林楚怡，張春榮，沈志濱

(廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006)

香鱗毛蕨Dryopterisfragrans(L.)Schott是鱗毛蕨科鱗毛蕨屬植物，對多種皮膚病具有良好治療作用[1-2]，其醇提液對紅色毛癬菌(Trichophytonrubrum)等多種真菌有較好的抑制作用[3-5]。

隨著生物技術的發(fā)展，高通量測序技術在揭示藥物作用機理的研究中也得到快速的發(fā)展，并形成一種新藥作用機制研究的新思路和新方法，通過其對新藥作用機制展開的轉(zhuǎn)錄組學的研究，增加對新藥作用機制的了解[6-8]。

本文利用RNA-seq技術研究紅色毛癬菌在香鱗毛蕨乙醇提取物(DF)作用前后基因差異表達，揭示香鱗毛蕨乙醇提取物對紅色毛癬菌的抑菌機制，為香鱗毛蕨的新藥研發(fā)提供理論依據(jù)和研究途徑。

1 材料

1.1 藥物

香鱗毛蕨藥材采自黑龍江省五大連池，由哈爾濱商業(yè)大學藥學院張德連教授鑒定為香鱗毛蕨Dryopterisfragrans(L.)Schott。鹽酸特比萘芬原料藥，購自濟南明鑫制藥股份有限公司，質(zhì)量分數(shù)>98%。

1.2 菌株

紅色毛癬菌標準株CMCC(f)T1a、平滑念珠菌(ATCC22019)購于中國醫(yī)學科學院南京皮膚病研究院。

1.3 培養(yǎng)基

沙氏瓊脂培養(yǎng)(SDA，批號：20160926)、MOPS(批號：20160926)均由廣州瑞舒生物科技有限公司生產(chǎn)。RPMI Medium 1640(批號：785914)由美國Gibco有限公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 藥物貯備液的制備

2.1.1 香鱗毛蕨乙醇提取物的制備 稱取100 g香鱗毛蕨藥材粗粉，90 ℃下用12倍量體積分數(shù)50%的乙醇提取3次，合并提取液，濃縮至無醇味，并加水定容至200 mL，制成質(zhì)量濃度為0.50 g/mL的香鱗毛蕨乙醇提取物貯備液，備用。

2.1.2 鹽酸特比萘芬貯備液的制備 精密稱取160 mg鹽酸特比萘芬原料藥，加入10 mL二甲基亞砜溶解，制成質(zhì)量濃度為16 mg/mL的陽性對照藥貯備液，備用。

2.2 紅色毛癬菌的藥物處理

紅色毛癬菌接種于SDA斜面培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)7 d以培養(yǎng)真菌孢子，用適量無菌生理鹽水(0.9%)沖洗斜面，將沖洗出的菌液置于無菌研磨器中，充分研磨，使孢子游離，制備得到紅色毛癬菌菌懸液。用RPMI 1640培養(yǎng)基將菌懸液調(diào)節(jié)至1.0×106CFU/mL，作為實驗真菌培養(yǎng)物。

根據(jù)文獻[9-12]可知，香鱗毛蕨乙醇提取物、鹽酸特比萘芬對紅色毛癬菌CMCC(f)T1a的最低抑菌濃度(MIC)分別為40 μg/mL和0.01 μg/mL。

實驗設計9瓶100 mL培養(yǎng)物，每組3瓶，分別為乙醇提取物作用組(DF組)、鹽酸特比萘芬作用組(TRB組)、對照組(Control組)。各組置于28 ℃下以150 r/min搖床培養(yǎng)5 d后，分別向DF組和TRB組中加入1/2 MIC濃度的乙醇提取物和鹽酸特比萘芬，對照組中各加入等量的空白培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，離心獲得紅色毛癬菌培養(yǎng)物，快速冷凍于液氮中，后將培養(yǎng)物至-80 ℃超低溫冰箱保存，轉(zhuǎn)錄組分析備用[13-14]。

2.3 總RNA提取及RNA-seq 測序

取出冷凍備用的紅色毛癬菌培養(yǎng)物，研磨粉碎，用RNA plant plus 植物總RNA提取試劑盒提取總RNA，步驟參考其說明書。由深圳華大基因研究院進行測序文庫構(gòu)建，并用Illumina HiSeq2000進行轉(zhuǎn)錄組測序。

從提取的RNA樣品中富集mRNA并片段化。以mRNA片段作為合成模板，采用六堿基隨機引物合成、純化第1鏈和第2鏈cDNA。對純化的雙鏈cDNA進行末端修復、加A尾和連接測序接頭，采用DNA Clean Beads進行片段大小分選。最后通過PCR擴增技術對片段進行擴增，以純化的PCR產(chǎn)物構(gòu)建cDNA文庫。

2.4 測序結(jié)果的質(zhì)量檢測與分析

由廣州基迪奧有限公司對測序序列進行處理和生物信息學分析，包括測序質(zhì)量評價，對GenBank中已有紅色毛癬菌基因組為參考基因組(GenBank Assembly ID: GCA_000622995和GCA_000151425)進行序列注釋、差異表達基因(DEGs)的基因本體GO(Gene ontology)功能顯著性分析、KEGG代謝途徑分析等。

3 結(jié)果

3.1 藥物處理后紅色毛癬菌測序結(jié)果的質(zhì)量評價

3.1.1 測序質(zhì)量及序列比對統(tǒng)計結(jié)果 如圖1所示，DF組樣品經(jīng)測序共獲得10 079 357個reads，經(jīng)過濾得到9 979 222個clean reads，占總reads數(shù)99.01%； TRB組樣品經(jīng)測序共獲得12 352 594個reads，經(jīng)過濾得到12 315 550個clean reads，占總reads數(shù)99.03%； Control組經(jīng)測序共獲得12 695 547個reads，經(jīng)過過濾得到12 576 327個clean reads，占總reads數(shù)99.06%，各樣品獲得的clean reads百分比均大于98%，測序質(zhì)量較高，達到信息分析需求。

3.1.2 測序飽和度分析結(jié)果 隨著測序量的增加，所檢測到的基因相應增多。如圖2所示，隨著測序量的升高，檢測到的基因增長速度趨于平緩，3組樣品所能檢測到的基因數(shù)量趨于飽和。

3.1.3 Reads在參考基因上的分布統(tǒng)計 通過reads在參考基因上的分布情況可以評價mRNA打斷的隨機程度。如圖3所示，DF組、TRB組和Control組樣品分布均勻性較好。

圖1 測序質(zhì)量統(tǒng)計Figure 1 Quality statistics of sequencing

A. Control組； B. DF組； C. TRB組。

圖2測序飽和度分析
Figure2Saturation analysis of sequencing

圖3測序隨機性統(tǒng)計
Figure3Random statistics of sequencing

3.1.4 基因覆蓋度統(tǒng)計 測序深度是測序質(zhì)量評價的指標之一，它與基因覆蓋度呈正相關，與測序中的假陽性和錯誤率呈負相關。圖4中為樣品的測序覆蓋度與測序深度分布，在DF組、TRB組和Control組樣品中，對于所用unique mapping reads與參考基因?qū)Ρ群蟮幕蚋采w度達到90%～100%的分別約有64%、67%和66%。

3.1.5 差異表達基因檢測及分析 對3組樣品的基因進行RPKM法定量，根據(jù)計算的基因表達量(RPKM值)計算該基因在不同樣本間的差異表達倍數(shù)。確定FDR≤0.001且差異表達倍數(shù)不低于2倍(log2 Ratio≥1)的條件對基因進行差異表達篩選。

本試驗3個樣品每2個進行基因差異表達統(tǒng)計分析，結(jié)果如圖5所示。DF組樣品相對于Control組樣品有194個基因上調(diào)表達，336個基因下調(diào)表達。TRB組樣品相對于Control組樣品有441個基因上調(diào)表達，201個基因下調(diào)表達。

3.2 差異表達基因的GO功能顯著性富集結(jié)果

對測序獲得的差異表達基因進行GO(Gene ontology)功能顯著性富集分析，結(jié)果如圖6所示。

圖4 基因覆蓋度統(tǒng)計Figure 4 Distribution of gene coverage圖5 差異表達基因統(tǒng)計Figure 5 Statistics of differentially expressed genes

precent of gene

注：1.代謝過程； 2.細胞過程； 3.定位的建立過程； 4.定位； 5.組織細胞的組成； 6.結(jié)構(gòu)形成； 7.細胞組分的生物合成； 8.生物調(diào)節(jié)； 9.生長； 10.免疫系統(tǒng)過程； 11.刺激反應； 12.色素沉著； 13.細胞； 14.細胞部分； 15.細胞器； 16.隔膜； 17.高分子復合物； 18.細胞器部分； 19.催化活性； 20.結(jié)合； 21.轉(zhuǎn)運活性； 21.結(jié)構(gòu)； 23.分子活性； 24.轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

圖6GO功能分析
Figure6GO functional analysis

在Control組-VS-DF組中，共富集到21個類別。生物進程有11個小類，即解剖結(jié)構(gòu)形成生物調(diào)節(jié)、細胞組分生物合成、細胞組織、細胞過程、固定的建立、生長、免疫系統(tǒng)過程、定位、代謝過程、刺激反應，共36個差異基因。細胞組分有6個小類，即細胞、細胞部分、膜部分、高分子復合物、細胞器、細胞器部分，共17個差異基因。在分子功能有4個小類，即結(jié)合、催化活性、結(jié)構(gòu)分子活性、轉(zhuǎn)運活性，共31個差異基因。生物進程中，“代謝過程”注釋的unigene(16個)最多占55.6%； 細胞組分中，“細胞”和“細胞部分”注釋到的最多(17個)占47.1%； 分子功能中，“催化活性”注釋到的最多(23個)占74.2%。

在Control組-VS-TRB組中，共富集到18個類別。其中，生物進程有7個小類，即生物調(diào)節(jié)、細胞過程、定位的建立、定位、代謝過程、色素沉著、刺激反應，共40個差異基因。細胞組分有6個小類，即細胞、細胞部分、膜部分、高分子復合物、細胞器、細胞器部分，共16個差異基因。在分子功能有5個小類，即結(jié)合、催化活性、結(jié)構(gòu)分子活性、轉(zhuǎn)運活性，共40個差異基因。生物進程中，“代謝過程”注釋的unigene(29個)最多占72.5%； 細胞組分中，“細胞”和“細胞部分”注釋到的最多(11個)占68.8%； 分子功能中，“結(jié)合”注釋到的最多(19個)占47.5%。

結(jié)果表明，DF組樣品與TRB組樣品作用相似，能夠改變紅色毛癬菌膜的通透性，影響生物被膜的結(jié)構(gòu)，干擾菌機體的代謝活動，達到抑制真菌及其生物被膜生長和發(fā)育的效果。TRB組的GO功能分析與目前報道的作用機制相符[15-16]。

3.3 差異表達基因的Pathway顯著性富集分析

通過KEGG對Control組-VS-DF組和Control組-VS-TRB組的pathway進行富集，以FDR<0.01，LogFC絕對值大于1進行差異表達基因的篩選。

在Control組-VS-DF組中，發(fā)現(xiàn)差異基因在代謝途徑、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工、氧化磷酸化、RNA轉(zhuǎn)運、谷胱甘肽代謝、酪氨酸代謝、過氧化物酶體等67個通路存在富集。“代謝途徑”相關的差異表達基因表達最多(47個)占21.56%，其次是“次生代謝產(chǎn)物的生物合成”(18個)占8.26%，“RNA轉(zhuǎn)運”(8個)占3.67%，“氧化磷酸化”(8個)占3.67%，“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工”(8個)占3.67%。

在Control組-VS-TRB組中，發(fā)現(xiàn)差異基因主要分布于等67個通路中存在富集?！按x途徑”相關的差異表達基因表達最多(53個)占22.55%，其次是“次生代謝產(chǎn)物的生物合成”(25個)占10.64%，“類固醇生物合成”(11個)占4.68%，“谷胱甘肽代謝”(9個)占2.98%，“RNA運輸”(7個)占2.55%。

途徑分析結(jié)果表明，DF組紅色毛癬菌在代謝途徑、次生代謝產(chǎn)物合成、RNA運輸、氧化磷酸化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工等代謝的差異表達基因與DF組抑制受試菌的作用機制相關，即DF能夠通過抑制受試菌的作用機制與抑制所需蛋白質(zhì)的合成和通過氧化磷酸化途徑相關。

TBR組紅色毛癬菌在代謝途徑、次生代謝產(chǎn)物合成、類固醇生物合成、谷胱甘肽代謝和RNA運輸?shù)幕虿町惐磉_與目前已報告的作用機制相符，即特比萘芬能干擾真菌麥角固醇的早期生物合成，抑制真菌的角鯊烯環(huán)氧化酶，使真菌細胞膜形成過程中角鯊烯環(huán)氧化反應受阻，從而達到殺滅或抑制真菌的作用。

4 討論

目前，常用抗真菌藥的作用機制分別有抑制真菌細胞膜的合成、抑制真菌細胞壁的成分、抑制核酸合成、抑制真菌的新陳代謝[17-18]。本次實驗結(jié)果表明DF對紅色毛癬菌的RNA運輸、氧化磷酸化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工運輸?shù)耐緩骄咭种谱饔茫雌淠苡绊懻婢Ｐ玛惔x、干擾細胞膜、細胞壁、核酸的合成，具有多種靶點作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，DF能夠下調(diào)核糖核酸酶P復合亞基、真核翻譯起始因子亞基和核孔復合蛋白相關基因的表達，影響真菌mRNA翻譯和環(huán)境脅迫應答，達到生長抑制作用[19-20]。

白色念珠菌的ATPase調(diào)控胞質(zhì)的ATP水平，ATPase的紊亂將誘發(fā)胞內(nèi)能量代謝功能障礙[21-22]。DF能夠迫使液泡ATP合成酶亞單位、液泡質(zhì)子轉(zhuǎn)位ATPase亞單位、線粒體ATP合成酶α亞基基因的下調(diào)表達，影響真菌機體正常的能量代謝，干擾菌體正常生長。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白累積可引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，導致細胞凋亡和自噬。磷脂酶D(PLD)可以通過抑制SAR1、SEC23/24、SEC13/31聚合形成COPII被膜小泡，抑制蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運輸?shù)礁郀柣w，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和細胞凋亡[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，DF組中COPII被膜小泡形成的相關編碼基因的表達明顯下調(diào)，可能引發(fā)真菌機體的凋亡和自噬，達到殺菌效果。

在多種耐藥途徑中，生物被膜的形成是主要耐藥機制之一[25-28]。生物被膜的形成需要多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂蛋白等的合成與分泌[29-30]，DF對真菌代謝抑制作用一定程度上會干擾生物被膜相關的物質(zhì)合成與代謝，導致生物被膜的發(fā)育困難。因此，DF有望作為一種新型的生物被膜抑制劑與常用抗真菌藥聯(lián)用，形成一種耐藥真菌的治療策略。

本研究基于轉(zhuǎn)錄組測序分析，初步揭示了香鱗毛蕨抗真菌作用的分子機制，提出DF作為新型抗真菌藥物和生物被膜抑制劑的發(fā)展?jié)摿Γ瑢嶒炇覍τ贒F中各單體化合物的抗菌活性和對耐藥菌的抑制作用的研究尚在進行中，希望為新型抗真菌藥物尤其具有良好抑制真菌生物被膜新藥的研發(fā)提供理論依據(jù)。