徐春蘭，林新瑜

（西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 皮膚科，四川 瀘州 646000）

銀屑病是一種以紅斑鱗屑為主要臨床表現(xiàn)的慢性炎癥性皮膚病，其病程較長，有易復發(fā)傾向[1]，其發(fā)病機制被廣泛認為與表皮的過度增厚[2]及免疫反應[3]有關(guān)。間充質(zhì)干細胞可從骨髓、骨膜、臍帶、皮膚等處獲取[4]，皮膚間充質(zhì)干細胞與皮膚組織的正常生理過程有著密切聯(lián)系，可能通過分泌多種細胞因子對皮膚微環(huán)境產(chǎn)生影響從而調(diào)控皮膚的生長代謝。因此，研究皮膚間充質(zhì)干細胞對研究銀屑病的發(fā)生、發(fā)展過程有一定意義。目前對銀屑病患者皮膚間充質(zhì)干細胞的細胞因子分泌相關(guān)研究尚少，本研究通過體外分離培養(yǎng)銀屑病患者及正常皮膚中的皮膚間充質(zhì)干細胞，并對其培養(yǎng)上清液中表皮生長因子（epidermal growth factor,EGF）、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β,TGF-β）以及干細胞因子（stem cell factor,SCF）的水平 進行測定，以期為銀屑病的研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2015年2月—2017年2月于西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院皮膚科收治的銀屑病患者59 例作為觀察組。另選取本院同期收治于整形外科及泌尿外科行手術(shù)切除皮膚的59 例患者作為對照組。所有研究對象均對本研究知情同意并簽署知情同意書。本研究經(jīng)過西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準。納入標準：①觀察組研究對象均經(jīng)臨床及病理確診為尋常型銀屑??；②對照組研究對象均無銀屑病家族史。排除標準：①就診前3 個月內(nèi)局部或全身使用過維A 酸類藥物、皮質(zhì)類固醇激素及免疫抑制劑的患者；②存在血液系統(tǒng)疾病或其他免疫系統(tǒng)疾病的患者。分別收集兩組研究對象的年齡、性別等一般情況指標。

1.2 主要儀器與試劑

倒置相差顯微鏡（日本Olympus 公司），細胞培養(yǎng)孵箱（美國Thermo Scientific 公司），Multiskan Mk3 酶標儀（美國Thermo 公司），水浴箱（上海中新儀器設(shè)備公司），SWCJ-1FD 型凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠），EPICS-XL 型流式細胞儀（美國Beckman Corlter 公司），胎牛血清（FBS）、DMEM/F12K 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司），胰蛋白酶（美國Sigma 公司），油紅O、茜素紅S、熒光素標記抗體（美國Hyclon 公司），人EGF、TGF-β1及SCF 的ELISA 試劑盒（美國R＆D 公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 皮膚間充質(zhì)干細胞的分離與培養(yǎng) 無菌條件下將標本制成1.0 cm×1.0 cm 大小的組織塊，先用75%的乙醇反復消毒處理2 次，再用磷酸鹽緩沖液（PBS）對消毒處理后的組織塊充分清洗3 次，以除去角質(zhì)層以及皮下組織。加入Dispase Ⅱ酶37℃消化2 ～4 h，分離真皮、表皮，收集真皮部分。滴管反復吹打組織后用篩網(wǎng)過濾，將濾過液置于冰上靜置30 min，離心后棄上清，收集細胞沉淀，加入培養(yǎng)基輕柔重懸細胞。培養(yǎng)基采用DMEM/F12K，其中加入體積分數(shù)為5%的胎牛血清、濃度為10 μg/L 的堿性成纖維生長因子及10 ml/L 的B27 添加劑；細胞培養(yǎng)孵箱設(shè)置為37℃、5%二氧化碳CO2、飽和濕度。倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況并記錄細胞鏡下形態(tài)。

1.3.2 皮膚間充質(zhì)干細胞的免疫表型鑒定 收集第3代 的皮膚間充質(zhì)干細胞，以不含b-FGF 的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，離心后收集上清液，過濾后用無菌EP 管收集，置于-20℃冰箱冷凍保存。兩組分別取2×105個細胞加入熒光素標記單克隆抗體，室溫避光孵育30 min，PBS 洗滌后以流式細胞儀檢測鑒定皮膚間充質(zhì)干細胞。

1.3.3 皮膚間充質(zhì)干細胞的多向誘導分化及鑒定 分別取5組第3代的皮膚間充質(zhì)干細胞再培養(yǎng)48 h后，進行成脂及成骨誘導分化。取第3 代皮膚間充質(zhì)干細胞加入成脂誘導培養(yǎng)液（含有10%體積分數(shù)FBS 的DMEM/F12K 培養(yǎng)基、1 μmol/L 的地塞米松、0.2 mmol/L 的吲哚美辛、10 mg/L 的人胰島素、0.5 mmol/L 的3-異丁 基-1 甲基黃嘌呤），每3 天換1 次培養(yǎng)液，培養(yǎng)21 d后10%甲醛固定，油紅O 染色，顯微鏡下觀察細胞中有無脂滴。另設(shè)置未誘導分化陰性對照組。

取第3 代皮膚間充質(zhì)干細胞加入成骨誘導培養(yǎng)液（含有10%體積分數(shù)FBS 的DMEM/F12K 培養(yǎng)基、0.1 μmol/L 的地塞米松、10 mmol/L 的β-甘油磷酸鈉、50 μmol/L 的L-抗壞血酸），每3 天換1 次培養(yǎng)液，培養(yǎng)21 d 后10%甲醛固定，2%茜素紅溶液染色，顯微鏡下觀察觀察細胞中有無礦化結(jié)節(jié)。另設(shè)置未誘導分化陰性對照組。

1.3.4 皮膚間充質(zhì)干細胞中EGF、TGF-β1及SCF的水平檢測 收集第3 代皮膚間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)的上清液，嚴格按照ELISA 試劑盒說明書上的標準步驟進行操作，由專業(yè)人員完成測試，收集并檢測第3 代皮膚間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基上清液中的EGF、TGF-β1及SCF 含量。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗；計數(shù)資料以頻數(shù)表示，采用Pearson χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較

兩組患者一般資料中性別及年齡比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 兩組皮膚間充質(zhì)干細胞的免疫表型鑒定結(jié)果

兩組結(jié)果均顯示，表面抗原CD73、CD44、CD90、CD105，以及CD29 表達陽性，而HLA-DR、CD34 及CD45 表達陰性。見圖1。

表1 兩組患者一般狀況比較 （n =59）

圖1 兩組患者免疫表型鑒定結(jié)果

2.3 兩組皮膚間充質(zhì)干細胞的形態(tài)學特征

顯微鏡下可見皮膚間充質(zhì)干細胞在接種72 h 后有少量細胞貼壁，貼壁細胞數(shù)量隨培養(yǎng)時間延長而增加，細胞增大且分裂增殖，呈梭形及多角形排列，胞質(zhì)豐富，核居中；另有少量圓形細胞呈散在分布，不貼壁，粘著在貼壁細胞上。見圖2。

2.4 兩組患者皮膚間充質(zhì)干細胞成脂誘導分化結(jié)果

成脂誘導分化后，鏡下可見大小不等的圓形脂滴，油紅O 染色呈亮紅色，未誘導分化陰性對照組中染色陰性。見圖3。

2.5 兩組患者皮膚間充質(zhì)干細胞成骨誘導分化結(jié)果

成骨誘導分化后，鏡下可見誘導后細胞表面散布淡紅染物，茜素紅S 染色后鏡下可見局灶性紅色礦化結(jié)節(jié)，而未誘導分化的陰性對照組中未見上述特征，染色陰性。見圖4。

2.6 皮膚間充質(zhì)干細胞中EGF、TGF-β1 及SCF的水平檢測結(jié)果

圖2 皮膚間充質(zhì)干細胞的形態(tài)學特征 （×200）

圖3 皮膚間充質(zhì)干細胞脂肪誘導分化形態(tài) （×200）

觀察組皮膚間充質(zhì)干細胞中EGF、TGF-β1及SCF 的水平與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），觀察組銀屑病患者皮損處的皮膚間充質(zhì)干細胞中EGF 及SCF 水平升高，TGF-β1水平降低。見表2。

圖4 皮膚間充質(zhì)干細胞成骨誘導分化形態(tài) （×200）

表2 兩組患者皮膚間充質(zhì)干細胞中細胞因子水平比較 （n =59，pg/ml，±s）

表2 兩組患者皮膚間充質(zhì)干細胞中細胞因子水平比較 （n =59，pg/ml，±s）

組別 EGF TGF-β1 SCF觀察組 301.36±21.45 542.17±42.37 233.48±44.56對照組 269.33±20.07 710.01±54.67 116.85±38.47 t 值 2.382 2.673 2.561 P 值 0.021 0.011 0.013

3 討論

銀屑病可分尋常型銀屑病、關(guān)節(jié)病型銀屑病、膿皰型銀屑病以及紅皮病型銀屑病，本研究中選取的尋常型銀屑病約占銀屑病患者的95%[5]。其患病率無性別差異，在任何年齡段均可發(fā)病，在15～30 歲發(fā)病率較高[6]。據(jù)有關(guān)報道銀屑病發(fā)病率在亞洲為0.1‰每年，歐洲為1.4‰每年[7]。患者由于大量脫屑造成組織蛋白大量流失，加之病理狀態(tài)所致高熱及免疫力低下，易出現(xiàn)感染及電解質(zhì)代謝紊亂，嚴重者可引起死亡[8]。皮膚間充質(zhì)干細胞大部分來源于中胚層的體細胞[9]，具有自我更新及高度分化的能力[10]。在2001年TOMA等首次從真皮層中分離出多功能成體干細胞[11]。由于皮膚組織具有取材容易操作簡單、細胞增殖速度快以及所誘導的組織受主要組織相容性復合物限制較少等特點，是一種理想的應用于皮膚組織工程的種子細胞，具有廣闊前景[12]。皮膚間充質(zhì)干細胞是皮膚微環(huán)境的組成成分之一，參與修復過程中細胞外基質(zhì)重塑以及調(diào)節(jié)相關(guān)細胞生長因子的表達等過程，是維持皮膚組織正常生長發(fā)育的重要組成成分[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組患者所提取的皮膚間充質(zhì)干細胞其形態(tài)學特征、免疫表型及誘導分化結(jié)果較為相似，所得結(jié)果與既往研究結(jié)果相符[14]。

有研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者細胞因子在骨髓間充質(zhì)干細胞中的分泌水平異常[15]。TGF-β 參與銀屑病發(fā)生的主要效應包括調(diào)節(jié)炎癥反應、細胞生長及抑制免疫功能等[16]。GIANLUCA 等[17]研究發(fā)現(xiàn)TGF-β 在角質(zhì)形成細胞的增殖和遷移過程中起著負調(diào)控作用，角質(zhì)形成細胞是一種能合成角質(zhì)蛋白的上皮細胞，而銀屑病的病理特點之一就是表皮角質(zhì)形成細胞的增殖和異常分化。VARANI 等用含EGF 受體抗體的培養(yǎng)基培養(yǎng)銀屑病皮損組織，發(fā)現(xiàn)其組織病理形態(tài)發(fā)生改善[18]。同時也有研究表明，EGF 調(diào)控基因在多種皮膚病中呈現(xiàn)過度表達，EGF 在皮膚及血液中的表達水平可隨著患者的病情恢復而恢復正常水平[19]。SCF 是一種可以促進干細胞增殖及分化并延長其存活期的細胞因子。皮膚中的SCF 可誘導表皮干細胞向角質(zhì)形成細胞分化[20]，與TGF-β 共同參與該病理過程。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)銀屑病患者的皮膚間充質(zhì)干細胞中EGF、TGF-β1及SCF 的水平與正常對照組比較有差異，銀屑病患者皮損處的皮膚間充質(zhì)干細胞中分泌EGF 及SCF 水平升高，TGF-β1水平降低。說明銀屑病患者細胞因子在皮膚間充質(zhì)干細胞中的表達相比于正常組織有所異常，EGF、TGF-β1 及SCF 水平的改變可能與銀屑病的發(fā)生、發(fā)展有一定聯(lián)系，但具體的機制仍需探索，可以在后期的研究中進一步探討，以期為銀屑病的診治提供數(shù)據(jù)支持。