趙嘉涵， 賈雨涵， 湯雅婷， 林藝鑫， 王艷蕾

(華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系， 河北 唐山 063210)

腸缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)損傷在小腸移植、嚴(yán)重感染、低氧等疾病的病理演變過程中起重要作用[1]。腸I/R不僅引起消化道局部組織損傷，而且對遠(yuǎn)隔器官特別是肺的結(jié)構(gòu)和功能造成嚴(yán)重?fù)p害[2]。細(xì)胞凋亡在腸I/R損傷的病理過程中起重要作用，而凋亡信號的啟動與p38MAPK的激活有關(guān)[3-5]。參麥注射液(Shenmai injection, SM)是現(xiàn)代中醫(yī)危重病治療的常用藥物，在臨床上主要用于改善缺血時的微循環(huán)障礙。本室研究已證實參麥注射液對腸I/R肺損傷具有保護(hù)作用，其機制可能與抑制中性粒細(xì)胞的聚集，對抗脂質(zhì)過氧化損傷有關(guān)[6]，而參麥注射液的抗腸I/R肺損傷作用是否還與抑制p38MAPK的活化及細(xì)胞凋亡有關(guān)，目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道。故本研究通過觀察參麥注射液對腸I/R肺損傷大鼠肺組織p38MAPK和凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響，探討其保護(hù)機制。

1 材料與方法

1.1 材料

動物：清潔級SD大鼠24只，體質(zhì)量(250±50)g，雌雄各半，8周齡，購自北京華阜康生物科技有限公司，動物合格證號：SCXK京2009-0004，動物常規(guī)喂養(yǎng)，術(shù)前禁食12 h，自由飲水。試劑：參麥注射液(河北神威藥業(yè)有限公司，批號Z13020888)，Bcl-2、Bax和p38MAPK多克隆抗體及免疫組化測試盒(武漢博士德生物工程有限公司)。主要儀器：石蠟切片機(德國Leica RM2145)，光學(xué)顯微鏡(Olympus 公司)。

1.2 大鼠腸I/R模型制備

大鼠腹腔注射烏拉坦(1 g/kg)麻醉，仰臥固定于手術(shù)板上，常規(guī)消毒后取腹正中切口3～4 cm，將腸管推向左側(cè)，鈍性分離出腸系膜上動脈(superior mesenteric artery, SMA)，在其根部用無創(chuàng)傷血管夾夾閉阻斷該動脈血運1 h后松夾，恢復(fù)血流后觀察1 h，造成大鼠腸I/R損傷模型。

1.3 動物分組及標(biāo)本采集

實驗動物隨機分為對照組(Control組)、腸缺血再灌注組(I/R組)、參麥注射液組(SM+I/R組)，每組8只。對照組只分離出腸系膜上動脈，不行夾閉；I/R組和SM+I/R組為造模成功后大鼠。各組分別于夾閉前、松夾前、松夾后30 min 3個時間點對每只大鼠給予如下處理：對照組和I/R組大鼠尾靜脈推注生理鹽水9 ml/kg；SM+I/R組大鼠尾靜脈推注SM 9 ml/kg。各組大鼠于松夾后1 h處死，并取肺組織，一部分-70℃保存，待測相應(yīng)指標(biāo)；一部分冰鹽水漂凈，濾紙吸干，待測肺濕/干比值；一部分經(jīng)福爾馬林固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片。

1.4 肺組織濕/干比值的測定

取左肺組織，吸干表面水分后稱質(zhì)量，為濕重(wet weight, W)，然后將肺組織置80℃恒溫烤箱，干燥48 h至恒重后再稱質(zhì)量，為干重(dry weight, D)，計算肺組織濕重與干重比值(wet/dry weight ratio, W/D)，表示肺組織水腫形成情況。

1.5 肺表面活性物質(zhì)(PS)的測定

提取肺組織勻漿的磷脂，采用薄層層析法進(jìn)行分離，然后經(jīng)無機磷定量法測定PS的主要功能成分卵磷脂(phosphatidylcholine, PC)及總磷脂(total phospholipid, TPL)的含量[7,8]。

1.6 肺組織p38MAPK及凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的檢測

采用免疫組織化學(xué)法，參照試劑盒推薦方法進(jìn)行。光鏡下細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，用吸光度分析軟件進(jìn)行定量分析，每張切片隨機選取10個視野(×400)測定其吸光度值(absorbance, A)，計算平均吸光度值(mA)反映其表達(dá)強弱。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組肺組織濕/干比值(W/D)、肺表面活性物質(zhì)主要功能成分(PC、TPL)含量的變化

I/R組肺組織W/D明顯升高，而肺表面活性物質(zhì)主要功能成分PC和TPL的含量顯著降低，與Control組比較差異顯著(P<0.01)；參麥注射液治療后肺組織W/D明顯降低，肺表面活性物質(zhì)主要功能成分PC和TPL的含量增加，與I/R組比較差異顯著(P均<0.01，表1)。

GroupW/DPC(mg/g)TPL(mg/g)Control1.75±0.19**8.88±0.86**17.79±0.55**I/R3.23±0.336.58±0.9114.05±0.54SM+I/R2.44±0.17**##8.34±1.05**# 16.59±0.41**#

W/D: Wet/dry weight ratio; PC: Phosphatidylcholine; TPL: Total phospholipid; I/R: Ischemia/reperfusion group; SM+I/R : Shenmai injection treated group

**P<0.01vsI/R group;#P<0.05,##P<0.01vscontrol group

2.2 各組肺組織細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(Bax與Bcl-2)蛋白表達(dá)的變化

免疫組化檢測結(jié)果表明，Bcl-2和Bax免疫組化陽性信號均可不同程度表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞及肺小血管壁的胞漿內(nèi)，呈棕黃色顆粒或勻質(zhì)狀，Control組呈弱陽性表達(dá)。腸缺血/再灌注后，肺組織細(xì)胞Bcl-2和Bax的表達(dá)均明顯強于Control組，其中Bax的增強比Bcl-2的增強更為明顯，Bcl-2/Bax比值降低(P<0.01)。SM+I/R組Bcl-2的表達(dá)強于I/R組，而Bax的表達(dá)低于I/R組，但仍高于Control組，Bcl-2/Bax比值明顯升高(P< 0.01, 表2, 圖1)。

GroupBcl-2(mA)Bax(mA)Bcl-2/BaxControl0.052±0.015**0.026±0.002**2.185±0.239**I/R0.089±0.0080.076±0.0031.129±0.058SM+I/R0.113±0.006**##0.058±0.005**##1.935±0.319**##

I/R: Ischemia/reperfusion group; SM+I/R : Shenmai injection treated group

**P<0.01vsI/R group;##P<0.01vscontrol group

Fig.1Expressions of Bcl-2 (A-C) and Bax (D-F) proteins in lung tissues (SP ×400)

A, D： Control group； B, E： I/R group；C, F： SM+I/R group

2.3 各組肺組織細(xì)胞p38MAPK蛋白表達(dá)的變化

免疫組化檢測結(jié)果表明，p38MAPK陽性信號不同程度表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞及肺小血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿中，呈棕黃色顆粒，Control組偶有少量陽性表達(dá)[(0.092±0.018)mA]，缺血/再灌注后p38MAPK蛋白陽性表達(dá)明顯增多 ((0.135±0.013)mA，P<0.01)，參麥注射液治療后p38MAPK蛋白陽性表達(dá)明顯降低((0.102±0.015)mA，P< 0.01，圖2，圖3)。

I/R: Ischemia/reperfusion group; SM+I/R : Shenmai injection treated group

**P<0.01vsI/R group;##P<0.01vscontrol group

Fig.3Expressions of p38MAPK proteins in lung tissues (SP ×400)

A： Control group； B： I/R group； C： SM+I/R group

2.4 相關(guān)性分析

相關(guān)分析顯示，腸I/R時肺組織p38MAPK蛋白表達(dá)水平與肺表面活性物質(zhì)主要成分PC含量及凋亡基因Bcl-2/Bax比值呈負(fù)相關(guān)(r分別為 -0.787，-0.731，P均<0.01)。

3 討論

本研究結(jié)果表明，與對照組比較，I/R組肺組織W/D明顯升高，肺表面活性物質(zhì)主要功能成分PC和TPL的含量明顯降低，表明腸缺血/再灌注后肺泡Ⅱ型細(xì)胞受損，生成肺表面活性物質(zhì)減少，降低肺泡表面張力的作用減小，從而使肺泡失去其穩(wěn)定性，肺順應(yīng)性降低，肺泡表面張力對肺毛細(xì)血管血漿和肺組織間液的“抽吸”作用增強，導(dǎo)致肺水腫。

既往普遍認(rèn)為器官組織I/R損傷后最終必將引起細(xì)胞壞死，但最近一些研究表明，細(xì)胞凋亡在I/R損傷的病理生理過程中起著重要的作用。研究表明，細(xì)胞凋亡的發(fā)生、發(fā)展受到多種基因的調(diào)控，上調(diào)Bcl-2或下調(diào)Bax能抑制細(xì)胞凋亡，反之則促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2/ Bax比值的高低與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[9]。本研究結(jié)果顯示對照組肺組織細(xì)胞Bcl-2和Bax呈弱陽性表達(dá)。腸I/R后，肺組織細(xì)胞Bcl-2和Bax的表達(dá)均明顯強于對照組，其中Bax的增強比Bcl-2的增強更為明顯，Bcl-2/Bax比值降低，說明腸I/R時肺損傷與肺組織細(xì)胞凋亡有關(guān)。而凋亡信號的啟動與多種因素有關(guān)，近年來研究證實p38MAPK信號通路的激活是啟動細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素[10,11]。p38MAPK信號通路是MAPK家族中重要的成員之一，主要經(jīng)酪氨酸蛋白激酶途徑激活，缺血缺氧、自由基、細(xì)胞因子等多種細(xì)胞外應(yīng)激刺激可激活p38MAPK，而激活的p38MAPK轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，通過調(diào)節(jié)相應(yīng)效應(yīng)基因的表達(dá)，介導(dǎo)細(xì)胞的分化、存活、凋亡以及炎癥等多種細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)[12,13]。那么，p38MAPK信號通路是否參與腸I/R時遠(yuǎn)隔器官肺損傷的病理過程以及是否與細(xì)胞凋亡的啟動有關(guān)呢，我們又觀察了肺組織p38MAPK蛋白表達(dá)及其與肺表面活性物質(zhì)和細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。結(jié)果顯示，對照組大鼠肺組織僅有很少量p38MAPK陽性表達(dá)，而I/R組肺組織p38MAPK蛋白表達(dá)明顯增強，同時相關(guān)分析顯示p38MAPK蛋白表達(dá)水平與肺表面活性物質(zhì)主要成分PC含量及凋亡基因Bcl-2/Bax比值呈負(fù)相關(guān)。因此本文作者推測：腸I/R時p38MAPK信號通路可能參與腸I/R肺損傷的發(fā)病過程，而p38MAPK信號通路的激活，啟動肺組織細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)肺損傷。

參麥注射液源于《癥因脈治》中的參冬飲，主要生藥成分是紅參、麥冬，具有益氣固脫、養(yǎng)陰生津的功效。近年研究顯示參麥注射液有抗休克、加強機體器官抗應(yīng)激能力，調(diào)節(jié)機體免疫功能和抗炎等作用，是現(xiàn)代中醫(yī)危重病治療的常用藥物。許多研究證實，參麥注射液能改善心、肝、腦等重要臟器的營養(yǎng)性血流量，增強機體耐缺氧能力[14]。研究發(fā)現(xiàn)，參麥注射液不僅能改善急性肺損傷患者的呼吸功能，緩解患者內(nèi)皮功能損傷[15]，而且對大鼠重癥急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷具有明顯保護(hù)作用[16]。本室研究也證實參麥注射液可通過抑制脂質(zhì)過氧化損傷保護(hù)肢體以及腸缺血/再灌注時肺損傷[6,17]。而前文已證實p38MAPK信號通路及細(xì)胞凋亡參與腸I/R肺損傷，那么參麥注射液對腸I/R肺損傷的保護(hù)作用是否與p38MAPK信號通路及細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用參麥注射液后大鼠肺組織W/D降低，肺表面活性物質(zhì)含量升高，肺組織p38MAPK蛋白表達(dá)水平明顯降低，同時肺組織Bax蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2/Bax的比值明顯升高；而且結(jié)果還顯示p38MAPK蛋白表達(dá)水平與肺表面活性物質(zhì)主要成分PC含量及凋亡基因Bcl-2/Bax比值呈負(fù)相關(guān)。因此本文作者認(rèn)為：參麥注射液可能是通過抑制p38MAPK信號通路的激活，進(jìn)而下調(diào)促凋亡基因Bax的表達(dá)，上調(diào)抑凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，提高Bcl-2/Bax比值來阻抑細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)腸缺血/再灌注肺組織。