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        貯存環(huán)境對普洱生茶主要化學成分變化的影響

        2019-05-21 11:59:32寧井銘許姍姍侯智煒張正竹
        食品科學 2019年8期
        關鍵詞:陳化普洱茶普洱

        寧井銘,許姍姍,侯智煒,胡 欣,張正竹

        (安徽農業(yè)大學 茶樹生物學與資源利用國家重點實驗室,安徽 合肥 230036)

        普洱茶是以地理標志保護范圍內的云南大葉種(Camellia sinensis var. assamica(Mast.)Kitamura)曬青毛茶為原料,按特定的加工工藝生產成具有獨特品質特征的茶葉[1]。按照發(fā)酵程度的不同,普洱茶可分為普洱生茶和普洱熟茶兩大類。消費者普遍認為,普洱生茶具有陳化生香的品質特點[2],隨著貯存年限的延長,市場價格也逐年升高。

        普洱生茶在貯存期間化學成分變化不僅取決于貯存時間,同時與倉儲環(huán)境也有著緊密的聯(lián)系。不同倉儲地區(qū)生態(tài)環(huán)境條件差異較大,所貯存的普洱生茶具有不同的品質和風格特征[3]。普洱生茶按照貯存方式可分為干倉普洱茶和濕倉普洱茶。干倉普洱茶是指將普洱茶貯存在通風、干燥及空氣濕度低的環(huán)境中,而濕倉普洱茶是指將普洱茶貯存在溫度和濕度較高的環(huán)境中[4]。目前,在市場上存在著以濕倉普洱茶冒充陳年干倉普洱茶的現(xiàn)象,而且價格較高,極大損害消費者利益,也不利于普洱茶消費者科學貯存。目前關于普洱茶的研究主要集中在不同年份普洱茶理化指標[5]、香氣成分[6]、感官審評[7]和抗氧化[8]等方面,而對于在自然條件下干倉和濕倉貯存的普洱茶陳化品質研究較少。高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)和氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)聯(lián)用能從整體上對普洱生茶進行成分分析與質量評價,已被廣泛用于茶葉品質化學的研究領域中[9-12]。正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)可將正交信號校正方法與偏最小二乘法進行結合,濾除與研究對象無關的噪音[13],主要用于實現(xiàn)差異樣品的鑒別[14]和特征標記物的獲取[15]。

        本研究以勐海茶廠有限公司生產的普洱生茶(7542)(生產時間分別為2008年、2010年、2012年、2014年和2016年)為研究對象,貯存地點分別為新疆烏魯木齊和廣東廣州,貯存環(huán)境接近普洱茶的干倉和濕倉的貯存要求,通過對樣品進行感官審評、分析主要化學成分,結合OPLS-DA模型分析以及變量重要性因子(variable important for the projection,VIP)值以及S-plot圖等多元統(tǒng)計方法,找出不同貯存地普洱生茶的特征性化合物,分析這些特征性化合物變化規(guī)律。研究結果可為普洱茶科學貯存提供理論支持,也為消費者理性消費提供科學依據。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        普洱生茶(7542)于勐海茶廠有限公司生產,均采用同一標準采摘的云南大葉種加工而成;分別貯存于新疆烏魯木齊和廣東廣州倉庫中(自然貯存),每個樣品選取5 個等間隔年份。樣品采集后均貯存于實驗室4 ℃冰箱,樣品具體信息見表1。

        表 1 不同年份普洱生茶樣品信息Table 1 Information about raw Pu-erh tea samples tested in this study

        廣州市地處中國南部,屬典型的亞熱帶季風氣候,溫暖多雨、溫差較小,全年氣溫都維持在一個相對較高的水平,并且高溫(25 ℃)以上的時間在5-10月,是中國年平均溫差最小的城市之一,年平均相對濕度72.5%。而新疆烏魯木齊沒有像廣州的高溫高濕,地處中國西北,是世界上內陸中距離海洋和海岸線最遠的城市之一,屬溫帶大陸性干旱氣候,全年溫差較大,干燥少雨,最熱的是7月,月平均氣溫25.7 ℃,最冷的是1月,月平均氣溫-15.2 ℃,年平均相對濕度57.3%。

        兒茶素(純度≥99%)、表兒茶素(純度≥99%)、表沒食子兒茶素(純度≥98%)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(純度≥99%)、表兒茶素沒食子酸酯(純度≥98%)、沒食子酸(純度≥99%)、咖啡堿(純度≥99%) 美國Sigma公司;乙二胺四乙酸二鈉北京索萊寶科技有限公司;抗壞血酸、乙醚(化學純)國藥集團化學試劑有限公司;癸酸乙酯(分析純)上海阿拉丁生化股份有限公司;氨基酸與茶氨酸的混合標樣、氨基酸分析專用試劑AccQ.Tag(包括衍生化試劑AccQ.Fluor和磷酸緩沖鹽) 美國Waters公司。

        1.2 儀器與設備

        600高效液相色譜儀、2475熒光檢測器、2489紫外-可見光檢測器、HPLC Symmetry R C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜分析柱、AccQ.Tag C18氨基酸專用分析柱 美國Waters公司;同時蒸餾萃取裝置 中國科技大學玻璃儀器廠定制;N-EVAP-12氮吹儀 美國Organomation公司;7890A-5975C GC-MS聯(lián)用儀、HP-5(30 m×0.25 mm,0.25 μm)石英毛細管柱 美國Agilent公司。

        1.3 方法

        1.3.1 主要理化品質測定

        1.3.1.1 兒茶素組分和咖啡堿的檢測

        按照GB/T 8313—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素含量的檢測方法》[16]中的茶葉中兒茶素類的測定——HPLC法進行。

        1.3.1.2 18 種氨基酸單體的測定

        按照GB/T 8312—2002《茶葉中游離氨基酸的測定》[17]中要求制備,過0.22 μm濾膜后待衍生化用,采用美國Waters公司AccQ.Tag方法測定氨基酸含量[18]。

        1.3.2 香氣物質提取及分析

        1.3.2.1 提取

        稱取普洱茶樣品20 g置于1 000 mL圓底燒瓶中,加入400 mL純水,并加入1 mL質量濃度為100 μg/mL癸酸乙酯-乙醚溶液,接入同時蒸餾萃取裝置A口,電熱套加熱煮沸。用量筒量取30 mL乙醚至100 mL圓底燒瓶,接入同時蒸餾萃取裝置B口,45 ℃水浴加熱。萃取70 min后冷卻15 min,將全部乙醚萃取液轉移至盛有無水硫酸鈉的試管中密封,置于4 ℃冰箱中過夜使萃取液脫水,氮吹使溶劑揮發(fā),濃縮得到1 mL無色透明液體。

        1.3.2.2 GC-MS分析

        采用Agilent 7890A-5975C GC-MS聯(lián)用儀,HP-5石英毛細管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);進樣口溫度:200 ℃;檢測器溫度:280 ℃;升程范圍:50~190 ℃,柱箱程序:初始溫度50 ℃,然后以2 ℃/min升至190 ℃,運行時間:70 min;載氣:He,純度≥99.999%;柱流速:1 mL/min;進樣體積:1 μL;分流方式:不分流。離子源溫度:230 ℃,四極桿溫度:150 ℃;質量掃描范圍:40~600 u。掃描方式:全掃描;溶劑延遲3 min。

        1.3.3 定性和定量方法

        供試茶樣香氣成分根據GC-MS分析得到的各色譜峰,通過計算機譜庫檢索(Wiley和NIST庫),結合相對保留時間,查閱有關文獻數(shù)據進行定性,通過內標法進行相對定量[19]。1.4 數(shù)據處理

        實驗重復3 次,數(shù)據以3 次處理的平均值表示。顯著性分析采用SPSS 22.0數(shù)據軟件進行處理,OPLS-DA采用SIMCA-P 13.0數(shù)據軟件進行處理,柱狀圖采用Origin 9.1繪制,熱圖采用MEV 4.9.0繪制。

        2 結果與分析

        2.1 不同環(huán)境條件下貯存時間對普洱生茶感官品質的影響

        表 2 貯存于新疆與廣東普洱茶樣感官審評結果Table 2 Sensory quality of tea samples stored in Xinjiang and Guangdong

        從表2可知,廣東茶樣轉化速率整體快于新疆茶樣,同一批茶樣在兩地區(qū)貯存一定時間后,感官品質呈現(xiàn)出明顯的差異。香氣上,新疆倉儲茶樣香氣相對較純正,在陳化后期,香氣整體偏果香。廣東茶樣陳化過程中出現(xiàn)一定程度的粗、煙味,陳化后期出現(xiàn)陳香。湯色上,兩地區(qū)茶樣總體逐漸變深,轉化較快的是廣東樣,在倉儲第3年,湯色由黃綠轉化成橙黃,到倉儲第9年,湯色轉化成橙紅。滋味和葉底也出現(xiàn)較大的差異,隨著貯存時間的延長,新疆倉儲普洱茶滋味由粗澀轉化成濃醇,而廣東倉儲生普洱茶后期轉化較快,滋味純正但醇厚感不足。

        2.2 不同貯存環(huán)境下普洱生茶差異性化學成分篩選

        圖 1 普洱生茶OPLS-DA得分圖Fig. 1 OPLS-DA score plot of raw Pu-erh raw tea

        由圖1可以看出,新疆倉和廣東倉可顯著分成2 部分,這表明兩貯存地區(qū)普洱生茶主要化學成分存在顯著差異。研究中發(fā)現(xiàn),OPLS-DA模型包含7 個主成分,擬合參數(shù)R2X=0.967,說明7 個主成分解釋96.7% X變量;對因變量的擬合指數(shù)R2Y=1,說明5 個主成分解釋100%的Y變量;模型預測指數(shù)Q2=0.943,說明模型對新疆倉儲普洱生茶和廣東倉儲普洱生茶的預測能力為94.3%,模型的穩(wěn)定性及預測能力均較好[20]。

        圖 2 OPLS-DA模型VIP值Fig. 2 Bar plot of VIP for OPLS-DA model

        為進一步找出對結果分類起貢獻作用的變量,進一步分析2 組數(shù)據的整體差異性,得到OPLS-DA VIP值。VIP值可以量化OPLS-DA的每個變量對分類的貢獻,VIP值越大,變量在不同貯存地區(qū)間的差異越顯著。如圖2所示,10 個內含成分的VIP值大于1。結果表明,丙氨酸、表兒茶素、沒食子酸、精氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、甘氨酸、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、茶氨酸、表沒食子兒茶素10 種化學成分為貯存在新疆和廣東兩地普洱生茶差異化學成分。

        2.3 不同貯存地普洱茶特征性差異成分比較

        圖 3 兩地貯存普洱生茶的差異性變量分析結果Fig. 3 Differential variable analysisof raw Pu-erh tea samples from different storage areas

        對獲得的差異性變量在兩貯存地區(qū)的分布進行統(tǒng)計分析,結果如圖3所示。隨著貯存時間的延長,貯存在新疆地區(qū)普洱茶葉主要化學成分轉化速率慢于廣東地區(qū),已檢測化學成分含量中除沒食子酸外均高于廣東倉,從第1年貯存到第9年,廣東茶樣中表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素和表兒茶素由貯存第1年的97.7、25.5、6.90 mg/g分別下降至61.3、13.4、2.80 mg/g,降幅分別達37%、47%和59%,沒食子酸由貯存前的1.60 mg/g上升至3.70 mg/g。從第1年貯存到第9年,廣東倉樣品中6 種氨基酸(茶氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、甘氨酸)含量顯著降低,2 種甜味氨基酸(丙氨酸、甘氨酸)在貯存過程中降解消失,研究結果與前人所得結論[21]一致。貯存在新疆地區(qū)普洱茶兒茶素總量和氨基酸總量也呈現(xiàn)出下降趨勢,其中簡單兒茶素(表沒食子兒茶素、表兒茶素)呈現(xiàn)上升的趨勢,但不同年份之間差異性沒有達到極顯著水平。

        研究表明兒茶素和氨基酸是構成茶湯苦澀味和鮮爽味的主要來源,且參與茶葉香氣的形成和轉化[22-23]。普洱生茶受兩貯存地氣候、環(huán)境、干濕度等因素的影響,導致兒茶素和各氨基酸成分轉化程度不同[24-25]。從本研究檢測的兒茶素與氨基酸來看,廣東倉普洱生茶從各方面來看,轉化速率更快,除沒食子酸以外,其他化學成分低于新疆倉儲。陳保等[26]通過對成品普洱茶在不同貯存條件的研究,結果表明茶多酚隨著貯存時間的延長、貯存溫度的升高而下降,且茶葉含水量高者下降幅度大。因此,推測廣東地區(qū)的高溫高濕加速了茶葉中氨基酸、兒茶素等物質的氧化聚合[11],其中沒食子酸含量的升高可能與貯存過程中酯型兒茶素或其他沒食子酸衍生物發(fā)生水解等反應有關[27]。綜合感官審評,隨著貯存時間的加長,廣東地區(qū)的茶樣品質轉化較快,陳化后期醇厚度下降,品質發(fā)生下降。而新疆地區(qū)的茶樣品質轉化較慢,陳化后期保留了較多普洱生茶的醇厚滋味,品質和風味更佳。

        2.4 不同貯存環(huán)境普洱生茶揮發(fā)性成分分析

        基于70 個揮發(fā)性成分構建新疆倉普洱生茶與廣東倉普洱生茶的OPLS-DA得分(圖4A)可以看出,新疆倉樣品全部位于X負半軸,廣東倉樣品全部位于X正半軸,且廣東倉樣品不同年份的坐標點在得分圖上位置較遠,結果表明兩倉儲型普洱生茶的揮發(fā)性化學組成差異顯著,同時廣東倉樣品不同年份間差異大于新疆倉。OPLS-DA揮發(fā)性成分模型主成分回歸系數(shù)R2X=0.759,R2Y=1.000,Q2=0.952,表明該模型的穩(wěn)定性及預測能力均達到要求。

        為進一步找出兩倉儲普洱生茶差異性大的揮發(fā)性變量,提取OPLS-DA模型中VIP值最大的前29個變量(VIP值>1),這29 個變量在載荷矩陣圖(圖4B)和S-plots圖(圖4C)中距原點都有較大的距離,表明它們對分類的貢獻較大。同時觀察可知,廣東倉樣品香氣成分數(shù)量遠遠大于新疆倉樣品。圖4D為OPLS-DA模型中部分變量相關系數(shù)柱狀圖,相關系數(shù)的絕對值大小代表其對應變量對OPLS-DA結果的影響,即間接反映兩倉儲地區(qū)普洱生茶相應揮發(fā)性成分的差異大小。正值代表其對應的揮發(fā)性成分在新疆倉高于廣東倉,負值則低于廣東倉。以VIP值大于1為界限進行篩選并結合載荷圖,S-plots圖和相關系數(shù)綜合分析可篩選出大馬士酮、2,6,6-三甲基-1-環(huán)己烯-1-羧醛、α-松油醇、香葉基丙酮、棕櫚油酸、β-環(huán)檸檬醛、亞麻酸、橙花醇、苯甲醛和亞油酸是影響兩地區(qū)貯存最重要的10 個變量。

        圖 4 新疆、廣東普洱生茶揮發(fā)性成分多元統(tǒng)計分析Fig. 4 Multivariate statistical analysis of volatile components of raw Pu-erh tea samples stored in Xinjiang and Guangdong

        2.5 差異性成分在新疆倉與廣東倉中的相對含量分析

        對獲得的10 個差異性較大的揮發(fā)性變量在兩倉儲地區(qū)的相對含量進行熱圖分析,如圖5所示,總體而言,廣東倉的揮發(fā)性物質組成種類及含量高于新疆倉。其中大馬士酮、β-環(huán)檸檬醛、橙花醇、棕櫚油酸和亞油酸這5 種揮發(fā)性物質在廣東倉檢測到,而在新疆倉沒有檢測到或含量很低。2,6,6-三甲基-1-環(huán)己烯-1-羧醛和香葉基丙酮在新疆倉含量豐富,在廣東倉沒有檢測到或含量很低,α-松油醇、亞麻酸和苯甲醛在廣東倉的含量高于新疆倉。

        圖 5 不同年份生普中特征性香氣物質差異Fig. 5 Variations of volatile components in tea samples of different ages

        普洱生茶具有獨特的香氣,不同貯存環(huán)境對普洱生茶的影響差異很大。呈香型物質大馬士酮、β-環(huán)檸檬醛和橙花醇在廣東地區(qū)檢測到,而在新疆地區(qū)幾乎檢測不到。酸類物質(棕櫚酸、亞油酸、亞麻酸)同樣在廣東地區(qū)含量顯著高于新疆地區(qū)。因此推測,高溫高濕的環(huán)境造成呈香型物質的形成和轉化,同時也可以使不飽和脂肪酸過氧化物進一步氧化降解形成酸類物質[28]。

        α-松油醇為陳茶特征型香氣成分,對普洱生茶的陳香有著直接的貢獻[29],α-松油醇在廣東地區(qū)含量高于新疆地區(qū),在一定程度上解釋了廣東茶樣陳化后期陳香產生的原因。香葉基丙酮兼具果香和木香,有研究指出該物質能使花香顯得更加圓潤[30],該物質僅在新疆貯存茶樣檢測到,這可能與新疆茶樣陳化后期獨特的果香有關。普洱茶的香氣是由多種香氣物質綜合作用的結果,各成分之間的協(xié)調的例關系才是普洱茶良好品質的基礎。

        3 結 論

        普洱茶陳化速率與貯存環(huán)境溫度、濕度相關,溫濕度高的貯存環(huán)境普洱茶陳化速率快,普洱茶陳化速率在廣東比在新疆快;相對溫、濕度低的貯存條件,普洱茶的品質和香氣比溫、濕度高的好,普洱茶在新疆地區(qū)陳化的品質優(yōu)于廣東地區(qū)。

        新疆倉與廣東倉普洱生茶內含品質成分存在明顯差異。廣東倉樣品內含品質成分(除沒食子酸外)明顯低于新疆倉,且隨著貯存時間的延長,廣東倉樣品物質降解速率更快。經過OPLS-DA結合VIP值初步篩選出來的標志性差異成分包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素、表兒茶素、沒食子酸、精氨酸、茶氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸10 個化合物。

        新疆倉和廣東倉的普洱生茶揮發(fā)性成分差異顯著,廣東倉普洱生茶呈香型物質種類相對復雜且變化較為劇烈,相對而言,新疆倉普洱生茶呈香型物質組成簡單且較為緩慢。通過OPLS-DA與VIP值結合S-plots和相關性分析最終得出大馬士酮、2,6,6-三甲基-1-環(huán)己烯-1-羧醛、α-松油醇、香葉基丙酮、棕櫚油酸、β-環(huán)檸檬醛、亞麻酸、橙花醇、苯甲醛和亞油酸是影響兩地區(qū)貯存最重要的10 個差異性標志物。

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