戴明珠， 呂圭源， 徐俞悅， 鄭 祥， 陳素紅,3△

(1. 溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 溫州 325035； 2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥與健康產(chǎn)品研究所， 杭州 310053； 3. 浙江工業(yè)大學(xué)長三角綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心， 杭州 310014)

先兆流產(chǎn)是指妊娠早期出現(xiàn)少量陰道流血，繼而出現(xiàn)下腹痛或腰酸等癥狀，嚴(yán)重者會因?yàn)殛幍懒餮吭龆嗷蛳赂固弁醇又囟l(fā)展為流產(chǎn)[1]。先兆流產(chǎn)發(fā)病原因較多，可能與遺傳、環(huán)境、母體因素、內(nèi)分泌功能和免疫因素等密切相關(guān)[2]。近年來，隨著生活方式的改變和生存環(huán)境的復(fù)雜化，先兆流產(chǎn)的發(fā)病率逐年上升。研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥在整體觀念和辨證論治的指導(dǎo)下治療先兆流產(chǎn)具有明顯的特色與優(yōu)勢，其臨床療效確切，不良反應(yīng)較少[3]。孕康口服液(Yun Kang oral liquid，YK)為已上市中成藥，具有固腎健脾、養(yǎng)血安胎之效?；诖?，本研究采用腎虛-黃體抑制導(dǎo)致的先兆流產(chǎn)模型，進(jìn)一步評價(jià)孕康口服液的安胎作用，為臨床使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物

回音必?孕康口服液(批號16070102)，現(xiàn)開現(xiàn)用，回音必集團(tuán)浙江齊齊制藥有限公司。地屈孕酮片(批號351086)、羥基脲片(批號6C019D05)、米非司酮片(批號160704)，浙江省中醫(yī)院西藥房提供。

1.2 動物

SPF級SD大鼠，雌70只，體重(260±20)g；雄30只，體重(280±20)g。由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK(蘇)2013-0003。

1.3 試劑

雌二醇(estradiol，E2)、孕酮(progesterone，P)測試盒，批號均為E20170101A；血栓素B2(thromboxaneB2，TXB2)測試盒，批號均為20160103，均購自上海源葉生物科技有限公司。

1.4 儀器

全自動生化分析儀(TBA-40FR)，日本東芝醫(yī)療系統(tǒng)株式會社；酶標(biāo)儀(Powerwave 340)，美國Bio-TEK公司；多功能自主活動記錄儀(YLS-1A)、鼠尾光照測痛儀(YLS-12A)、大小鼠抓力測定儀(YLS-13A)，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備供應(yīng)維修站；紅外非接觸額溫量測器(8877)，北京東方海匯電子技術(shù)有限公司。

1.5 模型的建立及處理

將發(fā)情前期或發(fā)情期的雌鼠與雄鼠進(jìn)行合籠交配，每籠雌鼠與雄鼠的數(shù)量比例為1∶1，以發(fā)現(xiàn)白色陰道栓或陰道涂片見大量精子者，記為雌鼠妊娠第1日。將妊娠大鼠隨機(jī)分為6組：正常對照組(NC)，模型組(MG)，地屈孕酮組(DT，3.02 mg/kg)，孕康口服液低劑量組(YK-L，4 ml/kg)、中劑量組(YK-M，6 ml/kg)、高劑量組(YK-H，9 ml/kg)，每組10只。自妊娠第1日，每日上午各給藥組按規(guī)定劑量灌予受試藥，NC組、MG組給予等體積的純化水，連續(xù)10 d；每天下午灌胃造模，除NC組給予純化水外，其余各組按450 mg/kg體質(zhì)量灌胃羥基脲，連續(xù)9 d，第10日按4.0 mg/kg體質(zhì)量灌胃米非司酮，建立腎虛-黃體抑制型先兆流產(chǎn)模型。妊娠第11日，各組腹主動脈取血備用，并摘取卵巢、連胎子宮。

1.6 檢測指標(biāo)

體征：觀察大鼠體征及陰道出血狀況，每天稱量并記錄大鼠體重。

一般行為學(xué)指標(biāo)：于妊娠第9日測定大鼠背溫、抓力、痛域、自主活動。(1)背溫：將紅外測量器的測試孔緊貼孕鼠背弓部，當(dāng)測量儀數(shù)值穩(wěn)定后讀數(shù)。(2)抓力：抓持大鼠尾根處，待大鼠用力抓住彈性拉力板時(shí)及時(shí)施力后拉至大鼠放棄拉力板，儀器讀出抓力值；(3)痛域：將大鼠身體置于固定器中，使其尾部置于儀器熱輻射區(qū)，當(dāng)大鼠尾部迅速甩離熱輻射區(qū)時(shí)儀器自動讀數(shù)。(4)自主活動：安靜漆黑環(huán)境下，將大鼠放入自主活動箱中，測定10 min內(nèi)的總活動次數(shù)。

臟器指數(shù)測定：妊娠大鼠稱重、取血后，處死大鼠，解剖取卵巢、連胎子宮，計(jì)算臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/體重×100%。

連胎子宮：(1)連胎子宮整體形態(tài)(拍照)：顏色，有無瘀血、粘連，有無丟失胚胎等。(2)胚胎個(gè)數(shù)：記錄胚胎個(gè)數(shù)。(3)胚胎直徑：用直尺測量連續(xù)3個(gè)胚胎總長，平行測量3次，取平均值。

血清指標(biāo)：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測血清E2、P、TXB2水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 孕康口服液對體征及陰道出血癥狀的影響

NC組大鼠體重增加且呈腹型肥胖，好動，毛色光潔，無脫毛等現(xiàn)象，大小便正常，無陰道出血；MG組形體消瘦、毛色枯黃，頸背部、四肢脫毛明顯，小便頻數(shù)且?guī)捉鼰o色，妊娠第5日開始逐漸出現(xiàn)陰道出血現(xiàn)象；YK各劑量組均可改善模型一般體征，減少陰道出血癥狀，尤其以YK-H組一般體征向NC組靠攏，且無陰道出血癥狀。

2.2 孕康口服液對體重的影響

與NC組比較，MG組給藥第5、7日體重明顯降低(P<0.05)，至第9日顯著降低(P<0.01)；與MG比較，YK-L組體重第9日明顯升高(P<0.05)，YK-M、YK-H組第5、7日體重均明顯升高(P<0.05)，至第9日則顯著升高(P<0.01)，DT組則差異無顯著性(表1)。

GroupNumber of days of pregnancy(d)1579NC270.5±12.9292.3±17.6297.1±20.1308.3±17.8MG274.4±12.0279.4±9.8*281.5±18.4*281.4±20.9**DT272.8±11.7277.9±18.6281.9±18.8288.2±20.2YK-L271.6±18.9283.4±25.9284.0±18.0292.9±17.4#YK-M274.4±8.0295.2±18.8#299.8±15.8#302.1±17.0##YK-H274.3±12.6291.8±15.4#299.6±15.6#301.2±14.9##

NC: Normal control; MG: Model group; DT: Dydrogesterone; YK: Yun Kang oral liquid

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P< 0.01vsmodel group

2.3 孕康口服液對背溫、抓力、痛域及自主活動的影響

與NC組比較，MG組背溫、抓力、痛域、自主活動次數(shù)均顯著降低(P<0.05，0.01)；與MG組比較，YK各劑量組背溫、抓力均顯著升高(P<0.05， 0.01)，YK-M、YK-H組痛域、自主活動次數(shù)均明顯增多(P<0.05)，DT組則差異無顯著性(表2)。

NC: Normal control; MG: Model group; DT: Dydrogesterone; YK: Yun Kang oral liquid

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P< 0.01vsmodel group

2.4 孕康口服液對連胎子宮形態(tài)的影響

NC組子宮粗大，均勻如串珠狀，呈粉紅色或肉色，未見出血或瘀血，解剖后見胚胎完好；MG組子宮呈竹節(jié)樣改變，宮腔內(nèi)可見明顯瘀血或見壞死胚胎，或胚胎呈黑褐色，或無胚胎僅有胚胎著床點(diǎn)；YK-L組僅部分胚胎丟失或見瘀血，DT組連胎子宮形態(tài)較YK-L組狀態(tài)佳，YK-M、YK-H組連胎子宮形態(tài)向正常形態(tài)靠攏且優(yōu)于DT組(圖1)。

Fig.1Effects of Yun Kang oral liquid on uterine morphology of kidney deficiency and luteum inhibition rats

A: Normal control B: Model group C: Dydrogesterone

D: YK-L E: YK-L F: YK-H

2.5 孕康口服液對卵巢、連胎子宮指數(shù)和胚胎個(gè)數(shù)、直徑的影響

與NC組比，MG組連胎子宮指數(shù)、胚胎個(gè)數(shù)、胚胎直徑顯著降低(P<0.01)；與MG組比較，YK-M、YK-H組和DT組連胎子宮指數(shù)明顯升高(P< 0.05)，YK各劑量組和DT組胚胎個(gè)數(shù)、胚胎直徑均顯著升高(P<0.05，0.01)，其中YK-H組胚胎個(gè)數(shù)明顯高于YK-L組(P<0.05)；與DT組比較，YK-H組胚胎個(gè)數(shù)明顯升高(P<0.05)。各組間卵巢指數(shù)無顯著性差異(表3)。

GroupOvarian index(mg/g)Uterine index(mg/g)Number of embryos(number)Embryonic diameter(cm)NC0.83±0.148.26±1.7115.8±1.810.55±0.04MG0.82±0.085.81±1.52**7.5±3.44**0.37±0.14**DT0.83±0.156.81±0.86#12.5±3.21##0.48±0.05#YK-L0.85±0.065.84±0.9112.4±2.59##0.47±0.04#YK-M0.85±0.096.74±0.54#13.9±2.08##0.46±0.05#YK-H0.87±0.106.79±0.85#14.8±2.30##△▲0.50±0.02##

NC: Normal control; MG: Model group; DT: Dydrogesterone; YK:Yun Kang oral liquid

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;△P<0.05vsdydrogesterone;▲P<0.05vsYK-L

2.6 孕康口服液對血清E2、P、TXB2水平的影響

與NC組比較，MG組血清E2、P、TXB2水平均明顯下降(P<0.05)。與MG組比較，YK各劑量組血清E2、P水平均顯著上升(P<0.05，0.01)，其中YK-H組血清P水平明顯高于YK-L組(P<0.05)；YK-H組血清TXB2水平顯著上升(P<0.05)；DT組各指標(biāo)差異均無顯著性(表4)。

GroupE2(pmol/L)P(ng/ml) TXB2(pg/ml)NC20.95±6.725.60±1.93750.56±167.29MG16.36±2.68*4.45±0.52*588.33±186.29*DT14.75±2.014.63±0.31568.33±85.78YK-L18.61±2.04#4.97±0.46#661.67±152.55YK-M19.65±4.07#5.03±0.72#715.00±214.99YK-H20.73±4.29##5.55±0.69##▲803.33±235.60#

NC: Normal control; MG: Model group; DT: Dydrogesterone; YK: Yun Kang oral liquid; E2: Estradiol; P: Progesterone; TXB2: Thromboxane B2

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;▲P<0.05vsYK-L

3 討論

先兆流產(chǎn)在中醫(yī)學(xué)上屬“滑胎”“胎漏”等范疇，傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為造成先兆流產(chǎn)的主要病因?yàn)槟I虛。腎虛則沖任不固，無以系胎，胎失所養(yǎng)；腎虛則沖任失調(diào)，迫血妄行，血熱血海不固，可導(dǎo)致先兆流產(chǎn)[4]。孕康口服液由23味中藥組成，其組方與功能主治提示該藥具有健脾固腎，養(yǎng)血安胎之功效。本實(shí)驗(yàn)通過羥基脲和米非司酮聯(lián)用制備腎虛-黃體抑制型先兆流產(chǎn)大鼠模型，其中羥基脲可抑制核苷酸的代謝，導(dǎo)致虛損癥狀[5]；米非司酮則通過發(fā)揮拮抗孕酮的作用而起到抗生育的效果[6]，二者聯(lián)用模擬臨床上妊娠早期先兆流產(chǎn)的病理狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)表明模型鼠妊娠第5日逐漸產(chǎn)生陰道出血現(xiàn)象，出現(xiàn)了一系列的腎虛癥狀，表現(xiàn)為形體消瘦、毛色枯黃，頸背部、四肢脫毛明顯，并且抓力值下降、背溫降低、自主活動減少、痛閾值降低，與臨床上腎虛之腰膝酸軟、冷疼、懶言少動、毛發(fā)不固等癥狀相吻合；同時(shí)模型鼠連胎子宮腔內(nèi)可見明顯瘀血或見壞死胚胎，胚胎個(gè)數(shù)和直徑降低。經(jīng)孕康口服液干預(yù)后，減少了模型鼠的陰道出血癥狀，并升高背溫、抓力值、痛閾值、自主活動次數(shù)，明顯改善腎虛癥狀；同時(shí)孕康口服液可提高胚胎個(gè)數(shù)和直徑，改善連胎子宮形態(tài)，其中YK-H組效果優(yōu)于DT組。

胚胎著床及繼續(xù)發(fā)育，依賴于復(fù)雜的內(nèi)分泌系統(tǒng)彼此協(xié)調(diào)，任何一個(gè)環(huán)節(jié)異常均可導(dǎo)致先兆流產(chǎn)，其中黃體功能不全是造成先兆流產(chǎn)最常見的內(nèi)分泌因素[7-8]。在妊娠早期，黃體功能不全可導(dǎo)致E2、P激素水平下降，使子宮收縮性增加，引發(fā)先兆流產(chǎn)[9-10]。孕康口服液中用山藥健脾益腎，以菟絲子、續(xù)斷、桑寄生補(bǔ)腎固胎，以狗脊、補(bǔ)骨脂、杜仲壯腰健腎。研究表明，補(bǔ)腎類中藥能夠增強(qiáng)黃體功能，提高E2、P激素水平，從而促進(jìn)胚胎發(fā)育，降低流產(chǎn)率[11]。實(shí)驗(yàn)表明，YK各劑量組可通過升高血清E2、P激素水平，抑制子宮收縮，維持子宮的靜息狀態(tài)而利于妊娠；此外，YK-H組通過升高血清TXB2水平，以促進(jìn)血小板聚集及血管收縮，達(dá)到止血安胎的作用，這可能與孕康口服液含有苧麻根、黃芩、艾葉等止血類中藥有關(guān)。

綜上所述，孕康口服液可改善腎虛癥狀，提高胚胎個(gè)數(shù)，具有明顯的補(bǔ)腎安胎作用，其機(jī)制可能是升高E2、P水平，抑制子宮收縮，維持子宮安靜狀態(tài)；升高TXB2水平，促進(jìn)血小板凝聚、血管收縮，預(yù)防出血和先兆流產(chǎn)。這為臨床上合理應(yīng)用孕康口服液提供了科學(xué)依據(jù)。