邱楚群 ，梁美婷 ，江文菁 ，吳海游 ，呂思敏 ，吳 鐵 ，

（1.廣東醫(yī)科大學(xué)中藥與新藥研究所，廣東 東莞 523808； 2.廣東醫(yī)科大學(xué)-廣東潤和生物科技有限公司輔酶Q10聯(lián)合研究中心，廣東 東莞 523808）

輔酶Q10又名泛醌，為廣泛存在于生物體內(nèi)的脂溶性醌環(huán)類化合物，可直接清除自由基以起到減輕氧化應(yīng)激和穩(wěn)定生物膜的作用[1]，可協(xié)同體內(nèi)的抗氧化物增強(qiáng)抗氧化作用，可通過抑制線粒體通透性和促進(jìn)三磷酸腺苷（ATP）的生成抑制細(xì)胞凋亡[2]，還可促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化而增強(qiáng)免疫[3-4]。Q伴侶為新型營養(yǎng)液，可增強(qiáng)輔酶Q10對(duì)皮膚的保護(hù)作用，主要成分為牛磺酸、硫辛酸等。?；撬釣橐杂坞x氨基酸形式存在于動(dòng)物體內(nèi)的含硫 β-氨基酸，具有增強(qiáng)免疫功能、細(xì)胞膜的抗氧化能力、心臟收縮能力，保護(hù)心血管系統(tǒng)和維持視覺功能等廣泛的生物學(xué)作用[5]。硫辛酸是由線粒體產(chǎn)生的含有二硫鍵的抗氧化劑，主要存在于心臟、肝臟和腎臟中，雙硫封閉環(huán)狀的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其具有較高的電子密度和親電子性，因而具有較強(qiáng)的抗氧化能力，臨床主要用于治療糖尿病、帕金森綜合征、心臟病、風(fēng)濕病等疾病[6]。隨著年齡的增長，機(jī)體抗氧化能力下降，抗氧化系統(tǒng)失衡，外源性補(bǔ)充輔酶Q10可提高機(jī)體清除自由基的能力，但輔酶Q10聯(lián)合Q伴侶是否對(duì)損傷皮膚有改善作用尚不明確。本研究中觀察了輔酶Q10聯(lián)合Q伴侶對(duì)模型大鼠皮膚氧化損傷的改善作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

動(dòng)物：清潔級(jí)SD健康大鼠32只，雄性，3月齡，體質(zhì)量(277.93±31.18)g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)為 SCXK（粵）2011-0015。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由飲水和進(jìn)食，且實(shí)驗(yàn)方案已得到學(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

儀器：手動(dòng)勻漿器（四川蜀牛玻璃儀器有限公司，規(guī)格為100 mL）；5810R型高速冷凍離心機(jī)，G25005型酶標(biāo)儀(德國 Eppendorf公司)；B00141型手搖式切片機(jī)（上海醫(yī)療器械四廠）；MGC30型光學(xué)顯微鏡及顯微照相機(jī)（德國Leica公司）。

試藥：輔酶Q10（廣東潤和生物科技有限公司，批號(hào)為16012120，以小麥胚芽油為溶劑，配成每100 mL含輔酶Q101 g的受試物供試品溶液）；Q伴侶（由本研究室根據(jù)本項(xiàng)目前期申報(bào)的發(fā)明專利配方配制，專利申請(qǐng)?zhí)枮?201610184057.0）。

1.2 方法

建模與分組、給藥：將32只SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（A組，等體積0.9%氯化鈉溶液）、模型組（B組，等體積 0.9% 氯化鈉溶液）、輔酶 Q10組（C 組，3 mL ／kg）、輔酶 Q10聯(lián)合 Q 伴侶組（D 組，3 mL ／kg+3 mL ／kg），各8 只。B組、C組、D組大鼠皮下注射 D-半乳糖（150mg／kg），每天1次，連續(xù)14 d，以建立皮膚氧化損傷模型[7-8]；A組大鼠皮下注射 0.9%氯化鈉注射液（150 mg／kg）；同時(shí)各組大鼠灌胃相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)14 d。

組織病理形態(tài)學(xué)觀察與表皮厚度測定：建模成功后，取0.5 cm×0.5 cm大鼠皮膚組織于10%中性甲醛液中固定，脫水后進(jìn)行石蠟包埋，切片厚度5 μm，脫蠟，蘇木素-伊紅（HE）染色，苦味酸酸性復(fù)紅（VG）染色，封片。在光學(xué)鏡顯微鏡下觀察病理形態(tài)學(xué)，以Image-Pro Plus 6.0軟件測定表皮厚度。

生化指標(biāo)測定：參照試劑盒說明書[9]測定大鼠皮膚組織勻漿中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平[9]，試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-1）mRNA表達(dá)水平測定：采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法。取大鼠皮膚組織，勻漿。Trizol法提取 RNA，鑒定完RNA純度和完整性后，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA；PCR反應(yīng)條件為，預(yù)變性95℃，10 min；95℃變性 15 s，60℃退火 60 s，循環(huán) 40次；60℃→90℃，每15 s升溫 0.3℃。GADPH上游引物為 CACTCCCTTGGACTCACTCATT（5′-3′）， 下 游 引 物 為 TGTGGTGTTGTTGCACCTGTT（5′-3′）； MMP-1 上 游 引 物 為TTCCTACCCCCAATGTATCCG（5′-3′）， 下 游 引 物 為CATGAGGTCCACCACCCTGTT（5′-3′）。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，定量分析PCR獲得的熔解曲線和擴(kuò)增曲線結(jié)果的可靠性，并設(shè)定循環(huán)閾值（Ct），以 MMP-1／GADPH 比值分別代表相對(duì)表達(dá)水平，2-ΔΔCt法計(jì)算MMP-1的相對(duì)表達(dá)水平。各組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT1）蛋白表達(dá)水平測定：采用Western blot法。取大鼠皮膚組織，加入1 mL RIPA蛋白裂解液，冰上勻漿，每隔5 min超聲20 s，檢測蛋白含量。以10%SDS-PAGE電泳后濕法電轉(zhuǎn)，加入一抗，4℃ 孵育過夜，回收一抗，清洗3次，加入二抗，室溫振搖1 h，回收二抗，清洗3次，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，顯影、定影、清洗。用Image J軟件將條帶灰度值數(shù)字化，目的條帶與內(nèi)參條帶灰度比值為蛋白相對(duì)表達(dá)量[10]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以 X±s表示，行 t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠皮膚病理形態(tài)學(xué)

A組大鼠皮膚角質(zhì)層無脫落，膠原纖維排列均勻整齊；B組大鼠皮膚表皮厚度明顯變薄，角質(zhì)層飄起脫落，膠原纖維變粗?jǐn)嗔?，排列紊亂；C組大鼠表皮厚度有所增加，角質(zhì)層無脫落，膠原纖維排列整齊，且大小良好；D組大鼠表皮厚度明顯增加，角質(zhì)層無脫落，膠原纖維排列整齊，粗細(xì)均勻。詳見圖1。

圖1 各組大鼠皮膚組織病理形態(tài)學(xué)（×200）

2.2 其他觀察指標(biāo)

結(jié)果見表1、圖2至圖4。

表1 大鼠皮膚組織勻漿中生化指標(biāo)水平比較（X±s，n＝8）

注：與 A 組比較， P ＜0.05；與 B 組比較，#P ＜0.05。

圖2 各組大鼠皮膚的表皮厚度

圖3 各組大鼠皮膚組織勻漿中MMP-1表達(dá)水平

圖4 各組大鼠皮膚組織勻漿中DNMT1表達(dá)水平

3 討論

本研究中采用 D-半乳糖皮下注射建立大鼠皮膚氧化損傷模型，皮膚的氧化損傷是由機(jī)體自由基（如MDA）過多造成的，正常情況下機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)可以清除、轉(zhuǎn)化過多的自由基，但由于機(jī)體受到外部刺激，自由基數(shù)量會(huì)成倍增加，造成抗氧化系統(tǒng)負(fù)擔(dān)過重，無法快速地清除自由基，同時(shí)過多自由基也會(huì)攻擊機(jī)體的氧化酶（如SOD，GSH-Px），導(dǎo)致氧化酶的活性下降，形成惡性循環(huán)[11-12]。D-半乳糖是由半乳糖氧化酶所代謝生成的半乳糖醛，半乳糖醛無法進(jìn)一步代謝，這使得細(xì)胞內(nèi)的滲透壓升高，并產(chǎn)生大量自由基，造成大鼠皮膚氧化損傷[13]。模型組大鼠機(jī)體產(chǎn)生大量MDA，同時(shí)SOD及GSH-Px的活性減弱，造成大鼠機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致皮膚組織的MMP-1表達(dá)水平升高與DNMT1表達(dá)水平降低，表皮厚度增加，纖維排列紊亂，皮膚出現(xiàn)氧化損傷情況。另一方面，D-半乳糖少量還以游離態(tài)形式存在于乳汁中，并與葡萄糖結(jié)合構(gòu)成乳糖，對(duì)嬰幼兒的生長發(fā)育可起到促進(jìn)作用，但當(dāng)大劑量食用D-半乳糖會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)，這一點(diǎn)與 D-半乳糖造成皮膚氧化損傷的原理一致[14]，故 D-半乳糖是把“雙刃劍”。

輔酶Q10為機(jī)體抗氧化劑和非特異性免疫增強(qiáng)劑，可清除機(jī)體MDA等自由基，維護(hù)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)平衡，改善氧化應(yīng)激狀態(tài)，起到抗氧化損傷作用[15-16]。體內(nèi)輔酶Q10的水平與皮膚活性氧簇（ROS）的產(chǎn)生量呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)輔酶Q10含量下降到正常值的30%～50%時(shí)，皮膚組織中的ROS含量則明顯增加，輔酶Q10的含量與ROS的產(chǎn)生增多和細(xì)胞死亡存在一定的相關(guān)性[17-18]。C組大鼠癥狀明顯比B組大鼠輕，這是由于輔酶Q10可以維護(hù)機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)平衡，同時(shí)清除機(jī)體過多的自由基，緩解氧化應(yīng)激狀態(tài)。Q伴侶主要含牛磺酸、硫辛酸，首先，?；撬峥梢种扑矔r(shí)受體點(diǎn)位TRPM2的激活，減少氧化應(yīng)激，還可通過羧-氨反應(yīng)減少醛類所造成的細(xì)胞損傷，也能通過抑制Caspase-3 mRNA的表達(dá)，起到抗氧化抗衰老的作用[19]。其次，硫辛酸和輔酶Q10的混合劑能對(duì)抗運(yùn)動(dòng)所引起的疲勞[20]，硫辛酸不僅可清除自由基和再生體內(nèi)的抗氧化劑，還可通過還原PMSR，使其參與到生物大分子的殘基修復(fù)過程中，維持機(jī)體的穩(wěn)定[6]，因此Q伴侶與輔酶Q10起到了協(xié)同作用。

綜上所述，輔酶Q10聯(lián)合Q伴侶對(duì)模型大鼠皮膚氧化損傷有一定改善作用，其機(jī)制與抗氧化有關(guān)。參考文獻(xiàn)：

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