā)酵乳桿菌；而本實(shí)驗(yàn)篩選所得的分離株為植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和干酪乳桿菌，可見參與泡菜發(fā)酵的乳酸菌以植物乳桿菌為主[14,15]。

陳靜等從泡菜中分離得到4株乳酸桿菌，采用打孔法研究了分離株發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌等指示菌的抑菌能力，研究發(fā)現(xiàn)：分離株J-4發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果顯著，抑菌圈直徑可達(dá)17 mm，而本實(shí)驗(yàn)中抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：干酪乳桿菌L2與植物乳桿菌L3的培養(yǎng)上清液對(duì)指示菌的抑菌圈直徑均可達(dá)到20 mm，而發(fā)酵乳桿菌L1的培養(yǎng)上清液對(duì)指示菌的抑菌圈直徑可達(dá)16 mm，可見本實(shí)驗(yàn)分離所得的乳酸菌抑菌效果更強(qiáng)；同時(shí)，共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明指示菌經(jīng)與分離株上清液共培養(yǎng)后存活率均有所降低，且L1對(duì)指示菌存活的抑制作用小于L2與L3，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與牛津杯法抑菌結(jié)果一致，充分驗(yàn)證了乳酸菌的胞外產(chǎn)物中含有抑菌物質(zhì)，能夠有效抑制致病菌的生長(zhǎng)，為日后研發(fā)新型天然食品防腐劑奠定了理論基礎(chǔ)[16]。

通常人體進(jìn)食后胃部 pH 在3.0～5.0之間，小腸中膽鹽含量在0.03%～0.3%范圍內(nèi)波動(dòng)[17],因此益生性乳酸菌應(yīng)對(duì)酸和膽鹽具有一定的耐受性，這是更好地發(fā)揮益生作用的關(guān)鍵。Kim 等對(duì)6株從泡菜中分離出的乳酸菌進(jìn)行了耐酸實(shí)驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)其在pH 2.5的環(huán)境中存活率均在62%以上，而本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的分離株抗逆性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵乳桿菌L1、干酪乳桿菌L2與植物乳桿菌L3分別在pH 2的環(huán)境中作用2 h后，存活率分別可達(dá)82.58%、48.34%和48.49%，可見不同菌株對(duì)pH 2酸性環(huán)境的耐受性有所差異[18]；同時(shí)吳云等在膽鹽耐受性實(shí)驗(yàn)中研究發(fā)現(xiàn)，膽鹽濃度為0.2%和0.3%時(shí)乳酸菌活菌數(shù)都達(dá)到了107cfu/mL 以上，存活率為88.48%，這說明篩選出的植物乳桿菌W對(duì)膽鹽有較強(qiáng)的耐受能力，而本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了分離株在含0.3%膽鹽培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)4 h后的活菌數(shù)，經(jīng)計(jì)算存活率分別達(dá)70.62%、66.56%和54.8%[19]。因此，篩選出的3株分離株均有一定的抗逆性，具有潛在的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值，為后續(xù)評(píng)估其他益生潛力奠定了基礎(chǔ)。