許旋旋，吳凡，張家奎，王極宇，阮燕潔，朱鳳鳳，張秋葉，王會平，翟志敏

[安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 血液科（安徽醫(yī)科大學血液病研究中心），安徽 合肥 230601]

所有非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma,NHL）患者中，B 細胞來源約占85%以上[1]。針對B細胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL），尤其是侵襲性B-NHL的治療，單純化療效果不甚滿意。自1997年由美國食品和藥物管理局批準使用靜脈注射的利妥昔單抗（Rituximab,RTX）治療復發(fā)/難治B-NHL 后，治療效果顯著提高[2]?，F(xiàn)RTX 聯(lián)合環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松（R-CHOP 方案）已成為多種B-NHL一線標準化療方案。隨著RTX 的應用推廣，其治療的不良反應也逐漸顯現(xiàn)出來，尤其是輸注后會導致外周血B 細胞消耗，一定程度上可能會造成機體體液免疫的缺陷[3]。筆者在臨床應用過程中也觀察到患者在接受R-CHOP 方案治療后，合并呼吸道、皰疹病毒等感染概率較高。迄今為止關于RTX 治療B-NHL 療效和安全性方面的研究報告較多，但有關不良反應的臨床報道很少。本研究即對RTX 治療B-NHL 后患者體液免疫的狀況及其臨床意義進行回顧性分析和總結(jié)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2012年2月—2018年1月安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院血液科收治的B-NHL 患者156 例。按以下標準篩選后共入組患者86 例，根據(jù)治療方案的不同分為R-CHOP 組（觀察組）70 例和CHOP 組（對照組）16 例，部分指標數(shù)據(jù)以實際檢測例數(shù)來分析。篩選入組標準：①經(jīng)病理組織學診斷為B-NHL，免疫組織化學檢測提示CD20 陽性；②均為初診患者，且入組前未經(jīng)過其他任何相關治療；③至少完成2 個療程的R-CHOP 或者CHOP 方案化療；④研究內(nèi)容經(jīng)過本院醫(yī)學倫理委員會批準，患者已簽署知情同意書。排除標準：①腫瘤已經(jīng)侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)；②合并嚴重的心、肝、腎及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病或其他惡性腫瘤；③自身免疫系統(tǒng)疾病。

1.2 治療方法

對照組予以CHOP 方案化療，具體用藥為環(huán)磷酰胺750 mg/m2靜脈滴注，多柔比星60 ～80 mg/m2靜脈滴注，長春新堿1.4 mg/m2靜脈注射，均為第1 天給予；地塞米松20 mg 第1 ～5 天靜脈滴注。觀察組給予R-CHOP 方案化療，CHOP 方案治療前1 天使用利妥昔單抗，用法為利妥昔單抗375 mg/m2在生理鹽水中稀釋至1 mg/ml 靜脈滴注，每3 周為1 個療程。兩組患者均未行丙種球蛋白替代治療。

1.3 試劑和儀器

藻紅蛋白（PE）標記的CD20（克隆號：B9E9）和葉綠素蛋白偶聯(lián)物（PC5）標記的CD45（克隆號：J.33）購自美國Beckman-Coulter 公司，流式細胞儀（FC500-MCL,FCM）購自美國Beckman-Coulter 公司，熒光激發(fā)光波長為488 和633 nm，分析系統(tǒng)軟件為CXP 系統(tǒng)。

1.4 觀察指標

1.4.1 血清中免疫球蛋白及其主要亞型的檢測 每次化療前抽取患者空腹靜脈血，離心獲取血清，免疫比濁法測定患者外周血中免疫球蛋白及其主要亞型的含量。本中心正常參考值范圍：球蛋白20.0 ～40.0 g/L，IgG 7.0～16.6 g/L，IgA 0.7～3.5 g/L，IgM 0.5～2.6 g/L。

1.4.2 外周血B 細胞的檢測 取肝素鈉抗凝的靜脈血液2 ～3 ml，4℃冰箱下放置（3 h 內(nèi)檢測）。檢測前，對流式細胞儀進行光流路質(zhì)量和熒光補償調(diào)控，使儀器的各項指標在質(zhì)量控制允許值范圍。然后根據(jù)流式細胞術標準操作流程進行檢測，檢測后數(shù)據(jù)以Listmode 文件的形式保存。

1.4.3 感染病例記錄 如實記錄患者在臨床藥物治療期間發(fā)生與藥物有關的感染。感染的臨床病例定義[4]：金標準是血液或分泌物中檢測出細菌、真菌或病毒等微生物。若臨床未送檢標本進行微生物培養(yǎng)，滿足下列條件之一視為感染：①新出現(xiàn)的發(fā)熱高于37.3℃；②需要換抗菌性更強的抗生素或由局部用藥改為全身性抗感染療法；③導致患者立即入院；④導致癌癥治療方案的強度降低。感染性事件（IE）分級參考不良事件通用術語標準修訂第四版（CTCAE4.3 National Cancer Institute,NIH,DHHS.June14,2010）[5]。IE 分級如下：①Ⅰ級為無癥狀或癥狀輕微，無需干預；②Ⅱ級為中度感染，需要進行局部或非侵入性干預；③Ⅲ級為嚴重但不能立即危及生命，住院治療；④Ⅳ級為危及生命，需要緊急干預；⑤Ⅴ級為死亡。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，治療前后比較采用配對樣本t檢驗。計數(shù)資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者基本資料

86 例患者中，觀察組70 例：彌漫大B 細胞淋巴瘤47 例，濾泡性淋巴瘤8 例，套細胞淋巴瘤7 例，邊緣區(qū)淋巴瘤4 例，毛細胞白血病2 例，淋巴漿細胞淋巴瘤/華氏巨球蛋白血癥2 例；對照組16 例：其中彌漫大B 細胞淋巴瘤12 例，套細胞淋巴瘤4 例。兩組患者在年齡、性別、不同年齡段患者數(shù)、腫瘤分期、預后評分、治療前HBV 感染和治療前血清中免疫球蛋白及其主要亞型基線水平等方面差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 兩組治療前后外周血中CD20+正常B 淋巴細胞的變化情況

治療4 個療程后，因部分患者未完成全部治療，觀察組僅14%（9/64））患者外周血中可檢出CD20+正常B 細胞，其余均為陰性，而對照組100%（16/16）患者外周血中CD20+正常B 細胞均可檢出，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=44.000，P=0.000）。見圖1。

2.3 兩組患者治療前后血清中免疫球蛋白、IgG、IgA 及IgM 變化和免疫球蛋白血癥發(fā)生率

觀察組治療后，血清中免疫球蛋白、IgG、IgA 及IgM 均降低，治療4 療程后與治療前水平比較，分別下降21.45%，30.69%，29.02%及31.90%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。且隨著療程數(shù)的增加，下降程度大于20%的例數(shù)也增加（見圖2）。而對照組使用4 個療程CHOP 化療后免疫球蛋白、IgG、IgA 及IgM 雖然略有降低，但與治療前比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。見表2。

以健康正常人檢測指標下限值為標準，進一步分析比較兩組患者治療前后免疫球蛋白水平變化情況，結(jié)果顯示：雖然治療前兩組之間免疫球蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但4 個療程治療后，兩組比較，觀察組患者低免疫球蛋白血癥的發(fā)生率高于對照組（P＜0.05）。見表3。

表1 兩組患者的基線特征比較

圖1 兩組治療前后外周血中CD20+正常B 淋巴細胞檢測結(jié)果

圖2 觀察組患者治療2、4 個療程后免疫球蛋白及其主要亞型的變化情況

2.4 觀察組治療后感染發(fā)生情況以及與免疫球蛋白、IgG、IgA 及IgM 之間的關系

在治療期間，有26 例發(fā)生32 次（45.71%）感染，其中，6 例發(fā)生1 次以上感染。感染事件分級以Ⅰ、Ⅱ級為主，占81.25%，Ⅲ、Ⅳ級感染占18.75%，未出現(xiàn)引起死亡的Ⅴ級感染事件；從感染部位上分，上呼吸道感染13 例，肺部感染7 例，消化道感染4 例，泌尿系感染4 例，皮膚感染1 例，皰疹病毒感染3 例（見表4）。以血清中免疫球蛋白正常參考值的低限將患者分為免疫球蛋白正常組和低水平組，其中免疫球蛋白、IgG、IgM 與易發(fā)感染有關（P＜0.05）。見表5。

表2 兩組患者治療前后血清免疫球蛋白及其主要 亞型的比較 （g/L，±s）

表2 兩組患者治療前后血清免疫球蛋白及其主要 亞型的比較 （g/L，±s）

組別 治療前 治療后 t 值 P 值觀察組 免疫球蛋白 28.63±6.61 22.49±4.32 9.415 0.000 IgG 14.37±6.16 9.96±2.90 7.129 0.000 IgA 2.24±1.50 1.59±0.93 5.789 0.000 IgM 1.16±0.70 0.79±0.52 6.136 0.000對照組 免疫球蛋白 26.49±3.36 26.26±4.05 0.301 0.768 IgG 12.64±3.15 11.75±2.89 2.024 0.061 IgA 2.33±1.05 2.27±1.08 0.467 0.647 IgM 1.12±0.49 0.94±0.32 1.850 0.084

表3 兩組患者治療前后低免疫球蛋白血癥 發(fā)生率的比較 %

表4 R-CHOP 組患者的感染類型及分級

表5 觀察組患者低免疫球蛋白血癥與感染的關系 （n =53，感染次數(shù)/例數(shù) ）

3 討論

B-NHL 是成人淋巴瘤中常見的一種類型，傳統(tǒng)的以蒽環(huán)類為基礎的CHOP 治療方案往往難以達到滿意的臨床療效。隨著RTX 時代的來臨，R-CHOP 方案以其良好的療效及耐受性在臨床上得到推廣，并極大地延長患者的生存率[6]。

RTX 是一種人鼠嵌合性單克隆抗體，能特異性地與跨膜抗原CD20 結(jié)合，并通過抗體依賴的細胞毒 性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC）、 補體依賴的細胞毒性（complement-dependent cytotoxicity,CDC）和細胞凋亡的直接信號轉(zhuǎn)導方式而發(fā)揮靶向抗腫瘤的作用[7]。CD20 是一種非糖基化磷酸蛋白，廣泛表達于正常和惡性B 細胞表面[8]。正因為如此，RTX 在抗腫瘤的同時也會殺傷正常的B 淋巴細胞。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組在治療后僅14%的患者外周血中檢測到正常的B 淋巴細胞，而對照組則不受影響，提示RTX 對B 細胞強大的耗竭作用。早期動物試驗即表明單次輸注1.6 mg/kg RTX 就可以導致獼猴外周血中B 細胞消耗超過98%[9]，Ⅰ、Ⅱ期臨床研究也表明，B-NHL 患者輸注RTX 后外周血CD20+B 細胞迅速消耗，這種作用是劑量依賴性的，且在大多數(shù)患者中持續(xù)至少2 ～3 個月[1]。

雖然RTX 治療后會引起B(yǎng)-NHL 患者外周血B淋巴細胞缺失，損傷患者的體液免疫，但有研究發(fā)現(xiàn)，RTX 并未導致血清中免疫球蛋白水平的降低，多數(shù)患者的IgG 水平仍然在正常范圍[10-12]。而本研究中，觀察組4 個療程治療結(jié)束后，免疫球蛋白及其主要亞型較治療前均有下降，且隨著療程的增加下降幅度增大，而對照組治療前后則無差異。另在觀察組中4 個療程后觀察到約35.85%的患者出現(xiàn)低免疫球蛋白血癥。筆者推測可能由于RTX 消耗外周血B 細胞，導致漿細胞來源減少，而免疫球蛋白由漿細胞分泌，故RTX間接導致外周血免疫球蛋白減少。同時筆者觀察到治療4 個療程后IgM 下降的程度大于IgG 和IgA 下降的程度，據(jù)文獻報道，B 細胞分化過程中先出現(xiàn)胞漿胞膜IgM，而后通過類別轉(zhuǎn)化才分化為分泌IgG、IgA 的漿細胞，而CD20 的表達從B 細胞到漿細胞的分化過程中逐漸減弱，故RTX 對分泌IgM 細胞的殺傷作用大于分泌IgG、IgA 的細胞[13-14]。

R-CHOP 方案使患者體液免疫受損，因此感染也成為大家關注的重點。早期研究表明在CHOP 方案中加入RTX 會導致感染發(fā)生率增加，尤其是多次使用含RTX 化療方案之后[15]。一項來自觀察隊列的數(shù)據(jù)顯示，接受R-CHOP 方案化療的彌漫大B 細胞淋巴瘤患者的感染發(fā)生率10%～42%[16]。本研究中詳細記錄觀察組感染的發(fā)生情況，治療過程中感染發(fā)生率高達45.71%，其中Ⅲ、Ⅳ級占18.75%。可能與入組的60 歲以上及Ⅲ、Ⅳ期患者比例較高有關。同時臨床觀察中記錄到更多上呼吸道感染案例，并有3 例皰疹感染案例，上述病原體以病毒多見，推測接受RTX 治療的患者可能存在細胞免疫功能的受損，而RTX 選擇性地消耗B 細胞，是否對T 細胞也有影響，最近的研究發(fā)現(xiàn)這種B 細胞亞群的大量缺失，會造成機體T 細胞在淋巴系統(tǒng)的重定位及表面趨化因子受體的表達改變（如CCR7），限制T 細胞參與淋巴細胞再循環(huán)的過程[17]。此外，MISUMI 等發(fā)現(xiàn)CD4+T 細胞和B 細胞之間的相互作用是機體體液免疫和記憶性CD4+T 細胞產(chǎn)生的必要條件，當用抗CD20 單抗消耗掉小鼠體內(nèi)的成熟B 細胞時，與對照小鼠比較，缺乏成熟B 細胞的小鼠產(chǎn)生的抗病毒記憶性CD4+T 細胞的數(shù)量大大減少，且在病毒播散期，CD4+T 細胞和CD8+T 細胞被大量消耗，機體抗病毒感染的能力大大降低[18]。因此后續(xù)筆者也將對使用RTX 后患者的細胞免疫功能進行監(jiān)測。同時筆者觀察到低血清免疫球蛋白與感染有關，在發(fā)生IgG 降低的7 例患者中6 例出現(xiàn)感染，較未降低的患者感染率升高，提示低丙種球蛋白患者感染風險大，因此臨床上常予輸注丙種球蛋白替代治療。另外，所有患者治療期間均未發(fā)現(xiàn)乙肝病毒激活。有研究發(fā)現(xiàn)，對乙肝病毒攜帶的NHL 患者應用RTX 化療時會誘發(fā)乙肝病毒再激活[19]，因此，筆者對該患者在治療期間均常規(guī)給予恩替卡韋預防性抗病毒治療。KOO 等進行一項回顧性分析顯示，預防使用抗病毒藥物后乙肝病毒再激活率僅為2.2%[20]。

本項目研究表明，RTX 會損傷患者體液免疫，并增加感染的風險，因此在關注療效的同時，提醒臨床醫(yī)生也需要注意潛在感染的發(fā)生。但由于本組病例數(shù)少，隨訪時間短，仍有待增加樣本量并繼續(xù)隨訪觀察，同時需進一步明確嚴重感染的危險因素，識別高危患者以及可能的特異性免疫監(jiān)測。