楊清舉，張 弘

（1.四川省金堂縣第一人民醫(yī)院·四川大學(xué)華西醫(yī)院金堂醫(yī)院，四川 成都 610400；2.成都瑞特恩科技有限公司，四川 成都 611731）

依達(dá)拉奉（edaravone），化學(xué)名3-甲基-1-苯基-2-吡啶啉-5-酮，是以苯肼和乙酰乙酸乙酯為原料合成的吡唑啉酮類化合物，是首個用于治療急性缺血性腦卒中的強(qiáng)效自由基清除劑，可作用于腦梗死前期，抑制腦水腫，縮小腦梗死區(qū)面積，減輕神經(jīng)癥候群的程度，保護(hù)腦組織結(jié)構(gòu)和功能[1-5]。近年來，有關(guān)依達(dá)拉奉治療肌萎縮側(cè)索硬化癥、帕金森病、阿爾茨海默病[6-8]等的臨床研究正在進(jìn)行，而其抗癲癇、抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和抗纖維化作用開發(fā)前景廣闊[9-10]。該藥自2001年由日本三菱田邊制藥公司研發(fā)上市后，在全球范圍內(nèi)得到了廣泛使用。藥物制劑中有關(guān)物質(zhì)的檢測是其質(zhì)量研究的重要方面，現(xiàn)參考國內(nèi)外文獻(xiàn)[11-15]，建立高效液相色譜(HPLC)法測定依達(dá)拉奉注射液中有關(guān)物質(zhì)含量，以促進(jìn)該制劑質(zhì)量的提高?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260型和1160型高效液相色譜儀（美國Aglient公司）。

1.2 試藥

依達(dá)拉奉注射液（成都天臺山制藥有限公司，批號分別為 140101，140201，140202，140203）；依達(dá)拉奉對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度99.9%）；雜質(zhì)P1（純度 99.63% ）、雜質(zhì) P3（純度 99.07% ）均由成都瑞特恩科技有限公司提供；雙吡唑啉酮（Alfa Aesar A Johnson Matthey Company，純度為 98.00% ）；依達(dá)拉奉三聚物（深圳振強(qiáng)生物科技有限公司，批號為 Z20130225）。磷酸二氫銨、磷酸均為分析純，甲醇為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Tianhe Kromail C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：以 0.02 mol／L 磷酸二氫銨溶液 - 甲醇（55 ∶45，V／V，用 20% 磷酸溶液調(diào) pH 至 3.0 ）為流動相 A，以 0.02 mol／L 磷酸二氫銨溶液 -甲醇（25 ∶75，V／V，用 20%磷酸溶液調(diào)pH至3.0）為流動相 B，梯度洗脫程序見表 1；流速：1.0 mL ／min；柱溫：35 ℃ ；檢測波長：245 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

表1 梯度洗脫程序（%）

2.2 溶液制備

系統(tǒng)適用性溶液：1）雙吡唑啉酮貯備液，稱取雙吡唑啉酮對照品約 12.5 mg，置 25 mL容量瓶中，加 N，N-二甲基甲酰胺超聲使溶解并稀釋至刻度，再精密量取1 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。2）雜質(zhì)P1貯備液，稱取雜質(zhì)P1對照品約10 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻。3）雜質(zhì) P3貯備液，稱取雜質(zhì) P3對照品約 12.5 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，再精密量取1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。稱取依達(dá)拉奉對照品5 mg，置100 mL容量瓶中，精密加入上述3種貯備液各1 mL，用流動相A稀釋至刻度，搖勻，即得系統(tǒng)適用性溶液。因三聚物結(jié)構(gòu)式的空間位阻較大，不易形成，且在本品穩(wěn)定性研究中三聚物均未檢出，故將三聚物按未知雜質(zhì)控制。三聚物對照品只用于色譜條件專屬性研究。

供試品溶液：精密量取依達(dá)拉奉注射液3.0 mL，置10 mL容量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，搖勻，即得。

自身對照溶液：精密量取供試品溶液0.5 mL，置100 mL容量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，搖勻，即得。

空白輔料溶液：按依達(dá)拉奉注射液處方比例及工藝，制得不含依達(dá)拉奉的溶液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別取空白輔料溶液、系統(tǒng)適用性溶液及供試品溶液各20 μL，進(jìn)樣，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍。結(jié)果空白輔料對各有關(guān)物質(zhì)的測定均無干擾，依達(dá)拉奉與各已知雜質(zhì)（雙吡唑啉酮、三聚物、雜質(zhì)P1和雜質(zhì)P3）之間分離均良好，雜質(zhì)與雜質(zhì)間的分離度均符合要求，依達(dá)拉奉峰與雜質(zhì)P3峰的分離度為3.94，表明本方法的專屬性良好。色譜圖見圖1。

破壞性試驗(yàn)：取樣品（批號為 140101）1.0 mL，共5份，分別置5個25 mL容量瓶中，進(jìn)行不同條件下的降解試驗(yàn)。第1份為未經(jīng)破壞的樣品；第2份加10%H2O21 mL，80℃水浴中放置15 min，作為氧化破壞試驗(yàn)樣品；第3份加6 mol／L HCl 1 mL，于80℃水浴中加熱26.5 h后調(diào)pH至7.0，作為酸破壞試驗(yàn)樣品；第4份加6 mol／L NaOH 1 mL，于 80℃水浴中加熱 5 h后調(diào) pH至 7.0，作為堿破壞試驗(yàn)樣品；第 5份加水 5 mL后置80℃水浴中加熱25.5 h，作為熱破壞試驗(yàn)樣品。上述5種條件下的樣品均用流動相A定容。另取2.2項(xiàng)下空白輔料溶液1.0 mL進(jìn)樣。結(jié)果空白輔料在主峰相對保留時間約0.35倍處有峰出現(xiàn)，但酸、堿、熱及氧化條件下降解產(chǎn)物保留時間均在輔料峰后，表明測定有關(guān)物質(zhì)時，可扣除輔料峰，即主峰相對保留時間約0.35倍之前的峰。結(jié)果顯示，不同破壞性條件下產(chǎn)生的雜質(zhì)對依達(dá)拉奉有關(guān)物質(zhì)的測定無干擾，且各降解產(chǎn)物之間及與主峰之間的分離均較好，物料平衡，輔料無干擾且無明顯降解產(chǎn)物；在酸、堿、熱條件下，樣品較穩(wěn)定。表明擬訂色譜條件能有效檢出本品有關(guān)物質(zhì)。色譜圖見圖2。

檢測限和定量限：取樣品及各已知雜質(zhì)對照品適量，加甲醇溶解作為各貯備液，取適量，用流動相A逐級稀釋，進(jìn)樣量均為 20 μL。當(dāng)信噪比(S／N)為 10 ∶1時，測定定量限；當(dāng) S／N為3∶1時，測定檢測限。結(jié)果各雜質(zhì)的檢測限均較低，本品擬訂的進(jìn)樣質(zhì)量濃度為0.45 mg／mL，進(jìn)樣體積為 20 μL；S ／N 為 3 ∶1，能保證含量大于0.02%的雜質(zhì)能被檢出；能保證樣品中含量大于 0.01%的未知雜質(zhì)、0.006%的雙吡唑啉酮、0.001% 的 P1、0.01% 的 P3、0.01% 的三聚物被檢出。表明擬訂進(jìn)樣量及進(jìn)樣質(zhì)量濃度能保證本品各雜質(zhì)的有效檢出，滿足質(zhì)量控制要求。

圖1 專屬性試驗(yàn)高效液相色譜圖

圖2 破壞試驗(yàn)高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：分別稱取依達(dá)拉奉對照品及各已知雜質(zhì)對照品適量，分別用甲醇和流動相A溶解并稀釋制成系列質(zhì)量濃度溶液，分別進(jìn)樣20 μL，以峰面積（Y）對質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，詳見表2?？梢?，依達(dá)拉奉、雙吡唑啉酮、雜質(zhì) P1、雜質(zhì)P3及三聚物的線性關(guān)系均較好，r≥0.999 6。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

加樣回收試驗(yàn)：精密量取樣品（批號為 140101）3.0 mL，置 10 mL容量瓶中，按樣品定量限 80%，100%，120%的量加入雜質(zhì)對照品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件測定有關(guān)物質(zhì)，每個濃度平行測定3次。結(jié)果見表3，各已知雜質(zhì)不同質(zhì)量濃度的平均回收率均在99.46% ～101.57%之間，RSD 均小于 4.1%（n＝9）。

精密度試驗(yàn)：取樣品（批號為140101）適量，按2.2項(xiàng)下方法分別制備6份供試品溶液和0.5%對照品溶液，依法測定有關(guān)物質(zhì)含量，檢出結(jié)果基本一致，表明本方法重復(fù)性良好。雜質(zhì)P1、雜質(zhì) P3、雙吡唑啉酮、未知雜質(zhì)及總雜質(zhì)的 RSD均小于2.4%；由不同試驗(yàn)人員分別建立不同色譜系統(tǒng)，分別連續(xù)測定6份同批（批號為140101）樣品，結(jié)果12份樣品的有關(guān)物質(zhì)檢出結(jié)果基本一致，表明本方法精密度較好。分別取依達(dá)拉奉對照品和各已知雜質(zhì)對照品適量，用甲醇和流動相A溶解并稀釋成一定濃度的溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果進(jìn)樣精密度良好，已知雜質(zhì)對照品溶液、自身對照溶液峰面積的 RSD均小于0.9%(n＝6)。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（%，n＝9）

穩(wěn)定性試驗(yàn)：1）對照品溶液，取雜質(zhì)P1、雜質(zhì)P3對照品各適量，用甲醇和流動相A溶解并稀釋至分別含4，1 μg／mL 的溶液，室溫放置 0，1.0，2.5，4.0，6.0，7.0，8.0 h 后取 20 μL 進(jìn)樣，記錄色譜圖；取依達(dá)拉奉對照品、雙吡唑啉酮對照品各適量，用甲醇（其中雙吡唑啉酮用 N，N-二甲基甲酰胺溶解）和流動相A溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為1 μg／mL的溶液，將該雜質(zhì)對照品溶液室溫放置 0，2，4，6，7，8 h 后取 20 μL 進(jìn)樣，記錄色譜圖；結(jié)果各雜質(zhì)峰面積的 RSD均小于1.1%(n＝6)，說明各對照品溶液室溫放置8 h穩(wěn)定。2）供試品溶液及自身對照溶液，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液和自身對照溶液，分別在室溫下放置 0，2.5，5.3，8.0，14.3，18.5 h后，取20 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，并按主成分自身對照法計(jì)算峰面積的 RSD值。結(jié)果各雜質(zhì)峰面積的 RSD均小于5.0%（n＝6），表明供試品溶液及自身對照溶液室溫放置18.5 h穩(wěn)定。

耐用性試驗(yàn)：在2.1項(xiàng)下色譜條件基礎(chǔ)上，分別對流動相的組成及pH、流速、柱溫、檢測波長進(jìn)行耐用性考察。由于雜質(zhì)P3與主峰最近，其他雜質(zhì)與主峰及各雜質(zhì)之間分離均較好，故耐用性試驗(yàn)中主要考察依達(dá)拉奉與雜質(zhì)P3之間的分離度。結(jié)果本品有關(guān)物質(zhì)檢測方法中流速、柱溫、流動相pH、流動相B比例及檢測波長等因素發(fā)生一定程度變化時，本方法均能滿足試驗(yàn)要求，耐用性良好。

2.4 樣品含量測定

取3批樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢測，結(jié)果見表4?？梢姡肋_(dá)拉奉注射液中總雜質(zhì)含量均不大于0.3%。

表4 依達(dá)拉奉注射液有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果（%，n＝3）

3 討論

3.1 檢測波長選擇

通過對主藥依達(dá)拉奉和各已知雜質(zhì)（雙吡唑啉酮、三聚體、雜質(zhì)P1和雜質(zhì)P3）分別進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各成分在245 nm波長處吸收率接近；且樣品破壞性試驗(yàn)結(jié)果表明245 nm波長處降解雜質(zhì)的檢出率略高于240 nm波長處的檢出率，故以245 nm作為依達(dá)拉奉注射液有關(guān)物質(zhì)的檢測波長。

3.2 分析方法比較

取本品及原研制劑分別按自研方法及日本藥局方[16]收錄的依達(dá)拉奉有關(guān)物質(zhì)檢測方法進(jìn)行測定，對比考察不同方法下有關(guān)物質(zhì)的檢測情況，結(jié)果表明，自研方法中的雜質(zhì)檢出量較日本藥典多，且各雜質(zhì)間的分離度均較好；日本藥典收載的檢測方法沒有明確檢測的目標(biāo)雜質(zhì)，且色譜條件不能完全重現(xiàn)已知雜質(zhì)的相對保留時間；且苯肼作為合成本品的起始物料，其最大吸收波長（224 nm）與其他已知雜質(zhì)及主藥的最大吸收波長（240～245 nm）相差較大，在同一色譜條件下不能檢測出苯肼的真實(shí)量，因此單獨(dú)建立方法測定苯肼含量。