謝克儉, 黃 玲, 屈小虎， 李 雪， 王少杰， 肖 敏

(溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院， 浙江 溫州 325035)

2型糖尿病(type 2 diabetes melliters，T2DM)發(fā)病率逐年上升。據(jù)報(bào)道，全世界糖尿病患者已超過(guò)2億，而且在未來(lái)20年內(nèi)可能突破3億[1]。T2DM是一種糖代謝紊亂的代謝性疾病，其發(fā)病機(jī)制主要分為：(1)胰島β細(xì)胞功能受損導(dǎo)致胰島素分泌缺失；(2)肝臟和肌肉組織對(duì)胰島素的敏感性下降，對(duì)葡萄糖的攝取和利用發(fā)生障礙。2型糖尿病的臨床特征主要是高血糖，發(fā)病原因復(fù)雜，常見(jiàn)因素有肥胖、缺乏鍛煉和應(yīng)激反應(yīng)[2]。T2DM發(fā)展到后期，嚴(yán)重影響腎功能，可引發(fā)腎衰竭和其他并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的身體健康和生命安全。目前，該疾病的治療方式是藥物治療(口服降糖藥及胰島素治療)和非藥物治療(運(yùn)動(dòng)治療和飲食治療)[3]。T2DM仍然無(wú)法根治，臨床上使用的藥物只能相對(duì)控制血糖，所以開(kāi)發(fā)新藥是非常必要的。研究報(bào)道：脂聯(lián)素(源于脂肪細(xì)胞)是一種脂肪細(xì)胞因子，脂聯(lián)素能改善胰島素抵抗，并且改正異常的糖脂代謝[4-5]。2013年，Okada-Iwabu M等發(fā)現(xiàn)AdipoRon(與脂聯(lián)素作用相似的小分子化合物)能夠降低2型糖尿病小鼠的胰島抵抗，減弱脂肪組織炎癥反應(yīng)[6-7]。本課題組致力于研究AdipoRon，前期發(fā)現(xiàn)該小分子化合物能夠促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞的胰島素敏感性，減弱肝臟的氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低2型糖尿病小鼠的胰島素抵抗反應(yīng)。本研究通過(guò)檢測(cè)口服AdipoRon(50 mg/kg、20 mg/kg)對(duì)2型糖尿病小鼠胰腺和脾臟腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、胰島素受體(insulin receptor，INSR)、胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1，IRS-1)、脾臟系數(shù)，以及對(duì)胰腺磷酸化胰島素受體底物1(phosphorylation insulin receptor substrate 1，p-IRS-1)和胰島素(insulin)mRNA表達(dá)的影響，探討AdipoRon對(duì)糖尿病小鼠脾臟和胰腺組織的保護(hù)作用機(jī)制，以期為臨床治療2型糖尿病提供新方案。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57/BL6小鼠40只，體重(25.0～26.0)g，購(gòu)自上海史萊克公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

血糖測(cè)試儀A-3型(三諾)，全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)，小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Thermo)，NanoDrop 2000核酸蛋白分析儀(Thermo)，S1000TMThermal Cycler梯度PCR儀(Bio-Rad)，CFX ConnectTM熒光定量PCR檢測(cè)系(Bio-Rad)。

1.3 主要試劑

鏈脲佐菌素(STZ)、AdipoRon(購(gòu)自上海恩美科技有限公司)；Trizol(invitrogen)，小鼠INSR、IRS-1和TNF-α的ELISA試劑盒(購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司)；Insulin和actin primers(上海生工設(shè)計(jì))；PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TakaRa)；SYBR Green(Bio-Rad)。

1.4 模型制備及分組

40只SPF級(jí)雄性C57/BL6小鼠(由本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)體重25～26 g，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC)10只，造模組30只。造模組小鼠喂以高糖高脂飼料35 d后，每只小鼠在禁食12 h后腹腔注射鏈脲佐菌素40 mg/kg (臨用前用0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液配成1% STZ、pH 4.2 的溶液)，隔周再注射1次。注射后72 h取尾血測(cè)空腹血糖，血糖濃度≥11.6 mmol/L為糖尿病小鼠。造模成功小鼠隨機(jī)分為糖尿病模型(DM)組、低劑量AdipoRon(DM+L)組、高劑量AdipoRon(DM+H)組，每組10只。

1.5 給藥、標(biāo)本采集及計(jì)算脾臟系數(shù)

使用去離子水溶解AdipoRon至終濃度1 mg/mL，DM+L組小鼠灌胃20 mg/kg AdipoRon，DM+H組小鼠灌胃50 mg/kg AdipoRon，NC、DM組則灌胃等體積去離子水，每日1次，共10日。末次干預(yù)后禁食12 h，稱量小鼠體重。摘除眼球法取血液樣本，3 500 r/min離心5 min，取上清，保存于4℃。取各組小鼠脾臟、胰腺。用電子天平稱量小鼠脾臟質(zhì)量，計(jì)算脾臟系數(shù)=脾臟質(zhì)量(mg)/體重(g)。將部分胰腺放入對(duì)應(yīng)編號(hào)的包埋盒中，以4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定；剩余胰腺放入對(duì)應(yīng)編號(hào)的冷凍管中，置-80℃冰箱中保存。

1.6 胰腺和脾臟INSR、IRS-1和TNF-α蛋白質(zhì)含量測(cè)定

剪取30～50 mg的胰腺或脾臟(約綠豆大小)，放于2 ml EP管中，加入800 μl PBS溶液，于8 000 r/min，4℃離心3 min，棄去PBS，反復(fù)清洗3次。每管樣本加入500 μl RIPA裂解液，使用臺(tái)式電動(dòng)勻漿器研磨組織，13 000 r/min，4℃離心20 min，取上清至新的EP管中。采用BCA法測(cè)定上清蛋白質(zhì)濃度，使用PBS將蛋白質(zhì)濃度調(diào)至2 mg/ml。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書操作，測(cè)定胰腺和脾臟INSR、IRS-1和TNF-α蛋白質(zhì)含量。

1.7 病理學(xué)觀察

取各組4%多聚甲醛固定的胰腺標(biāo)本，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋，切成4 μm厚切片，HE染色。用ECTIPSE 50I顯微圖像處理系統(tǒng)觀察并采集圖像，觀察各組胰腺組織形態(tài)變化。

1.8 胰腺組織中p-IRS-1蛋白質(zhì)水平測(cè)定

采用Western blot方法檢測(cè)p-IRS-1蛋白質(zhì)水平，使用Image J軟件對(duì)各組條帶進(jìn)行灰度分析，各組樣本灰度值比內(nèi)參β-actin灰度值以相對(duì)量表示蛋白質(zhì)量，使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.9 胰腺Insulin mRNA表達(dá)量測(cè)定

采用Trizol一步法提取小鼠胰腺總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，操作嚴(yán)格遵照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定insulin mRNA表達(dá)量，以β-actin為內(nèi)參。insulin mRNA上游引物序列 5’-GAC CCA GTA ACC ACC AGC CCT AAG T-3’，Insulin mRNA下游引物序列 5’-GAA CCA CAA AGG TGC TGC TTG AC-3’。嚴(yán)格按照熒光定量試劑盒操作，上機(jī)，擴(kuò)增結(jié)果以△CT值表示，各組小鼠樣本mRNA表達(dá)量以樣本中β-actin的△Ct值為基準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算，得到相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果用2-△△Ct表示。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組胰腺INSR、IRS-1、TNF-α水平比較

與正常對(duì)照組比較，DM組、DM+H組、DM+L組小鼠胰腺TNF-α均升高，INSR和IRS-1水平均明顯降低(P<0.05)；與DM組比較，DM+H組、DM+L組小鼠胰腺TNF-α水平下降，INSR和IRS-1水平均明顯升高(P<0.05)；與DM+L組比較，DM+H組胰腺TNF-α水平明顯下降，INSR和IRS-1水平均明顯升高(P<0.05，表1)

NC: Normal control; DM: Diabetes model control; DM+L: Diabetes model control with low AdipoRon; DM+H: Diabetes model control with high AdipoRon

*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsDM group；△P<0.05vsDM+L group

2.2 各組脾臟INSR、IRS1、TNF-α水平及脾臟系數(shù)的比較

與正常對(duì)照組比較，DM組、DM+H組、DM+L組小鼠脾臟TNF-α均明顯升高，INSR、IRS-1水平和脾臟系數(shù)均明顯降低(P<0.05)；與DM組比較，DM+H組、DM+L組小鼠脾臟TNF-α下降，INSR、IRS-1水平和脾臟系數(shù)均明顯升高(P<0.05)；與DM+L組比較，DM+H組脾臟TNF-α明顯下降，INSR和IRS-1水平均明顯升高(P<0.05，表2)。

2.3 小鼠胰腺病理學(xué)觀察

光鏡檢查正常對(duì)照組小鼠胰腺組織未見(jiàn)明顯異常，細(xì)胞排列緊密、飽滿、胰島體積大；DM組小鼠胰腺細(xì)胞排列較為疏散、胰島體積較小；DM+H組、DM+L組小鼠脾臟病理變化有不同程度減輕(圖1)。

Group INSR(ng/ml) IRS-1(pg/ml)TNF-α(pg/ml)Spleen coefficient(mg/g)NC7.87±0.722683.72±230.53220.74±19.655.07±0.65DM3.98±0.38*1650.67±154.31*387.43±33.05*3.11±0.73*DM+L4.95±0.48*#1987.32±185.64*#320.94±30.97*#3.97±0.41*#DM+H6.39±0.70*#△2335.74±254.83*#△287.97±29.66*#△4.40±0.51*#

NC: Normal control; DM: Diabetes model control; DM+L: Diabetes model control with low AdipoRon; DM+H: Diabetes model control with high AdipoRon; INSR: Insulin receptor; IRS-1: Insulin substrate 1

*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsDM group；△P<0.05vsDM+L group

Fig.1Comparison of hematoxylin-eosin (HE) staining on pancreas tissues in the four groups(×200)

NC: Normal control; DM: Diabetes model control; DM+L: Diabetes model control with low dipoRon; DM+H: Diabetes model control with high AdipoRon

2.4 各組胰腺組織中p-IRS-1蛋白質(zhì)水平的比較

小鼠胰腺p-IRS-1蛋白質(zhì)的免疫印跡灰度值統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，DM組小鼠p-IRS-1灰度值(0.54±0.05)明顯低于NC組小鼠(1.42±0.15,P<0.01)，DM+H組小鼠p-IRS-1灰度值(0.85±0.09)明顯高于DM組小鼠(0.54±0.05,P<0.05)，DM+L組小鼠p-IRS-1灰度值(0.70±0.06)與DM組小鼠(0.54±0.05)之間無(wú)顯著性差異(P>0.05, 圖2)。

Fig.2The comparison of p-IRS-1 level in pancreas among the four groups

NC: Normal control; DM: Diabetes model control; DM+L: Diabetes model control with low AdipoRon; DM+H: Diabetes model control with high AdipoRon; p-IRS-1: Phosphorylation insulin receptor substrate 1

**P<0.01vsNC group;#P<0.05vsDM group

2.5 各組胰腺組織Insulin mRNA表達(dá)的比較

對(duì)小鼠胰腺insulin mRNA表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果顯示，DM組小鼠insulin mRNA相對(duì)表達(dá)量(0.54±0.06)較NC組小鼠(0.98±0.03)顯著下降(P<0.01)。與DM組小鼠相比較，DM+H組小鼠insulin mRNA的相對(duì)表達(dá)量(0.87±0.08)均顯著上升(P<0.05)，DM+L組insulin mRNA的相對(duì)表達(dá)量(0.67±0.07)與DM組小鼠(0.54±0.06)無(wú)顯著差異(圖3)。

Fig.3Comparison of insulin expression in the tissues among four groups

NC: Normal control; DM: Diabetes model control; DM+L: Diabetes model control with low AdipoRon; DM+H: Diabetes model control with high AdipoRon

**P<0.01vsNC group;#P<0.05vsDM group

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，機(jī)體在高血糖和高游離脂肪酸刺激下會(huì)產(chǎn)生大量自由基，從而引起氧化應(yīng)激，進(jìn)而發(fā)生胰島素抵抗、胰島素分泌受損的情況。胰島素抵抗可能先于糖尿病發(fā)生，當(dāng)胰島素抵抗增強(qiáng)時(shí)，血糖才開(kāi)始升高；而高血糖則會(huì)加重氧化應(yīng)激，同時(shí)也可能激活應(yīng)激敏感信號(hào)通路，進(jìn)一步加重胰島素抵抗[8-9]。胰島β細(xì)胞是氧化應(yīng)激的靶點(diǎn)，胰島β細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性下降到低水平時(shí)，氧化應(yīng)激敏感性增強(qiáng)，進(jìn)而損傷β細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，氧化應(yīng)激可間接抑制β細(xì)胞功能(作用于胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路)，使得機(jī)體內(nèi)胰島素分泌水平降低，血糖升高[10]。胰島素受體(INSR)和磷酸化的胰島素受體底物1(p-IRS-1)是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的兩個(gè)重要介質(zhì)，在胰島功能受損、胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙、胰島素抵抗和2型糖尿病的形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[11]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor α，TNF-α)可以使細(xì)胞攝取葡萄糖減少，導(dǎo)致以肌肉、脂肪組織的胰島素受體自身磷酸化水平下降，胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受到干擾，胰島素的拮抗激素增多等多種方式來(lái)參與胰島素抵抗，TNF-α被認(rèn)為是觀察胰島素抵抗發(fā)生、發(fā)展及治療效果的關(guān)鍵指標(biāo)[11-12]。據(jù)報(bào)道，脂聯(lián)素的作用為改善胰島素抵抗，糾正糖脂代謝紊亂[4-5]，同時(shí)可抑制TNF-α[6]。日本東京大學(xué)的研究人員認(rèn)為，50 mg/kg AdipoRon能夠激活A(yù)MPK受體，從而發(fā)揮其治療作用[7]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)探索表明，更低劑量的AdipoRon能增加細(xì)胞的耗糖量[13]，故設(shè)計(jì)低劑量20 mg/kg和高劑量50 mg/kg藥物組，選取高糖高脂飼料喂養(yǎng)并注射鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的2型糖尿病小鼠模型進(jìn)行動(dòng)物水平研究。此實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立2型糖尿病小鼠模型，檢測(cè)口服AdipoRon(50 mg/kg、20 mg/kg)對(duì)2型糖尿病小鼠胰腺和脾臟組織中INSR、IRS-1和TNF-α蛋白質(zhì)含量，小鼠脾臟系數(shù)，胰腺組織中p-IRS-1蛋白和insulin mRNA表達(dá)水平的影響，旨在探討AdipoRon對(duì)糖尿病小鼠脾臟和胰腺組織的保護(hù)作用及機(jī)制。

脾臟是機(jī)體的最重要的免疫器官，2型糖尿病會(huì)影響機(jī)體正常的免疫功能。而胰腺是機(jī)體負(fù)責(zé)消化液分泌和胰島素分泌的重要器官。在本實(shí)驗(yàn)中，高糖高脂飼料喂養(yǎng)1個(gè)月加小劑量STZ(40 mg/kg)腹腔注射建立的糖尿病小鼠模型，斷尾取血，空腹血糖均大于11.6 mmol/L，符合2型糖尿病的發(fā)病特點(diǎn)。形態(tài)學(xué)觀察可見(jiàn)正常組小鼠胰腺組織細(xì)胞排列緊密、飽滿、胰島體積大；DM組小鼠胰腺組織細(xì)胞排列較為疏散、胰島體積較?。豢诜嗀dipoRon組小鼠胰腺組織細(xì)胞基本緊密、飽滿、胰島體積略小，表明成功構(gòu)建2型糖尿病小鼠模型。灌胃AdipoRon后發(fā)現(xiàn)：口服AdipoRon組小鼠胰腺和脾臟TNF-α含量明顯下降，脾臟系數(shù)升高。結(jié)果提示：AdipoRon可能通過(guò)下調(diào)胰腺和脾臟TNF-α的表達(dá)，保護(hù)脾臟來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體自身免疫功能，進(jìn)而抵御氧化應(yīng)激對(duì)胰島β細(xì)胞的損傷。與DM組比較，給予高劑量AdipoRon組小鼠胰腺和脾臟INSR和IRS-1水平均升高，胰腺p-IRS-1蛋白質(zhì)水平和insulin mRNA表達(dá)均升高，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示：(1)AdipoRon可通過(guò)上調(diào)INSR和IRS-1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，緩解糖尿病小鼠胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙；(2)AdipoRon可通過(guò)上調(diào)胰腺p-IRS-1蛋白質(zhì)水平和insulin mRNA的表達(dá)，對(duì)維持糖尿病小鼠胰島β細(xì)胞正常功能有一定作用?？诜嗀dipoRon通過(guò)下調(diào)糖尿病小鼠胰腺和脾臟TNF-α，上調(diào)INSR和IRS-1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平以及胰腺p-IRS-1蛋白，insulin mRNA的表達(dá)，對(duì)糖尿病小鼠脾臟和胰腺組織有一定的保護(hù)作用。

綜上所述，本研究通過(guò)構(gòu)建2型糖尿病小鼠模型，探討胰腺及脾臟相關(guān)指標(biāo)變化，證實(shí)AdipoRon對(duì)糖尿病小鼠胰腺和脾臟組織有一定的保護(hù)作用。