劉冰，陳岳銘，李華超

(廣東藥科大學藥學院，廣東 廣州 510006)

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一且其發(fā)病率呈不斷上升的趨勢，其中，非小細胞肺癌占據(jù)了85%的肺癌病例[1-2]?；熑允欠伟┲饕闹委煼椒?，然而目前對肺癌的化療存在有效率不高，副作用較大的缺陷，故從天然植物中提取有效成分作為輔助用藥來提高化療療效并減少不良反應(yīng)也成為了一種新的抗癌方案[3]。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，研究表明，Akt在癌組織的表達顯著高于癌旁組織[4]，Akt的過表達與肺癌的發(fā)生進展密切相關(guān)[5]。因此Akt也許是治療肺癌的一個新的靶點。芝麻素是芝麻籽油中含量最豐富的木脂素，研究表明芝麻素具有抗高血壓、抗血栓形成及抗高膽固醇血癥的特性[6]。另外，在受試者中證實了芝麻素是安全且可耐受的[7]。已有研究顯示芝麻素的抗腫瘤作用[8]，但有關(guān)芝麻素與順鉑聯(lián)用對肺癌的抑制作用仍未見報道。本研究以人肺癌細胞H460為研究對象，觀察芝麻素與順鉑聯(lián)合給藥對H460細胞增殖的抑制作用。

1 材料與儀器

1.1 材料

人肺癌細胞H460細胞株購自ATCC

1.2 主要試劑與儀器

芝麻素、順鉑(Selleckchem)；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國GIBCO公司)；MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；Mulitiskan GO全波長酶標儀(美國Thermo公司)；抗體p-Akt(ser473)、β-tubulin(美國CST公司)；PVDF膜(美國Millipore公司)；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

H460使用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基中均含有10%(φ)胎牛血清(FBS)，在37 ℃含有5%(φ))CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗用的芝麻素溶于DMSO備用，順鉑溶于DMF備用。

2.2 增殖抑制實驗

取對數(shù)生長期的細胞株H460細胞，經(jīng)蛋白胰酶消化，以每孔4×103個細胞接種于96孔板中，每孔100 μL。培養(yǎng)過夜，棄去原培養(yǎng)基，實驗組加入RPMI-1640培養(yǎng)基200 μL稀釋的不同濃度(5、10、15、20、25、30、40 μmol/L)的芝麻素、順鉑或兩者聯(lián)用，對照組加入RPMI-1640培養(yǎng)基200 μL稀釋的DMSO，空白對照組不加細胞僅加RPMI-1640培養(yǎng)基200 μL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h后，吸干培養(yǎng)基，每孔100 μL RPMI-1640培養(yǎng)基加入20 μL MTT，置37 ℃，5%(φ)CO2培養(yǎng)箱中避光孵育4 h后，吸干培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，搖床搖10 min后在酶標儀563 nm波長下測定各孔吸光度值(A)。抑制率=1-(實驗組A值-空白對照組A值)/(溶劑對照組A值-空白對照組A值)×100%。

2.3 免疫印跡實驗

檢測H460細胞中p-Akt蛋白的表達。將細胞接種于6孔板中，加入不同濃度(10、20、30 μmol/L)芝麻素處理12 h后，在每孔細胞中加入100 μL的蛋白裂解液后，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，計算每個泳道的上樣量為70 μg總蛋白，計算5× loading buffer量及超純水量，定量，變性。蛋白在10%SDS/PAGE分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。使用TBST洗膜3次后，用含5%脫脂牛奶的TBST室溫封閉1 h，TBST洗膜3次，加入稀釋好的一抗p-Akt(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。用TBST洗膜3次后，加入稀釋好的羊抗兔二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h后，用TBST洗膜3次，然后加入ECL化學發(fā)光液，暗房曝光、顯影、定影。

2.4 協(xié)同指數(shù)(CI)

芝麻素與順鉑之間的相互作用由協(xié)同指數(shù)(CI)來確定，根據(jù)公式：CI=(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2，(Dx)1、(Dx)2分別表示給定的抑制率所需的芝麻素劑量和順鉑的單獨劑量。(D)1 和(D)2是芝麻素或順鉑產(chǎn)生相同效果所必需的劑量。芝麻素與順鉑的聯(lián)合作用表示如下：CI<1，協(xié)同作用，CI=1，加和效應(yīng)，CI>1，拮抗作用。劑量降低指數(shù)DRI由協(xié)同指數(shù)中劑量降低的水平來確定，(DRI)1=(Dx)1/ (D)1；(DRI)2=(Dx)2/(D)2。

2.5 統(tǒng)計學處理

3 結(jié)果

3.1 芝麻素對H460細胞增殖的抑制作用

當芝麻素的給藥濃度為5、10、15、20、25、30、40 μmol/L 7個濃度時，MTT實驗結(jié)果可以看出，芝麻素在48 h對H460細胞增殖的抑制率均強于24 h。當濃度≥10 μmol/L時，芝麻素對H460細胞抑制率與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義。提示在一定的濃度范圍內(nèi)，芝麻素對H460細胞增殖的抑制率隨著藥物濃度的升高而升高，且有劑量依賴性(圖1)。

3.2 芝麻素對H460細胞p-Akt表達的影響

當芝麻素的給藥濃度為10、20、30 μmol/L，孵育12 h后，從Western blot結(jié)果可以看出，芝麻素可抑制H460細胞p-Akt的表達，且呈劑量依賴性(圖2)。

與24 h對照組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001； 與48 h對照組比較：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。

圖1不同濃度芝麻素對H460細胞增殖的影響

Figure1Effect of sesamin at different concentrations on the proliferation of H460 cells

圖2不同濃度的芝麻素對p-Akt表達的影響

Figure2Effect of sesamin at different concentrations onp-Akt expression

3.3 順鉑聯(lián)合芝麻素對H460細胞增殖的影響

從給藥48 h后的MTT結(jié)果可以看出，當順鉑(3 μmol/L)聯(lián)合芝麻素(15 μmol/L)給藥時，聯(lián)合給藥組對H460細胞增殖抑制效果要強于順鉑(6 μmol/L)或芝麻素(30 μmol/L)給藥組。說明順鉑(3 μmol/L)聯(lián)合芝麻素(15 μmol/L)給藥存在協(xié)同效應(yīng)(圖3)。

3.4 順鉑聯(lián)合芝麻素對H460細胞增殖抑制的協(xié)同效應(yīng)

從Fa-CI plot圖可以看出，順鉑(0.75 μmol/L)與芝麻素(4 μmol/L)聯(lián)合使用時，CI值>1，提示兩者在此濃度下不存在協(xié)同效應(yīng)。另外，順鉑(1.5 μmol/L)聯(lián)合芝麻素(8 μmol/L)、順鉑(3 μmol/L)聯(lián)合芝麻素(16 μmol/L)、順鉑(6 μmol/L)聯(lián)合芝麻素(32 μmol/L)、順鉑(12 μmol/L)聯(lián)合芝麻素(64 μmol/L)4個給藥組的CI均<1，提示在順鉑(1.5～12 μmol/L)聯(lián)合芝麻素(8～64 μmol/L)此范圍內(nèi)，對H460細胞增殖抑制效果存在協(xié)同效應(yīng)(圖4)。

與不加藥對照組比較：**P<0.01； 與順鉑(6 μmol/L)比較：#P<0.05; 與芝麻素(30 μmol/L)比較:+P<0.05。

圖3單用芝麻素/順鉑或芝麻素聯(lián)合順鉑對H460細胞增殖的影響

Figure3Effect of sesamin,cisplatin or combination of both on the viability of H460 cells

圖4順鉑聯(lián)合芝麻素對H460細胞增殖抑制的協(xié)同效應(yīng)

Figure4Synergistic effect of cisplatin and sesamin on anti-proliferation of H460 cells

3.5 順鉑聯(lián)合芝麻素對p-Akt表達的影響

從Western blot結(jié)果可以看出，單獨使用順鉑時(3 μmol/L)時，對p-Akt的表達無顯著影響。當順鉑(3 μmol/L)聯(lián)合芝麻素(20 μmol/L)時，可顯著降低p-Akt的表達(圖5)。

圖5順鉑聯(lián)合芝麻素對p-Akt表達的影響

Figure5Effect of cisplatin combined with sesamin onp-Akt expression

4 討論

目前，肺癌治療新技術(shù)不斷呈現(xiàn)，尤其是細胞分子生物學及化療藥理學的迅猛發(fā)展，使得尋找活性強、選擇性強、低毒的抗癌方法成為肺癌治療的發(fā)展方向[9]。中藥單體具有取材方便、價格低廉的優(yōu)點；西藥具有靶向作用強、見效快的特點[10]。而將中藥單體和西藥聯(lián)合使用抗癌，將兩者有效聯(lián)合在一起，可使其最大限度地發(fā)揮作用。芝麻素是從芝麻籽油中提取出來的一種木脂素，它對乳腺癌及肺癌均有顯著的抑制作用[8,11]。順鉑是臨床常用的肺癌化療藥，可抑制腫瘤細胞DNA復制過程，因其抗癌譜廣，作用強而廣泛應(yīng)用，但容易產(chǎn)生耐藥性[12]。從本研究結(jié)果可以看出，順鉑與芝麻素聯(lián)合使用對肺癌細胞H460的增殖抑制效果明顯，且兩者聯(lián)合使用可產(chǎn)生協(xié)同作用。

PI3K/Akt信號通路作為癌細胞內(nèi)重要信號轉(zhuǎn)導通路之一，參與許多重要的生物學過程的調(diào)控，活化的Akt可影響下游多個效應(yīng)分子，發(fā)揮促進增殖、抑制凋亡的作用，與多種腫瘤的發(fā)生與進展密切相關(guān)[13]。研究表明，在43%～90%的非小細胞肺癌病例中，均可觀察到癌組織中的p-Akt的表達水平顯著高于癌周組織[14]。此外，臨床研究表明[15]，激活的Akt通路與肺癌的侵襲性與預后不良密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明，芝麻素可顯著地抑制p-Akt的表達。單用順鉑(3 μmol/L)對p-Akt表達無影響，而當順鉑聯(lián)合芝麻素使用時，可顯著地抑制p-Akt的表達(與芝麻素和順鉑產(chǎn)生的協(xié)同作用類似)。芝麻素抑制Akt活性的機制還需要進一步實驗研究。

本實驗中，順鉑聯(lián)合芝麻素給藥可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，同時，兩者聯(lián)用時可協(xié)同抑制p-Akt的表達，提示順鉑聯(lián)合芝麻素所產(chǎn)生的協(xié)同效應(yīng)可能是通過抑制p-Akt的表達來實現(xiàn)的。由于芝麻素的毒性低且與順鉑聯(lián)合可產(chǎn)生協(xié)同作用，芝麻素可能成為順鉑化療的輔助用藥。