單尚然， 蔣 方， 徐淑梅

(天津醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室， 天津 300070)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種與年齡相關(guān)、進(jìn)行性發(fā)展的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。該病起病隱匿，由多因素引起，學(xué)習(xí)記憶力減退、認(rèn)知功能障礙，最終導(dǎo)致生活自理能力完全喪失，是癡呆最常見的臨床表現(xiàn)形式[2]。AD的主要病理學(xué)改變是β-淀粉樣蛋白在神經(jīng)元細(xì)胞外異常沉積形成的老年斑(senile plaques, SP)和細(xì)胞內(nèi)自我聚集的tau蛋白的過磷酸化所形成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFTs)。隨著病程的發(fā)展，大腦被這些老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)影響，造成學(xué)習(xí)和記憶力的的衰退[3]。關(guān)于阿爾茨海默癥的致病機(jī)理，目前仍有爭論，有多個(gè)學(xué)說的提出。目前β 樣淀粉樣蛋白(amyloid beta-protein，Aβ) 級聯(lián)學(xué)說得到廣大學(xué)者的廣泛認(rèn)可，作為老年斑主要成分的Aβ 可能是AD 的原發(fā)性病理因子，是影響AD發(fā)病的核心因素[4]。本課題組的β片層阻斷肽H102是專門針對Aβ設(shè)計(jì)的治療老年癡呆的新型候選藥物，分子組成為十肽水溶性藥物，它能夠有效抑制 Aβ 的折疊和聚集，減少 Aβ 的含量，制約Aβ對神經(jīng)元造成損傷，從而影響下游病理過程[5]。本課題組前期已經(jīng)證實(shí) β 片層阻斷肽 H102影響Aβ的生成，包括H102 能夠與 β 淀粉樣肽相結(jié)合，抑制 Aβ 的折疊和聚集； H102 參與 APP 的代謝，影響Aβ 的生成等。但是對H102是否影響Aβ清除的自噬相關(guān)通路未有涉及，因此設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)觀察H102對激活自噬通路的作用。

在真核細(xì)胞中，自噬是一種正常的調(diào)節(jié)性回收衰老細(xì)胞組分、清除結(jié)構(gòu)或功能異常細(xì)胞器或蛋白聚合物的細(xì)胞生理過程。在生理情況下，細(xì)胞維持一種較低水平的自噬[6]。當(dāng)體內(nèi)積累過多異常折疊的蛋白質(zhì)時(shí)，就會激活相關(guān)自噬通路來加速對異常蛋白的清除。自噬作為細(xì)胞內(nèi)清除異常折疊蛋白質(zhì)、受損細(xì)胞器和其他有害物質(zhì)的主要途徑，對β 淀粉樣肽產(chǎn)生和清除的平衡具有重要作用[7]。近年來，大量研究表明腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)不僅在維持細(xì)胞能量平衡上發(fā)揮重要作用，還可以通過細(xì)胞內(nèi)多條通路影響細(xì)胞的自噬過程，其中最主要的通路就是胞漿內(nèi)的AMPK-mTOR 信號通路，這一通路得到廣泛研究[8]。本研究旨在觀察H102 對AMPK-mTOR自噬通路相關(guān)蛋白的影響，以探討H102 是否可以通過激活自噬途徑減少Aβ，對AD起到一定的治療的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

6月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD雄性小鼠30只，同月齡同背景的C57BL/6J雄性小鼠15只，體重(30.0±1.6)g，購自北京華阜康生物科技有限公司，飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物科學(xué)部SPF級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。β片層阻斷肽H102由上海吉爾生化有限公司采用固相合成法合成。 JLbehv-1新物體識別系統(tǒng)購自北京伯豪生物技術(shù)有限公司；免疫組化中DAB試劑盒、即用型SABC免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物公司，生物素二抗試劑盒購自北京鼎國生物公司；Western blot中β-actin抗體購自北京中杉金橋生物公司，P-AMPK抗體購自CST公司，P-mTOR抗體、LC3Ⅱ/Ⅰ抗體購自abcam公司。

1.2 動(dòng)物分組及給藥方法

將30只6月齡的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因雄性AD小鼠隨機(jī)分為AD組和H102干預(yù)組(n=15)。將同月齡同背景飼養(yǎng)下的15只C57BL/6J雄性小鼠設(shè)為對照組。H102干預(yù)組的小鼠每天同一時(shí)間段經(jīng)鼻腔給予H102溶液5 μl(5.8 mg/kg)，對照組和AD組小鼠每日給予等量的的空白輔料溶液 (0.5%殼聚糖、0.1%BSA)。持續(xù)給藥30 d 。

1.3 新物體識別實(shí)驗(yàn)

連續(xù)給藥30 d后，進(jìn)行新物體識別實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)共分3 d完成，分別為適應(yīng)、熟悉、測試三階段。第1日將各小鼠放入敞箱中自由活動(dòng)10 min。第2日在敞箱中放入相同、位置對稱的兩個(gè)物體，讓其自由活動(dòng)5 min進(jìn)行探索和學(xué)習(xí)。第3日將其中一個(gè)物體換成顏色和形狀均不同的物體，步驟如第2日繼續(xù)進(jìn)行探索和學(xué)習(xí)。系統(tǒng)自動(dòng)記錄每一只小鼠對兩個(gè)物體的識別時(shí)間，并對生成的數(shù)據(jù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。熟悉階段主要是排除位置對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，位置偏愛指數(shù)用LI表示，測試階段是測試小鼠在對熟悉物體記憶的基礎(chǔ)之上對新物體的探索時(shí)間，新物體識別指數(shù)用RI表示。

1.4 腦組織樣本的制備

新物體識別實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用25%的烏拉坦4 ml/kg腹腔注射麻醉，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)灌注至肝肺透明，然后處死在冰上取腦，一半腦組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，一半腦組織分離皮層和海馬放入液氮中后移入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 免疫組織化學(xué)染色

甲醛固定過的腦組織經(jīng)修片、脫水、透明、浸蠟、切片進(jìn)行以下免疫組化實(shí)驗(yàn)。脫蠟復(fù)水后去離子水浸泡，3%H2O2室溫孵育，枸櫞酸抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)。5%BSA封閉后，滴加稀釋一定的比例的一抗(P-AMPK 1∶400、P-mTOR 1∶100、LC3Ⅱ/Ⅰ 1∶300)后，4℃過夜，滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液37℃避光孵育30 min，辣根酶標(biāo)記物(SABC)工作液37℃避光孵育30 min，DAB顯色劑顯色，鏡下控制時(shí)間，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，中性樹膠封片。陰性對照組用PBS代替一抗進(jìn)行染色，其余步驟同上。在倒置成像系統(tǒng)下觀察并拍攝相同層次的海馬和皮層，用image-proplus 6.0軟件對染色結(jié)果進(jìn)行光密度(optical density, OD)分析。

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn)

于-80℃冰箱中取出海馬和皮質(zhì)組織，提取總蛋白，BCA 法定量測定蛋白濃度后調(diào)定各組蛋白為等濃度，加適量上樣緩沖液，煮沸變性5 min。5% ～ 12%分離膠5%濃縮膠電泳蛋白分離后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入稀釋的一抗(P-AMPK 1∶1 000、P-mTOR 1∶10 000、LC3Ⅱ/Ⅰ 1∶3 000)，4℃過夜，加入稀釋的二抗(1∶10 000)，室溫下孵育2 h，然后ECL發(fā)光顯色，蛋白條帶曝光。用emageJ軟件分析所得條帶的灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 新物體識別記憶能力測試結(jié)果

實(shí)驗(yàn)中各組小鼠熟悉階段中的位置偏愛指數(shù)以及測試階段中的新物體識別指數(shù)如表1所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明各組小鼠的位置偏愛指數(shù)均在50%左右，說明我們可以排除位置這個(gè)因素對測試階段實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響；從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中我們能夠看出，與對照組相比，AD 組新物體識別指數(shù)顯著降低(P<0.05)，與AD 組相比，H102 干預(yù)組新物體識別指數(shù)顯著提高(P<0.05，表1)。

Group LIRIControl51.27±6.8669.68±8.91AD52.34±7.2452.24±7.98 *H10251.58±8.2962.23±8.21#

LI: Location preference index; RI: Recognition index; AD: APP /PS1 double transgenic

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsAD

2.2 免疫組化DAB染色法測定AMPK-mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

對P-AMPK、LC3Ⅱ蛋白免疫組化染色結(jié)果顯示，與對照組相比，AD組小鼠腦內(nèi)P-AMPK、LC3Ⅱ蛋白OD值顯著降低(P<0.05),與AD組相比，H102干預(yù)組小鼠腦內(nèi)P-AMPK、LC3Ⅱ蛋白光密度顯著提高(P<0.05)。對P-mTOR蛋白，與對照組相比，AD組小鼠腦內(nèi)P-mTOR蛋白光密度顯著提高(P<0.05)，與AD組相比，H102干預(yù)組小鼠腦內(nèi)P-mTOR蛋白光密度顯著降低(P<0.05,表2，圖1，圖1.1，圖1.2見彩圖頁Ⅰ，圖1.3見彩圖頁Ⅴ)。

2.3 Western blot 測定AMPK-mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，AD組小鼠蛋白條帶明顯變細(xì)，顏色變淺，P-AMPK、LC3Ⅱ/Ⅰ比值顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與AD組相比，H102干預(yù)組小鼠腦內(nèi)P-AMPK、LC3Ⅱ/Ⅰ比值顯著增加，蛋白條帶明顯變粗，顏色變深，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05); 對P-mTOR蛋白，與對照組比較，AD組小鼠蛋白條帶明顯增粗，顏色加深， P-mTOR蛋白蛋白的表達(dá)量顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與AD組相比，H102干預(yù)組小鼠腦內(nèi)P-mTOR表達(dá)明顯降低，蛋白條帶明顯變細(xì)，顏色變淺，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖2.1、2.2，圖3)。

Fig.2.1Expressions of P-AMPK, P-mTOR, LC3Ⅱ/Ⅰ ratio level in mice hippocampus

A: Control; B: AD; C: H102; AD: APP /PS1 double Transgenic

Fig.2.2Expressions of P-AMPK, P-mTOR, LC3Ⅱ/Ⅰ ratio level in mice cortex

A: Control; B: AD; C: H102; AD: APP /PS1 double Transgenic

GroupP-AMPKHippocampusCortexP-mTORHippocampusCortexLC3HippocampusCortexControl73.05±9.1589.12±10.6569.96±7.3686.75±11.1679.03±7.5663.09±12.43AD57.93±10.75*74.91±12.72*90.33±8.36*96.87±10.07*56.52±10.16*43.22±7.01*H10285.36±7.55#83.08±8.43#48.62±3.32#67.74±11.40#94.21±8.00#82.09±9.95#

AD: APP /PS1 double transgenic

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsAD

AD: APP /PS1 double transgenic

*P<0.05,**P<0.01

3 討論

大腦皮層、海馬的神經(jīng)元缺失是阿爾茨海默病(AD)的主要病理結(jié)果[9]，所以我們本課題的取材是小鼠大腦的皮層和海馬。AD的主要臨床特征是學(xué)習(xí)記憶力減退、認(rèn)知功能障礙。新物體識別記憶能力測試結(jié)果表明，H102干預(yù)組的新物體識別指數(shù)要明顯高于AD組，提示H102對于AD 的預(yù)防和治療具有一定的積極作用。

大量研究表明，Aβ在細(xì)胞外的異常聚集形成SP[10]，是AD的重要物質(zhì)，故清除異常聚集的Aβ至關(guān)重要，這個(gè)過程主要就是自噬[11]，H102 在小鼠腦區(qū)通過自噬來清除Aβ是本課題想要探討的另一內(nèi)容。自噬過程包括自噬泡的形成、自噬體的形成、自噬體與溶酶體融合三個(gè)階段[12]。腺苷酸活化蛋白激酶( AMP-activatedprotein kinase，AMPK)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)是自噬過程中關(guān)鍵的蛋白質(zhì)分子。在自噬通路中AMPK-mTOR通路，已經(jīng)得到廣泛的研究[8]。AMPK是三聚體復(fù)合體，由催化亞單位α 和調(diào)節(jié)亞單位β 和γ 組成。在腦組織中α亞型較為豐富[13]。AMPK是能量感受器，主要協(xié)調(diào)代謝和能量的需要，大量研究表明AMPK作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞代謝傳感器參與神經(jīng)變型性變的調(diào)控[14]。免疫組化和Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明， H102能夠顯著活化AMPK，這可能是因?yàn)樯窠?jīng)元AMPK信號激活主要靠胞漿AMP和Ca2+水平的增高，而H102多肽本質(zhì)是十種氨基酸組成，可以作為AMPK的激動(dòng)劑，來通過活化AMPK誘導(dǎo)自噬，清除異常聚集的Aβ。作為自噬調(diào)控的中心分子， mTOR能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及細(xì)胞自噬等多種細(xì)胞進(jìn)程。可表現(xiàn)出＂活性開關(guān)＂樣的作用，激活或抑制自噬通路，保持生理環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡。Park 等[15]證明，西洛他唑能激活A(yù)MPK，降低mTOR的磷酸化水平，從而抑制mTOR 活性，促進(jìn)自噬體形成，減少Aβ 的積累，發(fā)揮中樞神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AD小鼠腦內(nèi)m-TOR過度磷酸化，自噬出現(xiàn)障礙，而H102干預(yù)組，P-mTOR顯著降低，表明H102可能通過激活A(yù)MPK抑制mTOR 活性來誘導(dǎo)自噬，加速Aβ的清除。LC3 是自噬標(biāo)志物，當(dāng)自噬泡成熟時(shí)，LC3-I 轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-II( 即自噬體膜型) ，LC3-II /I 比值的大小被廣泛用于評估自噬激活的程度[16]。本實(shí)驗(yàn)中，AD組LC3Ⅱ/Ⅰ的比值很小，提示AD小鼠腦內(nèi)出現(xiàn)自噬障礙，H102可顯著提高AD小鼠腦內(nèi)LC3Ⅱ/Ⅰ的比值，表明H102干預(yù)組能夠重新激活自噬通路加速對Aβ的清除作用。

由此可知，在AMPK-mTOR通路中，H102作為多肽分子，可以通過激活A(yù)MPK，抑制mTOR來誘導(dǎo)自噬，加速對Aβ的清除作用，改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，達(dá)到對AD小鼠治療的目的。