湯丹，曹東敏，黃廣梟，羅家敏，郭寧，王淑美

(1.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006； 2.國家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評價技術(shù)重點研究室，廣東 廣州 510006； 3.廣東省中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006； 4.廣東高校中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006； 5.廣東醫(yī)科大學藥學院，廣東 東莞 523000)

葛根為豆科植物野葛Puerarlialobata(Wild.) Ohwi的干燥根，習稱“野葛”，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品。葛根具有解肌退熱、生津止渴、透疹等功效，現(xiàn)代藥理研究表明它具有廣泛的藥理活性，特別是在心腦血管疾病、糖尿病等方面療效確切[1-3]。本課題前期采用網(wǎng)絡藥理學以及分子對接等技術(shù)，研究了葛根干預2型糖尿病及缺血性腦卒中的潛在活性成分和作用機制，研究表明以葛根素、大豆苷等為代表的異黃酮類化合物是葛根中的主要活性成分[4-6]。

目前與葛根指紋圖譜相關(guān)研究已有一些文獻報道[7-9]，成功用于藥材質(zhì)量評價等領(lǐng)域，但是多數(shù)局限于色譜指紋圖譜的建立和比較，對其中共有峰的指認鑒定關(guān)注較少，值得進一步研究。四級桿-靜電場軌道阱質(zhì)譜(Q-Orbitrap HRMS/MS)為新一代的高分辨質(zhì)譜，相對于其他高分辨質(zhì)譜，具有分辨率、質(zhì)量精度和靈敏度更高，質(zhì)量穩(wěn)定性更好等諸多優(yōu)勢。通過全掃描/數(shù)據(jù)依賴性二級掃描模式，一次進樣分析即可高通量完成高精度的一級和二級質(zhì)譜掃描，得到精確質(zhì)量數(shù)和離子碎片等化合物鑒定所需的信息，特別適用于中藥等復雜體系中化學成分的定性定量分析[10-12]。本研究擬通過建立葛根的HPLC指紋圖譜，并采用HPLC-Q-Orbitrap HRMS/MS液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定共有峰成分，以期為葛根的質(zhì)量綜合評價提供可行方法，并為后續(xù)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ultimate 3000 高效液相色譜儀，包括四元泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器，Q Exactive四級桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Secura125D型十萬分之一電子天平(德國Sartorius公司)；DK-S22型數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)；高速粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)；中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012年版，國家藥典委員會)。

1.2 試藥

葛根素、葛根素芹糖苷、葛根素木糖苷、3′-甲氧基葛根素、3′-羥基葛根素、芒柄花素、大豆苷、大豆苷元(質(zhì)量分數(shù)均大于98%)，均購自成都克洛瑪生物科技有限公司。乙腈、甲酸(色譜純，美國Fisher公司)；蒸餾水(屈臣氏集團公司)；其余試劑均為分析純。

藥材購自各藥店或藥材公司，經(jīng)廣東藥科大學中藥學院中藥資源系馬鴻雁副教授鑒定為豆科植物野葛Puerarialobate(Wild.) Ohwi的干燥根，藥材來源信息詳見表1。

表110批葛根藥材的來源信息表

Table1The Sources of 10 Batches of Puerariae Lobatae Radix

序號批號產(chǎn)地購買公司S1HX18R01湖南桑植廣東和翔制藥S220180804湖南麻陽慈谷鑫馨藥房S3181001廣東蕉嶺林芝參藥業(yè)S4180704廣西玉林萬圣堂藥房S5181101廣東蕉嶺同仁堂藥業(yè)S6180902湖南麻陽美佳康大藥房S7180807廣東佛岡參芪大藥房S820180701湖南桑植仁和堂大藥房S9180904廣西平南恒金堂大藥房S1020180501廣東佛岡七樂康大藥房

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Inertsil ODS-3 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.1%(體積分數(shù)，下同)甲酸溶液(B)，梯度洗脫(0～5 min，11%A→12%A；5～30 min，12%A→14%A，30～45 min，14%A→30%A；45～55 min，30%A→60%A；55～60 min，60%A→100%A)，流速為0.8 mL/min，檢測波長為254 nm，柱溫為25 ℃。

2.2 高分辨質(zhì)譜條件

離子源：可加熱式電噴霧離子源(HESI)；檢測方式：負離子模式；噴霧電壓：-3 000 V；輔助氣溫度：310 ℃；毛細管溫度：320 ℃；鞘氣流速：13.5 L/min；輔助氣流速：3 L/min。一級質(zhì)譜采用全掃描，范圍m/z120～800，質(zhì)量分辨率為70 000，二級質(zhì)譜采用動態(tài)數(shù)據(jù)依賴性掃描，碰撞能梯度為30、40 eV。

2.3 對照品溶液的制備

分別精密稱取葛根素芹糖苷、葛根素木糖苷、3′-甲氧基葛根素、3′-羥基葛根素、芒柄花素、葛根素、大豆苷、大豆苷元對照品適量，用甲醇溶解并配制成質(zhì)量濃度分別為147、127、118、137、127、209、161、195 μg/mL的混合對照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備

取葛根藥材粉末1 g (過3號篩)，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入30%(φ,下同)乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用30%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.5 方法學考察

2.5.1 空白溶劑考察 取甲醇，按“2.1”項下色譜條件進行分析，結(jié)果表明空白溶劑無干擾。

2.5.2 精密度考察 取同一批供試品溶液5 μL，按“2.1”項下色譜條件進行分析，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，以葛根素色譜峰的保留時間和色譜峰面積為參照，計算出各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果各共有峰的相對保留時間的RSD均≤0.08%、相對峰面積的RSD均≤4.97%，表明儀器的精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性考察 取同一批供試品溶液(批號HX18R01)5 μL，分別于0、2 、4、8、12、24 h測定，記錄色譜圖，以葛根素色譜峰的保留時間和色譜峰面積為參照，計算出各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果各共有峰的相對保留時間的RSD均≤0.22%、相對峰面積的 RSD 均≤4.94%，表明24 h 內(nèi)樣品的穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復性考察 取同一批次(批號HX18R01)葛根粉末(過3號篩)6份，每份1 g。分別按“2.4”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，以葛根素色譜峰的保留時間和色譜峰峰面積為參照，計算出各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果各共有峰相對保留時間的RSD值均≤0.14%，相對峰面積均≤5.0%，表明本法具有良好的重復性。

2.6 指紋圖譜的建立與技術(shù)參數(shù)的確定

2.6.1 指紋圖譜的建立 取10批葛根樣品(S1～S10)，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜峰，采用“中藥色譜指紋圖譜相似評價系統(tǒng)”(2012年版)對圖譜進行分析，以樣品S1為參照圖譜，以中位數(shù)法生成的共有模式作為對照圖譜，時間窗寬度為0.1 s，得到10批樣品的圖譜均有12個共有峰，見圖1～圖2。以葛根素峰(4號)為參照峰，計算10批樣品共有峰的相對保留時間及相對峰面積，結(jié)果見表2～表3。

S1～S10.表1中S1～S10號樣品。

圖110批葛根藥材的HPLC指紋圖譜重疊圖

Figure1HPLC fingerprint for 10 batches of Puerariae Lobatae Radix

1.葛根素-4′-O-葡萄糖苷； 2. 3′-甲氧基葛根素-4′-O-葡萄糖苷； 3. 3′-羥基葛根素； 4.葛根素； 5.葛根素-6″-O-木糖苷； 6. 3′-甲氧基葛根素； 7.葛根素芹糖苷； 8.大豆苷； 9.染料木素-8-C-芹糖基(1→6)-葡萄糖苷； 10.大豆苷元； 11.芒柄花素； 12.異大豆苷元。

圖210批葛根藥材生成的對照指紋圖譜

Figure2HPLC common pattern fingerprint of 10 batches of Puerariae Lobatae Radix

表2 10批葛根藥材的相對保留時間Table 2 Relative retention time of common peaks for 10 batches of Puerariae Lobatae Radix

表3 10批葛根藥材的相對峰面積Table 3 Relative area of common peak for 10 batches of Puerariae Lobatae Radix

2.6.2 相似度評價 利用“中藥色譜指紋圖譜相似評價系統(tǒng)”(2012年版)(軟件相似度計算采用向量夾角余弦法，相似度結(jié)果在0.9～1.0之間為符合要求)，將上述10批葛根樣品與對照指紋圖匹配，進行相似度評價，結(jié)果依次為0.998、0.994、0.993、0.995、0.997、0.999、0.970、0.998、0.996、0.993。各批葛根藥材與對照指紋圖譜間的相似度均不小于0.97，符合指紋圖譜的技術(shù)要求，表明10批次藥材之間具有較好的一致性，本方法可用于綜合評價葛根藥材的整體質(zhì)量。

2.6.3 指紋圖譜中主要共有峰的鑒定

葛根中的主要成分為異黃酮類成分[1]，采用已有對照品比對，可準確鑒定出葛根指紋圖譜中的以下共有特征峰：3′-羥基葛根素(峰3)、葛根素(峰4)、葛根素-6″-O-木糖苷(峰5)、3′-甲氧基葛根素(峰6)、葛根素芹糖苷(峰7)、大豆苷(峰8)、大豆苷元(峰10)、芒柄花素(峰11)。異黃酮的裂解方式主要是通過斷裂糖苷鍵和C4位羰基中性丟失CO的C環(huán)裂解以及逆Diels-alder(RDA)裂解，通過分析C環(huán)RDA裂解產(chǎn)生的開環(huán)碎片和特征丟失的中性碎片，可以判斷異黃酮母核的官能團取代情況[13]。從質(zhì)譜數(shù)據(jù)中可以較容易區(qū)分碳苷和氧苷，如葛根素和大豆苷分子量均為416，大豆苷為氧苷，在負離子模式質(zhì)譜中容易因氧糖苷鍵斷裂，脫去1個葡萄糖基(162 Da)，得到特征碎片離子峰m/z253[M-glc-H]-，與大豆苷元的準分子離子峰一致；而葛根素為碳苷，結(jié)構(gòu)中的糖苷鍵較穩(wěn)定不易斷裂，但有中性丟失特征碎片m/z295[M-C4H8O4-H]-，葛根素的衍生物3′-羥基葛根素和3′-甲氧基葛根素也都有該中性丟失特征裂解，分別產(chǎn)生碎片m/z311[M-C4H8O4-H]-和m/z325[M-C4H8O4-H]-。從異黃酮苷元的裂解規(guī)律來看，常見[M-CH2O-H]-和[M-CH2O-CO-H]-等特征碎片。

特征峰1(tR=9.16 min)，一級質(zhì)譜中出現(xiàn)準分子離子峰m/z577.155 0[M-H]-，經(jīng)計算分子式為C27H30O14，在二級質(zhì)譜中出現(xiàn)碳苷的特征碎片m/z457[M-C4H8O4-H]-，再發(fā)生葡萄糖氧苷鍵斷裂形成特征碎片m/z295[M-C4H8O4-glc-H]-，據(jù)此可推斷應為葛根素的葡萄糖苷，結(jié)合文獻[14-15]推測特征峰1為葛根素-4′-O-葡萄糖苷。特征峰2(tR=12.76 min)，一級質(zhì)譜中出現(xiàn)準分子離子峰m/z607.160 5[M-H]-，經(jīng)計算分子式為C28H32O15，在二級質(zhì)譜中出現(xiàn)碳苷的特征碎片m/z487[M-C4H8O4-H]-，同時也有葡萄糖氧苷特征碎片m/z325[M-C4H8O4-glc-H]-，結(jié)合文獻[14-15]推測特征峰2為3′-甲氧基葛根素-4′-O-葡萄糖苷。特征峰9(tR=36.72 min)，一級質(zhì)譜中出現(xiàn)準分子離子峰m/z563.139 1[M-H]-，經(jīng)計算分子式為C26H28O14，在二級質(zhì)譜中出現(xiàn)芹菜糖氧苷鍵斷裂形成的特征碎片m/z431[M-apiose-H]-，以及碳苷的特征碎片m/z311[M-apiose-C4H8O4-H]-以及m/z283[M-apiose-C4H8O4-CO-H]-，結(jié)合文獻[14-15]推測特征峰9為染料木素-8-C-芹糖基(1→6)-葡萄糖苷。特征峰12(tR=47.92 min)，一級質(zhì)譜中出現(xiàn)準分子離子峰m/z253.050 0[M-H]-，經(jīng)計算分子式為C15H10O4,其二級質(zhì)譜碎片也與大豆苷元一致，結(jié)合文獻[15]推測特征峰12為異大豆苷元。指紋圖譜中主要共有峰的鑒定結(jié)果見表4。

表4 葛根樣品中主要共有峰的高分辨液質(zhì)分析結(jié)果Table 4 HPLC-HRMS/MS analysis of main common peaks in Puerariae Lobatae Radix samples

*為化合物經(jīng)對照品比對。

3 討論

3.1 供試品溶液的制備

分別考察了水，30%、50%、70%甲醇，30%、50%、70%乙醇的提取效果，以色譜峰的個數(shù)為評價指標，試驗結(jié)果表明，采用30%乙醇提取時色譜峰數(shù)目較多，因此最終選擇30%乙醇作為提取溶劑。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

因葛根藥材成分較復雜，故先后對乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸、甲醇-0.1%甲酸等不同溶劑系統(tǒng)的不同比例進行了考察，結(jié)果表明乙腈-0.1%甲酸為流動相梯度洗脫時效果最佳，當檢測波長為 254 nm時，各色譜峰分離度和峰型較好，色譜峰數(shù)目較多，分布均勻，基線平穩(wěn)。

3.3 共有特征峰的高分辨質(zhì)譜鑒定

四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜將四極桿離子選擇和 Orbitrap 靜電場軌道阱技術(shù)高分辨掃描結(jié)合，可采用全掃描和自動觸發(fā)二級掃描模式同時對正負離子進行快速測定，能夠提供高質(zhì)量的全掃描和MS/MS數(shù)據(jù)，具有分辨率高、質(zhì)量精度高、靈敏度高、質(zhì)量軸穩(wěn)定性好等諸多優(yōu)點，能夠?qū)碗s體系中多種微量組分進行快速鑒定分析，是分析中藥復雜體系的有力工具。

本研究構(gòu)建了葛根藥材的HPLC指紋圖譜，通過其豐富的色譜峰信息和共有峰相似度分析，對10批不同產(chǎn)地的市售葛根藥材的質(zhì)量進行了評價。同時采用新型HPLC-Q-Orbitrap HRMS/MS高分辨液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，對指紋圖譜中的12個共有特征峰異黃酮成分進行了鑒定歸屬，為評價葛根藥材的質(zhì)量提供了依據(jù)，并為后續(xù)葛根藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定了基礎(chǔ)。