姜 燕，戴麗娜

（江蘇省連云港市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，江蘇 連云港 222006）

腫痛安膠囊由三七、天麻、僵蠶、白附子（制）、防風(fēng)、羌活、天南星（制）、白芷8味中藥組方，有祛風(fēng)化痰、行瘀散結(jié)、消腫定痛功效，臨床用于治療風(fēng)痰瘀阻引起的牙痛、咽喉腫痛、口腔潰瘍、痹病（癥見關(guān)節(jié)腫脹疼痛、筋脈拘攣、屈伸不利），以及破傷風(fēng)的輔助治療?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有對三七中人參皂苷Rg1的含量測定，而無其他有效成分的定量分析[1]。中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，成分間相互干擾明顯。為進(jìn)一步控制腫痛安膠囊的質(zhì)量，本研究中采用高效液相色譜(HPLC)法同時測定制劑中三七皂苷 R1、人參皂苷 Rg1、人參皂苷 Rb1的含量。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；BP211D型十萬分之一電子天平（德國 Sartorius公司）；超純水儀（美國 Milli-Q公司）；KQ-500TDB型高頻數(shù)控超聲波清洗器(上海星堯科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥

三七皂苷R1對照品、人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Rb1對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110745-201820， 110703-201832， 110704-201726，純度分別為 93.1% ，92.4% ，91.1%)；腫痛安膠囊（河北奧星集團(tuán)藥業(yè)有限公司，批號分別為161044，161103，161121）；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：以乙腈為流動相 A，水為流動相 B，按表 1 程序梯度洗脫；流速：1.0 mL／min；柱溫：30 ℃；檢測波長：203 nm；進(jìn)樣量：10 μL[2-5]。

表1 流動相梯度洗脫程序（%）

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

取三七皂苷 R1對照品 26.20 mg，人參皂苷 Rg1對照品 20.04 mg，人參皂苷 Rb1對照品 20.10 mg，精密稱定，置同一10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成混合對照品溶液，備用。取本品9 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率50 kHz）處理40 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，濾液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。按腫痛安膠囊的處方比例和生產(chǎn)工藝制備缺三七藥材的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：分別精密量取混合對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定(見圖1)，結(jié)果3種成分與相鄰色譜峰的分離度均不低于1.5。

專屬性試驗(yàn)：取混合對照品溶液和陰性對照品溶液各適量，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖（見圖1）。結(jié)果表明，陰性對照無干擾。

線性關(guān)系考察：分別精密移取混合對照品適量，用甲醇稀釋，配制成三七皂苷R1質(zhì)量濃度分別為487.80，243.90，122.00，60.98，15.25 μg ／mL，人參皂苷 Rg1質(zhì)量濃度為 370.30，185.20，92.58，46.29，11.57 μg ／mL，人參皂苷 Rb1質(zhì)量濃度為分別 366.20，183.10，91.56，45.78，11.44 μg／mL 的系列混合對照品溶液；進(jìn)樣測定，以峰面積比值（Y）為縱坐標(biāo)、待測成分質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程及線性范圍見表2。

表2 回歸方程和線性范圍(n＝5)

精密度試驗(yàn)：精密量取混合對照品溶液適量，制成三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1質(zhì)量濃度分別為 97.59，74.07，219.73 μg ／mL 的混合對照品溶液，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定。結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1峰面積積分值的 RSD 分別為 0.92%，0.88%，0.86%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：室溫下取供試品（批號為161044）溶液，24 h內(nèi)每隔2 h進(jìn)樣考察。結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷 Rg1、人參皂苷 Rb1峰面積積分值的 RSD分別為1.88% ，2.16% ，1.92% （n ＝ 13），表明室溫下供試品溶液放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號為161044）6份，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定。結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷 Rb1平均含量分別為 276.9，530.6，617.4 μg／g，RSD 分別為 1.76% ，1.96% ，2.08% （n ＝ 6），表明本方法重復(fù)性好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（批號為 161044）約 4.5 g，精密稱定，共6份，分別精密加入各對照品溶液適量，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果見表 3。

2.4 樣品含量測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，測定含量。結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 檢測波長選擇

三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1均為皂苷類，理化性質(zhì)相似，也有相似的色譜行為。2015年版《中國藥典（一部）》三七中這

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

注：A為三七皂苷R1，B為人參皂苷Rg1，C為人參皂苷Rb1。3種成分的檢測波長均為203 nm[2，6-10]。本試驗(yàn)中，在200～400 nm波長范圍內(nèi)對3種對照品進(jìn)行掃描，結(jié)果3種對照品均有較好吸收，故最終確定檢測波長為203nm。

表4 樣品含量測定結(jié)果（n＝6）

3.2 流動相選擇

本試驗(yàn)中對甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸溶液4種流動相系統(tǒng)[11-15]進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，人參皂苷Rb1色譜峰保留時間較長，為縮短檢測時間，故采用梯度洗脫。比較發(fā)現(xiàn)，以乙腈-水為流動相進(jìn)行梯度洗脫時，各色譜峰分離度達(dá)到要求，基線平穩(wěn)，各成分分離較好且峰形明顯，故被選擇。

3.3 提取溶劑和提取方法選擇

分別以甲醇、50%甲醇作為提取溶劑，采用超聲（15，40，60 min）、加熱回流（15，40，60 min）提取，結(jié)果顯示，以甲醇作為提取溶劑、超聲40 min的提取方法最簡便，提取完全，且待測成分峰峰形較好。

綜上所述，采用本研究中建立的HPLC法可同時測定腫痛安膠囊中3種皂苷成分的含量，該方法簡便快速，重復(fù)性好，專屬性強(qiáng)，可用于腫痛安膠囊的質(zhì)量控制。