陳 星 ，夏曉冬 ，童德銀 ，車道標(biāo) ，2

（1.江蘇省宿遷市第一人民醫(yī)院，江蘇 宿遷 223800； 2.江蘇省人民醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

肝纖維化發(fā)病機制復(fù)雜，與活化的肝星狀細胞沉積細胞外基質(zhì)有密切關(guān)系[1-2]。肝星狀細胞活化過程中產(chǎn)生大量的促炎因子、趨化因子和分子，許多炎性因子在肝星狀細胞的活化中起著關(guān)鍵作用，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素 1β（IL-1β）和白細胞介素 6（IL-6）[3]。此外，核因子κB（NF-κB）、活性氧、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和多種生長因子也促進肝星狀細胞的增殖，與增加的肌成纖維細胞共同作用，最終導(dǎo)致肝纖維化的多種信號通路的病理生理改變。轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）等分子靶標(biāo)在肝臟纖維化中具有重要意義。TGF-β是生長因子基因超家族中特征性細胞因子[4-5]，分布廣泛，被認為是強有力的促纖維化介質(zhì)，可促進肝星狀細胞的活化和細胞外基質(zhì)蛋白的沉積，從而導(dǎo)致肝纖維化[6]。同時，TGF-β與肝硬化的發(fā)展密切相關(guān)，可刺激細胞外基質(zhì)蛋白的產(chǎn)生并消除基質(zhì)蛋白的去除現(xiàn)象[7-9]。芒果苷是芒果葉的主要成分，是一種四羥基吡酮的碳糖苷，屬雙苯吡酮類化合物，具有抗炎和神經(jīng)保護等多種藥理特性[10]。本研究中探討了芒果苷對四氯化碳肝損傷模型小鼠的保護作用?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器與試藥

動物：無菌級ICR小鼠50只，雄性，8～12周，購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號 SCXK（滬）2008-0016。所有動物于室溫（22 ± 1）℃，空氣相對濕度40% ～50%，晝夜交替12 h，普通飼料喂養(yǎng)，自由進食、飲水。

儀器：UV-3200S型紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；680型酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）；BH-2型光學(xué)顯微鏡（日本 Olympus公司）；DYCZ-24KS型電泳儀（北京六一儀器廠）。

試藥：芒果苷（美國Sigma公司，批號為111607-200301）；所有抗體均購自 Cell Signaling Technology；TNF-α，IL-6，IL-1β 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（批號分別為 20060922，20060925，20060926），均購自南京凱基生物技術(shù)公司；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒（批號分別為20160514，20161157）均購自南京建成生物工程研究所；蘇木素-伊紅染液（HE，北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 方法

分組、給藥與建模：將50只ICR小鼠隨機分為5組，即空白對照組（A組，等體積0.9%氯化鈉溶液）、模型組（B組，等體積0.9%氯化鈉溶液）、水飛薊素組（C組，0.1 g／kg）和芒果苷低、高劑量組（D1組、D2組，20，40 mg／kg），各10只。上述后4組小鼠皮下注射四氯化碳 -橄欖油（1 ∶1，V／V)，3 mL／kg，每周 2 次，連續(xù)6周，以建立小鼠肝纖維化模型?？瞻讓φ战M小鼠皮下注射等量橄欖油。建模成功后，各組小鼠灌胃相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)6周。

肝臟組織病理學(xué)檢查：小鼠眼眶取血后處死，將肝臟組織固定于4%中性福爾馬林溶液中過夜。將組織固定包埋于石蠟中，切成4 mm厚的切片。然后去石蠟，HE染色，采用光學(xué)顯微鏡觀察肝臟病理改變情況。

AST和ALT活性檢測：采用干化學(xué)法和全自動生化分析儀檢測小鼠血清AST和ALT活性，嚴格按試劑盒說明書步驟操作。

TNF-α，IL-1β，IL-6含量檢測：采用 ELISA 法檢測小鼠血清 TNF-α，IL-1β，IL-6含量。嚴格按試劑盒說明書步驟操作。

炎性相關(guān)因子蛋白表達水平檢測：采用Western blot法檢測。將小鼠肝組織剪碎，取50 mg，加1 mL RIPA裂解液提取總蛋白，12 000 r／min離心15 min，收集上清液，采用BCA試劑盒進行蛋白定量。各組取20 μg上樣，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST清洗3次，加入一抗，4℃ 孵育過夜，回收一抗，TBST清洗4次，加入二抗，室溫振搖2 h，回收二抗，TBST清洗4次，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，將PVDF膜放入暗盒中，壓上X膠片，取出膠片后顯影、定影、清洗。然后，通過Image J軟件將條帶灰度值數(shù)字化，目的條帶與內(nèi)參條帶灰度比值為各目的蛋白相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析。計量資料以 X±s表示，行 t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響

A組小鼠肝臟中央靜脈和周圍肝細胞結(jié)構(gòu)正常。B組小鼠肝組織細胞存在氣球樣變性和脂肪變化，上述氣球樣變性和脂肪變化與纖維結(jié)締組織鏈和嚴重炎性細胞浸潤相關(guān)。C組和D1組、D2組上述肝組織病理形態(tài)學(xué)均有不同程度改善。詳見圖1。

2.2 其他觀察指標(biāo)

結(jié)果見表1和圖2。與A組比較，B組小鼠肝組織勻漿中正Nod樣受體蛋白3（NLRP3），凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（ASC），含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 1（Caspase-1），IL-1β，p-P65，P65，核因子 κB 抑制因子 α（IκBα），TGF- β，p-Samd-3，Smad-3 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01）；與 B組比較，C組和D1組、D2組小鼠肝組織勻漿中蛋白表達水平均顯著降低（P ＜0.01）。

3 討論

圖1 肝組織病理形態(tài)學(xué)（×200）

表1 各組小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶活性和炎性因子水平比較（X ±s，n＝10）

圖2 肝組織勻漿中相關(guān)炎性因子蛋白表達

抑制炎癥相關(guān)途徑是治療肝纖維化的有效靶點。本研究結(jié)果顯示，芒果苷可通過抑制 NLRP3，ASC，Caspase-1的表達，降低 p-P65和p-IκBα的生成，抑制TGF-β和p-Samd-3在肝組織中的表達，從而抑制NLRP3炎癥小體反應(yīng)。四氯化碳已被廣泛用于實驗性誘導(dǎo)肝纖維化[11-12]，其產(chǎn)生過量自由基，導(dǎo)致肝細胞膜脂質(zhì)過氧化，隨后釋放炎性細胞因子和損傷肝細胞。本研究結(jié)果顯示，20 mg／kg和40 mg／kg芒果苷能顯著改善模型小鼠ALT、AST、炎性細胞因子水平和肝組織病理形態(tài)等。

炎性過程為涉及成纖維過程的主要事件[13]。肝臟損傷時，肝巨噬細胞可激活NF-κB及其下游信號傳導(dǎo)。NF-κB作為轉(zhuǎn)錄因子，上調(diào)多種炎性細胞因子的釋放，包括 TNF-α，IL-6，IL-1β。TNF-α，IL-6，IL-1β，進一步維持炎性級聯(lián)反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，四氯化碳可增加小鼠血清 TNF-α，IL-6，IL-1β含量，升高p-IκBα表達水平，從而加重肝臟炎癥和纖維化[14]。20 mg／kg和 40 mg／kg芒果苷能顯著降低模型小鼠TNF-α，IL-6，IL-1β 的水平，對 NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也有明顯的抑制作用。

TGF-β可促進肝星狀細胞的活化和細胞外基質(zhì)蛋白的積累，導(dǎo)致肝纖維化，其過量產(chǎn)生會刺激細胞外基質(zhì)蛋白的各種成分的合成和釋放。一旦激活，TGF-β結(jié)合到Ⅰ型和Ⅱ型絲氨酸／蘇氨酸激酶受體，將激活受體調(diào)節(jié)的SMAS，包括Smad-3?；罨疭mads的核易位是操縱TGF-β依賴基因的基本過程。TGF-β／Smad信號通路失活可能是抗肝纖維化的一個有前途的治療靶點。本研究結(jié)果顯示，在四氯化碳處理的小鼠中，TGF-β和Smad-3磷酸的表達水平升高，20mg／kg和 40 mg／kg芒果苷可顯著抑制Smad-3和TGF-β的磷酸化。

綜上所述，芒果苷對肝損傷模型小鼠具有一定改善作用，其機制與降低炎性反應(yīng)有關(guān)。參考文獻：

[1]SANCHEZVALLE V，CHAVEZTAPIA NC，URIBE M，et al.Role of oxidative stress and molecular changes in liver fibrosis：a review[J].Current Medicinal Chemistry，2012，19（28）：4850-4860.

[2]REEVES HL，F(xiàn)RIEDMAN SL.Activation of hepatic stellate cells-a key issue in liver fibrosis[J].Frontiers Bioscience A Journal＆ Virtual Library，2002，7：d808-d826.

[3]TACKE F，WEISKIRCHEN R.Update on hepatic stellate cells：pathogenic role in liver fibrosis and novel isolation techniques[J].Expert Rev Gastroenterol Hepatol，2012，6（1）：67-80.

[4]SAKAI K，JAWAID S，SASAKI T，et al.Transforming growth factor- -independent role of connective tissue growth factor in the development of liver fibrosis[J] .American Journal Pathology，2014，184 （10）：2611-2617.

[5]BOURDBOITTIN K，BONNIER D，LEYME A，et al.Protease profiling of liver fibrosis reveals the ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif，1 as a central activator of transforming growth factor beta[J].Hepatology，2011，54（6）：2173-2184.

[6]KAMADA Y， TAMURA S， KISO S， et al.Enhanced carbon te-trachloride-induced liver fibrosis in mice lacking adiponectin[J].Gastroenterology，2003，125 （6）：1796-1807.

[7]NAKAMURA T，SAKATA R，UENO T，et al.Inhibition of trans 5 forming growth factor prevents progression of liver fibrosis and enhances hepatocyte regeneration in dimethylnitrosamine-treated rats[J].Hepatology，2000，32 （2）：247-255.

[8]ARMENDARIZBORUNDAJ，RINCóNAR，MUNOZVALLEJF，etal.Fibrogenic polymorphisms （TGF-beta，PAI-1，AT） in Mexican patients with established liver fibrosis.Potential correlation with pirfenidonetreatment[J].JInvestigMed，2008，56（7）：944-953.

[9]RALLON NI，BARREIRO P，SORIANO V，et al.Elevated TGF-1levels might protect HCV／HIV-coinfected patients from liver fibrosis[J].European Journal of Clinical Investigation，2011，41（1）：70-76.

[10]FENG J，ZHANG Q，MO W，et al.Salidroside pretreatment attenuates apoptosis and autophagy during hepatic ischemia-reperfusion injury by inhibiting the mitogen-activated protein kinase pathwayinmice[J].DrugDesDevelTher，2017，11：1989-2006.

[11]HERNANDEZ-MUNOZ R，DIAZ-MUNOZ M，SUAREZ J，et al.Adenosine partially prevents cirrhosis induced by carbon tetrachloride in rats[J].Hepatology，1990，12（2）：242-248.

[12]WEBER LW，BOLL M，STAMPFL A.Hepatotoxicity and mechanism of action of haloalkanes：carbon tetrachloride as a toxicological model[J].Critical Reviews in Toxicology， 2003， 33（2）：511-517.

[13]ELSHARKAWY AM，MANN DA.Nuclear factor-kappaB and the hepatic inflammation-fibrosis-cancer axis[J].Hepatology，2007，46 （2）：590-597.

[14]ORFILA C，LEPERT JC，ALRIC L，et al.Immunohistochemical distribution of activated nuclear factor B and peroxisome proliferator-activated receptors in carbon tetrachloride-induced chronic liver injury in rats[J].Histochemistry and Cell Biology，2005，123 （6）：585-593.