張賀，初照成

（沈陽市第二中醫(yī)醫(yī)院 1.介入科，2.檢驗科，遼寧 沈陽 110101）

缺血性腦血管病是我國中老年人的常見病。目前介入治療是一種新型的利用血管內導管的操作技術[1]，能夠大大減少患者的痛苦并降低缺血性腦卒中的風險。但介入手術治療和麻醉可誘發(fā)中樞神經系統(tǒng)的炎癥反應而增加治療的風險。近來研究發(fā)現(xiàn)，磷酸酶張力蛋白同源基因（PTEN）能夠調控一些炎癥細胞[2]。但有關研究PTEN 在腦血管介入治療中的調控作用的報道較少?，F(xiàn)以老年缺血性腦血管疾病患者為研究對象，分析其圍術期CD4+T 淋巴細胞PTEN 表達的變化。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月—2017年12月沈陽市第二中醫(yī)醫(yī)院收治的擇期行介入手術治療的80 例老年缺血性腦血管疾病患者。采用隨機數字表法分為觀察組40 例和對照組40 例。觀察組：男性25 例，女性15 例；平均年齡（68.5±7.4）歲；ASA 分級Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級分別為4、28 和8 例；BMI 為（23.5±2.3）kg/m2；基底動脈狹窄18 例，大腦中動脈狹窄22 例；合并高血壓14 例，糖尿病8 例。對照組：男性28 例，女性12 例；平均年齡（69.1±6.7）歲；ASA 分級Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級分別為5、25 和10 例。BMI 為（23.8±2.5）kg/m2；基底動脈狹窄16 例，大腦中動脈狹窄24 例；合并高血壓13 例，糖尿病7 例。納入標準：①符合WHO 的缺血性腦血管疾病的診斷標準；②經DSA 證實存在顱內動脈粥樣硬化性狹窄；③均自愿參與本研究；④年齡≥60 歲；⑤BMI 20 ～28 kg/m2；⑥具備腦血管神經介入指征。排除標準：①惡性腫瘤；②合并嚴重外傷及感染者；③肝、腎等重要器官功能衰竭；④不能耐受阿司匹林或氯吡格雷，或對他汀類藥物過敏者；⑤存在心源性栓子的潛在來源；⑥血液系統(tǒng)疾?。?⑦靜脈碘試驗陽性。兩組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。該研究經本院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者及家屬知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 兩組術前3 d 均口服氯吡格雷和阿司匹林，術前均給予局部麻醉，采用經皮Seldinger's穿刺法，股動脈穿刺入路，將8 F 導引導管放置患側頸總動脈遠端，采取栓塞、注藥和擴張等治療，具體操作由本院資深神經科介入醫(yī)生進行。術后靜脈注射尿激酶溶栓，經檢查發(fā)現(xiàn)殘余狹窄均＜10%。觀察組于術前2 d口服阿托伐他汀80 mg/d，術后口服40 mg/d，連續(xù)服用3 個月；對照組不給予阿托伐他汀治療。

1.2.2 血液標本采集 兩組均于手術前后16 ～24 h抽取肘靜脈血20 ml。取其中5 ml 用 于TNF-α、IL-10 的檢測，2 000 r/min 離心10 min，取上清液采用ELISA 法檢測。剩余15 ml 采用肝素抗凝后分離細胞。

1.2.3 PTEN mRNA 的檢測 免疫磁珠法分選出CD4+T 淋巴細胞，實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRTPCR）檢測PTEN mRNA 表達。具體方法為：按照Trizol 操作說明提取細胞總RNA，采用紫外分光光度計（上海讓奇公司）檢測RNA 濃度及純度。2%瓊脂糖凝膠（含0.5%溴化乙錠）電泳檢測RNA 有無降解，調整RNA 的量為1 μg/μl，逆轉錄試劑盒（購自美國Cell Signaling Technology 公司）將其逆轉錄成互補DNA。SYBR GreenΙ 熒光標記法檢測PCR 產物，PCR 引物序列采用Primer express 2.0 軟件嚴格按照相關原則設計。根據試劑盒說明書設置反應體系及參數，建立20 μl 反應體系。每個樣本做復孔檢測，同時每次反應均設置陰性孔，PCR 產物經測序檢測，測定目的基因的吸光度值，取平均灰度值。結果采用2-ΔΔCt法比較。

1.2.4 PTEN蛋白的檢測 Western blotting 檢測PTEN 蛋白的表達，將分選出CD4+T 淋巴細胞加入100 μl 含PMSF 的裂解液，于冰上裂解30 min，搖勻。4℃下12 000 r/min 離心20 min，取上清液，蛋白濃度采用免疫BCA 法檢測。上樣15 ～20 μl 至SDSPAGR 膠電泳，半干法轉膜40 min。用25 ml TBS 洗膜5 min，置于25 ml 封閉緩沖液中1 h，室溫搖動。1 ∶2 500 稀釋一抗在4℃的溫度下放置過夜，脫色搖床上用15 ml TBST 洗膜洗3 次，15 ml TBS 洗1 次。采用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶標記的二抗，溫敷育2 h 后在雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描成像。

1.3 統(tǒng)計學方法

數據分析采用SPSS 15.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，符合正態(tài)分布的計量資料組間比較用獨立樣本t檢驗，相關性分析采用Pearson檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者手術前后PTEN mRNA 和蛋白表達情況的比較

觀察組術后PTEN mRNA 和蛋白與術前比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），術后高于術前。對照組術前、術后PTEN mRNA 和蛋白的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組患者手術前后PTEN mRNA 和蛋白表達情況比較 （n =40，±s）

表1 兩組患者手術前后PTEN mRNA 和蛋白表達情況比較 （n =40，±s）

PTEN mRNA PTEN 蛋白組別t 值 P 值術前 術后 術前 術后t 值 P 值觀察組 2.64±0.34 4.58±0.78 14.420 0.000 0.25±0.05 0.39±0.06 11.337 0.000對照組 2.56±0.47 2.71±0.59 1.258 0.216 0.22±0.04 0.24±0.05 1.975 0.055

2.2 兩組患者手術前后TNF-α、IL-10 的比較

觀察組術后TNF-α、IL-10 與術前比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），觀察組術后TNF-α 低于術前，IL-10 高于術前。對照組術后TNF-α、IL-10 與術前比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 IL-10、TNF-α 與PTEN 表達量的相關性分析

相關性分析顯示，IL-10 與PTEN 表達呈正相關（r=0.775，P=0.001），TNF-α 與PTEN 表達呈負相關（r=-0.846，P=0.000）。

表2 兩組患者手術前后TNF-α、IL-10 的比較 （n =40，pg/ml，±s）

表2 兩組患者手術前后TNF-α、IL-10 的比較 （n =40，pg/ml，±s）

TNF-α IL-10組別t 值 P 值術前 術后 術前 術后t 值 P 值觀察組 7.89±0.78 4.83±0.76 17.771 0.000 7.41±0.85 11.25±1.04 18.081 0.000對照組 7.33±0.82 7.61±0.74 1.603 0.117 7.86±0.91 7.59±0.76 1.440 0.158

3 討論

缺血性腦血管疾病是由于腦組織缺血、缺氧而引起的疾病，近年來發(fā)病率逐漸呈上升趨勢。根據缺血部位不同，患者出現(xiàn)不同的臨床癥狀，嚴重患者可發(fā)展成為腦梗死，出現(xiàn)肢體殘疾甚至死亡，嚴重影響患者生存質量。臨床對缺血性腦血管疾病的治療原則是有效疏通阻塞血管，恢復腦組織的供血和氧供。介入治療是治療缺血性腦血管疾病的主要方法之一，其微創(chuàng)、局部麻醉、患者術后恢復快，能夠改善患者的臨床癥狀，降低腦梗死發(fā)生的風險[3]。有研究顯示[4]，腦血管介入術后可能存在一定的炎癥反應，血栓、炎癥、平滑肌細胞增殖遷移是短暫性腦缺血發(fā)作介入術后血管再狹窄的3 個重要階段。田榮等[5]研究報道，介入支架術后頸動脈狹窄患者的IL-6、TNF-α、CRP 較術前有上升。炎癥因子與缺血性腦血管疾病的發(fā)生有密切的關系，一方面，炎癥因子能夠釋放可造成腦細胞損傷和血腦屏障破壞的蛋白水解酶、氧自由基、溶酶體酶等；另一方面，炎癥因子還可直接或間接透過血腦屏障增加神經細胞膜的通透性，引起腦組織缺血、缺氧甚至水腫。此外，研究已證實，大量炎癥因子在動脈斑塊形成、動脈硬化的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，而動脈斑塊形成導致的動脈狹窄是缺血性腦血管病的重要病因之一。

PTEN是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一具有蛋白脂酶和磷酸酶活性的人類腫瘤中存在表達缺失或突變的基因。既往研究[6]發(fā)現(xiàn)，PTEN 可調控細胞的生長、黏連、遷移、侵襲和凋亡等正常發(fā)育過程。有研究[7]在LPS 介導下敲除PTEN基因的巨噬細胞產生的TNF-α 水平有所下降，并推測PTEN 可能是通過PI3K-AKT 通路參與調控LPS 誘導的巨噬細胞的炎癥反應。另有研究[8]發(fā)現(xiàn)，在血管平滑肌細胞中抑制PTEN 的表達能夠促進炎癥反應。本研究結果還顯示，通過阿托伐他汀干預的缺血性腦血管疾病介入手術的患者，術后PTEN mRNA 和蛋白表達量升高，與對照組比較有差異。而對照組的PTEN mRNA 和蛋白表達量手術前后未發(fā)生明顯變化，這提示阿托伐他汀的使用可能在一定程度上促進PTEN 的上調。本研究結果顯示，觀察組的術前、術后的TNF-α、IL-10 未發(fā)生明顯變化，而對照組TNF-α 降低，IL-10 升高。相關性分析也顯示，IL-10 與PTEN 表達呈正相關，TNF-α 與PTEN 表達呈負相關。這提示PTET 可能通過調控CD4+T 淋巴細胞的炎癥分泌促進IL-10 的釋放，降低TNF-α 的表達水平。莊獻博等[9]研究顯示，冠狀動脈介入術后的PTEN mRNA 和蛋白表達量下降，認為介入手術可下調PTEN 的水平來促進炎癥反應發(fā)生，造成心肌損傷。而阿托伐他汀能夠在一定程度上減輕介入治療缺血性腦血管疾病患者的炎癥反應，而其作用機制可能與PTEN 的上調有關。阿托伐他汀是一種常見的心腦疾病的治療藥物，除了能夠調節(jié)血脂水平外，還具有抗炎、增強免疫活性、改善血管內皮功能以及抗動脈粥樣硬化的效果。阿托伐他汀能夠通過糾正Th17/Treg失衡，減輕缺血腦組織的炎癥反應，而本研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可能是通過上調PTEN 的水平發(fā)揮對抗缺血性腦血管疾病患者術后炎癥反應的功效。

綜上所述，介入手術后缺血性腦血管疾病患者存在炎癥反應，而服用阿托伐他汀可降低該炎癥反應，其作用機制可能與阿托伐他汀可上調PTEN 的表達有關。