王志強(qiáng)，賀璇，李思維，田佳，徐龍寬，周英瓊

（桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 病理科，廣西 桂林 541001）

鼻咽癌是我國南方省份及東南亞高發(fā)的一種惡性 腫瘤，有明顯的種族聚集性和地域性。臨床以放射治療為主，由于鼻咽腔位置隱蔽，臨床癥狀表現(xiàn)多樣，確診時(shí)約75%患者為中晚期，這類患者的治療效果欠佳，5年生存率＜50%[1]。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)的方法，檢 測Yes 相 關(guān) 蛋 白（Yes-associated protein,YAP）、哺乳動(dòng)物不育系20 樣激酶1（mammalian sterile 20-like kinase 1,MST1）、細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）在鼻咽部黏膜慢性炎和鼻咽癌中的表達(dá)，觀察其表達(dá)與鼻咽癌臨床病理因素間的關(guān)系，探討其在鼻咽癌發(fā)生中的作用機(jī)制，進(jìn)而有助于為鼻咽癌的早期診斷提供新的標(biāo)志物，也可為臨床治療路徑提供新思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2009年1月—2012年12月于桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科保存的活檢術(shù)標(biāo)本160 例鼻咽癌組織（鼻咽癌組）。其中，男性118 例，女性42 例；年齡13 ～79 歲；患者術(shù)前均未放化療，術(shù)后所有標(biāo)本診斷為鼻咽癌。40 例鼻咽黏膜慢性炎組織（鼻咽黏膜慢性炎組）來源于本院病理科2016年3月-2017年3月保存的活檢術(shù)標(biāo)本。所有組織標(biāo)本獲取均征得患者及家屬同意，并通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 YAP、MST1、CyclinD1 的檢測

采用免疫組織化學(xué)染色方法。YAP Antibody（#4912）購自美國CST 公司，MST1 Antibody 購自美國Proteintech 公司，CyclinD1 即用型抗體、DAB 顯色試劑盒及即用型快捷免疫組織化學(xué)Max VisionTM試劑盒（鼠/兔）購自福州邁新生物技術(shù)公司。按試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。陽性對照用己知染色陽性切片，陰性對照用PBS 代替一抗。YAP 表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核，MST1 表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，CyclinD1 表達(dá)于細(xì)胞核。

1.3 結(jié)果判定

顯微鏡下觀察、成像系統(tǒng)拍照。①按陽性細(xì)胞百分比計(jì)分：≤5%為0 分，＞5%～25%為1 分，＞ 25%～50%為2 分，＞50%～75%為3 分，＞75%為4 分；②染色強(qiáng)度評(píng)分：無著色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分；③將陽性細(xì)胞百分比計(jì)分和染色強(qiáng)度評(píng)分相乘為結(jié)果：0 分陰性（-），1 ～4分弱陽性（+），5 ～8 分中度陽性（++），9 ～12 分強(qiáng)陽性（+++）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman 等級(jí)相關(guān)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組YAP、MST1、CyclinD1 的表達(dá)

YAP 及CyclinD1 蛋白在鼻咽癌組織中的陽性表達(dá)率高于鼻咽黏膜慢性炎組織（P＜0.05）；MST1 蛋白在鼻咽癌組織中的陽性表達(dá)率低于鼻咽黏膜慢性炎組織（P＜0.05）。見表1和圖1、2。

2.2 YAP、MST1、CyclinD1 的表達(dá)與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系

160 例鼻咽癌組織中，YAP、CyclinD1 在非角化型未分化癌中的表達(dá)高于非角化型分化性癌（P＜0.05）， 而MST1 的表達(dá)與病理分型不相關(guān)（P＞0.05）；三者與患者的性別、年齡、生存時(shí)間、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及生存狀態(tài)不相關(guān)（P＞0.05）。見表2。

表1 兩組YAP、MST1、CyclinD1 蛋白表達(dá)及陽性率的比較 例（%）

圖1 YAP、MST1、CyclinD1 蛋白在鼻咽癌黏膜慢性炎中的表達(dá) （×40）

圖2 YAP、MST1、CyclinD1 在鼻咽癌中的表達(dá) （×40）

表2 鼻咽癌臨床病理學(xué)特征與YAP、MST1、CyclinD1 蛋白的關(guān)系 例（%）

2.3 YAP 與MST1、CyclinD1 在鼻咽癌中表達(dá)的相關(guān)性

Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在鼻咽癌組織內(nèi)，YAP 與CyclinD1、MST1 與CyclinD1 呈正相關(guān)（rs= 0.270 和0.208，P=0.001 和0.008），YAP 與MST1 的表達(dá)無相關(guān)性（rs=0.069，P=0.387）。

3 討論

YAP 是富脯氨酸的磷蛋白，約65kD，是Hippo 信號(hào)通路中的主要效應(yīng)因子，其表達(dá)過量與腫瘤發(fā)生有關(guān)[2]。YAP 基因定位于人類染色體11q22，表達(dá)于除外周血白細(xì)胞外的所有機(jī)體組織中[3]。YAP 通過WW結(jié)構(gòu)域能與含有Pro-pro-X-Tyr（PPXY）結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子相互結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄共激活因子功能，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[4]。研究表明YAP在細(xì)胞增殖與凋亡的調(diào)控、器官大小的控制、細(xì)胞接觸性抑制乃至腫瘤的發(fā)生過程中具有重要的作用[5-6]。張寧南等[7]在膀胱癌T40 細(xì)胞株中干擾YAP 的表達(dá)，可抑制細(xì)胞增殖和遷移。在胰腺癌的研究中激活YAP促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞遷移、侵襲，減少YAP 的含量，降低細(xì)胞的侵襲和遷移能力；與人胰腺正常組織和原發(fā)腫瘤比較，胰腺癌轉(zhuǎn)移組織細(xì)胞核內(nèi)YAP 的表達(dá)水平升高[8]。YU 等[9]研究結(jié)果顯示，YAP 在肝細(xì)胞癌及其轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)水平高于正常對照組；高表達(dá)YAP的肝癌患者，其總體生存率和無病生存率更低。本實(shí)驗(yàn)中，YAP 在鼻咽癌中的陽性表達(dá)率高于鼻咽黏膜慢性炎，與YU 等研究結(jié)果相似，說明YAP 在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用；YAP 在非角化型未分化癌中的表達(dá)高于非角化型分化性癌，這可能與分化性癌例數(shù)不足有關(guān)；YAP 在鼻咽癌中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)無關(guān)。

MST1，又稱STK4（絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶4），59 kD，基因位于20q11，與果蠅中的Hippo 激酶同源，廣泛表達(dá)于人體主要細(xì)胞系[10]。MST1 能通過磷酸化來調(diào)節(jié)Hippo-YAP 信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的核心激酶反應(yīng)鏈的其余部分，因此在Hippo-YAP 信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起重要作用[11]。MST1 主要功能之一是參與細(xì)胞的凋亡，MST1 被激活后能進(jìn)入細(xì)胞核，激活促凋亡的組蛋白和轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而促進(jìn)凋亡，并抑制細(xì)胞的生長[12]。有文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)MST1 缺失或受抑制時(shí)將促進(jìn)細(xì)胞的增殖或抑制細(xì)胞的凋亡[13]。LIN 等[14]在乳腺癌的研究中指出，MST1 過表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞增殖，MST1 表達(dá)缺失或變異與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)；乳腺癌MST1 陽性組患者的總生存率和無病生存率高于MST1 陰性組，表明MST1 是評(píng)估乳腺癌患者預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中，MST1 在鼻咽癌中的陽性表達(dá)率低于鼻咽黏膜慢性炎，提示MST1 表達(dá)減少與鼻咽癌的發(fā)生密切相關(guān)，但MST1 的表達(dá)與患者的預(yù)后無關(guān)。

CyclinD1 基因位于11q13，編碼由295 個(gè)氨基酸所構(gòu)成的蛋白質(zhì)，是一種具有癌基因性質(zhì)的蛋白，其過表達(dá)可加快細(xì)胞從G1/S 期的轉(zhuǎn)化，縮短G1 期，造成細(xì)胞增殖失控和惡性生長，從而造成細(xì)胞過度增殖，形成腫瘤[15]。ZHAO 等[16]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CyclinD1 在食管癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織，與食管癌的分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。QIN 等[17]發(fā)現(xiàn)，CyclinD1在結(jié)腸癌中的表達(dá)水平升高，且高表達(dá)CyclinD1 的結(jié)腸癌患者預(yù)后不良。本實(shí)驗(yàn)中，CyclinD1 在鼻咽癌中的陽性表達(dá)率高于鼻咽黏膜慢性炎癥，與以上研究結(jié)果相符，提示CyclinD1 表達(dá)的異常與鼻咽癌的發(fā)生密切相關(guān)；CyclinD1 在鼻咽癌中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，這與ZHAO 等[16]實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

本實(shí)驗(yàn)中，YAP 與CyclinD1、MST1 與CyclinD1 的表達(dá)呈正相關(guān)，YAP 與MST1 的表達(dá)無相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，YAP 和CyclinD1 蛋白的高表達(dá)、MST1 蛋白的低表達(dá)可能與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，三者有望成為治療鼻咽癌的新靶點(diǎn)。