賈鵬禹，孫 蕊，趙晶晶，馮乃杰，鄭殿峰,*

（1.黑龍江八一農墾大學農學院，黑龍江 大慶 163319；2.國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319）

綠豆是我國重要的雜糧作物之一，可簡單蒸煮食用或加工成多種產品，作為良好的藥食同源食材深受大眾喜愛[1]。綠豆品質關系到原糧加工性能及其營養(yǎng)價值，綠豆中的脂肪酸組成是綠豆品質形成的重要指標，因此脂肪酸含量及其分析方法研究對綠豆等雜糧生產及科學研究具有指導意義[2-4]。

糧食中脂肪酸含量分析主要采用氣相色譜法，多采用不同極性的石英毛細管柱進行組分分離[5-6]，結合氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，FID）或質譜進行檢測[7-8]，其中FID是文獻報道中最為常見的檢測器。在樣品前處理方面，主要采用溶劑萃取、索氏提取或超臨界萃取等方法提取脂肪[9-11]，經濃縮后再由氫氧化鉀-甲醇等方法進行甲酯化后上機分析。雖然目前的脂肪酸組分測定方法較為成熟，但在樣品前處理方面存在樣品量需求大，有機溶劑消耗多及流程繁瑣等不足。與此同時，在作物逆境生理或化學調控研究領域，受環(huán)境脅迫或化學調控下的原糧品質受到關注，而在上述特定研究中，供試樣品量較少的問題給分析方法的靈敏度及重現性帶來新的挑戰(zhàn)，因此有必要創(chuàng)新分析方法。近年來，日本島津公司推出介質阻擋放電氦等離子體檢測器（dielectric barrier discharge ionization detector，BID），是一種通用型檢測器，利用高純氦氣在絕緣介質上產生氦等離子體，釋放出高能量光子（17.7 eV）用以離子化目標組分，可測定除氖和載氣氦以外的全部化合物，包括無機氣體和可揮發(fā)有機物[12-17]。目前該檢測器的應用多集中在永久性氣體（H2、O2、N2、CO、CH4和CO2）等組分的分析檢測，如高爐煤氣、水煤氣、化工氣、合成氣、填埋氣的檢測分析中[18-23]，對有機化合物的檢測鮮有報道。本課題組在預實驗中通過對37 種脂肪酸甲酯混合標準品測試發(fā)現BID對脂肪酸甲酯類化合物具有較高的靈敏度及良好的線性范圍，有望能通過此檢測器提升或改進原有方法，因此本實驗擬在深入比較BID和FID對脂肪酸檢測性能的基礎上，結合實際樣品的檢測要求，采用BID建立綠豆中脂肪酸組成分析方法，實現通過少量樣品即可滿足脂肪酸快速分析的目標。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用綠豆品種為‘綠豐2號’，該品種為農業(yè)部審定的黑龍江省適種品種，于2017年5月種植于黑龍江省農業(yè)科學院耕作栽培研究所冷害試驗基地并于當年收獲，收獲樣品在自然干燥后清除雜質，并置于網袋內于陰涼干燥處保存，測試前采用3100型實驗室錘式旋風粉碎磨于16 800 r/min粉碎處理10 min，過100 目篩待用。

異辛烷、甲醇（色譜純） 天津市大茂化學試劑廠；氫氧化鉀（優(yōu)級純） 天津市科密歐試劑公司；無水硫酸鈉（優(yōu)級純） 天津光復精細化工研究所；37 種脂肪酸甲酯混合標準品（序列號：965931N2190083） 上海安譜科學儀器有限公司；色譜標準物質（正十二烷、正十四烷、正十六烷，質量濃度100 ng/μL，瓶號：BW3093） 中國計量科學研究院；超純氦氣（純度99.999 9%，瓶號：00020654） 吳江梅塞爾工業(yè)氣體有限公司。

1.2 儀器與設備

Nexis GC-2030氣相色譜儀（配有BID、FID、150 位自動進樣器、LabSolutions色譜工作站）、GCMS-QP2010 Ultra氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（配有12 位自動進樣器，GCMS solution質譜工作站） 日本島津公司；ML104電子分析天平（感量為0. 000 1 g） 瑞士梅特勒-托利多公司；TGL-16B小型臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；3100型實驗室錘式旋風粉碎磨 瑞典波通公司。

1.3 方法

1.3.1 氣相色譜儀系統(tǒng)校正

為保證BID檢測方法的可靠性及BID與FID性能比較的系統(tǒng)一致性，本實驗在測試前進行儀器系統(tǒng)的校正，所用載氣為超純氦氣以消除氣源影響[23]。依據日本島津公司標準安裝報告書（QMS-2021）要求，在待機狀態(tài)下，利用系統(tǒng)自檢模式掃描一段BID背景信號，計算信號噪聲及基線漂移。在噪聲及漂移值達標后，平行采集5 次色譜標準物質（正十二烷、正十四烷、正十六烷）的出峰時間及峰面積，進行靈敏度及精密度考察；利用色譜標準物質分別通過BID及FID系統(tǒng)進行測試并記錄組分保留時間，通過儀器氣體流量增益校正使BID和FID各組分出峰時間保持一致。

1.3.2 儀器檢測條件

1.3.2.1 BID

色譜柱：HP-88石英毛細管柱（100 m×0.25 mm，0.25 μm）88%-氰丙基/芳基-聚硅氧烷固定液；載氣：超純氦氣（純度99.999 9%）；載氣流量：1.5 mL/min；程序升溫：由120 ℃起始保持1 min，以10 ℃/min升至175 ℃保持10 min，以5 ℃/min升至210 ℃保持5 min，再以5 ℃/min升至230 ℃保持10 min；進樣口溫度：250 ℃；隔墊吹掃流量：3 mL/min；分流比：1∶60；檢測器溫度：280 ℃；等離子體放電氣體流量：40 mL/min；進樣體積：1 μL。

1.3.2.2 FID

色譜進樣口程序升溫測試條件與BID相同。檢測器溫度：280 ℃；氫氣流量：25 mL/min；空氣流量：250 mL/min；尾吹氣流量：30 mL/min。

1.3.2.3 氣相色譜-質譜聯(lián)用組分定性條件

色譜進樣口程序升溫測試條件與BID相同。質譜接口溫度：250 ℃；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；電子電離源：70 eV；掃描模式：SCAN；掃描范圍：m/z 29～550；溶劑延遲時間：8 min。

1.3.3 FID與BID對組分信號響應能力的比較

參考Franchina等[15]的方法。在最佳儀器條件下，對37 種脂肪酸甲酯混合標準品分別采用FID與BID進行檢測，每種檢測器平行進樣5 次采集峰面積及峰面積歸一化數據，分別計算峰面積及峰面積歸一化平均值，以平均值比較2 種檢測器對各組分信號響應強度及響應能力。利用SPSS 19.0數據處理軟件進一步對FID和BID兩種檢測器對各脂肪酸甲酯組分峰面積及峰面積歸一化數據進行單因素方差分析，考察2 種檢測器對各目標組分的靈敏度及準確性差異。

1.3.4 樣品前處理

參考田甜等[24]研究方法并重新設計。準確稱取樣品50.0 mg于1.5 mL離心管中，依次加入1.00 mL異辛烷、30.0 μL氫氧化鉀-甲醇溶液和10.0 mg無水硫酸鈉，封蓋振搖60 s，靜置5 min后再次振搖60 s，12 000 r/min離心10 min，取上層清液加入樣品瓶中上機檢測。

1.3.5 組分定性與定量方法學考察

實際樣品組分定性采用標準品保留時間定性，并采用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀電子電離源（70 eV）結合NIST譜庫檢索輔助定性[25]。在方法學考察前，將混合標準品溶液逐級稀釋并分別進樣采集目標組分峰面積，將各組分質量濃度對應峰面積進行線性回歸計算得出回歸方程及相關系數，依據回歸方程及3 倍信噪比計算檢測限。對同一樣品按六邊形分布劃分等距取樣點，于6 個取樣點平行取樣進行樣品前處理并分別上機檢測，以各組分峰面積計算相對標準偏差考察方法重現性。標準品及樣品獲得的色譜圖在數據處理前通過相同的背景基線文件消除程序升溫產生基線漂移的影響，積分方法采用峰底連線及雙峰谷點中心切割方式，采用外標法及峰面積歸一化法對實際樣品定量。

1.4 數據統(tǒng)計及圖像處理

數據統(tǒng)計采用SPSS 19.0（IBM SPSS Statistics）統(tǒng)計分析軟件對BID組和FID組數據進行統(tǒng)計學分析。圖像處理方法采用LabSolutions 5.90（Shimadzu Corporation）色譜處理軟件和Origin 8.5圖形處理軟件（OriginLab）對采集色譜數據進行峰面積積分、峰標記及譜圖成像處理。

2 結果與分析

2.1 氣相色譜儀系統(tǒng)校正結果

在最終的系統(tǒng)校正條件下，BID基線噪聲值為74.00 μV，漂移值為1 233.36 μV。色譜標準物質正十二烷、正十四烷和正十六烷平均保留時間分別為2.095、3.234 min和6.024 min，平均峰面積分別為1 648 536、1 655 980和1 643 613，其中第3個峰正十六烷保留時間相對標準偏差為0.006%，峰面積相對標準偏差為0.405%。BID和FID分別測定正十六烷保留時間偏差為0.018%，上述說明儀器狀態(tài)符合測試要求。

2.2 系統(tǒng)適應性結果

圖 1 37 種脂肪酸甲酯混合標準品的BID氣相色譜圖Fig. 1 BID GC profiles of mixed standards of 37 fatty acid methyl ester

實驗采用37 種脂肪酸甲酯混合標準品對BID進行系統(tǒng)適應性考察，在最終測試條件下獲得BID氣相色譜如圖1所示。由圖1可知，色譜系統(tǒng)對組分分離狀況良好，BID對溶劑和37 種脂肪酸甲酯的信號響應正常，對各組分出峰幾乎無歧視效應，說明BID作為氣相色譜一種通用型檢測器對脂肪酸甲酯具有良好的系統(tǒng)適應性。22.5 min后的基線漂移由程序升溫引起，可通過扣除空運行獲得的背景文件達到平直狀態(tài)，滿足定量要求。

2.3 BID與FID對組分信號響應能力的比較

表 1 BID與FID信號響應性能比較Table 1 Comparison of signal response performance of BID and FID

續(xù)表1

如表1所示，經各峰面積均值比較，BID較FID對各組分靈敏度均高出1 個數量級，部分組分信號響應比達到15 倍以上，為針對少量實際樣品采用微型樣品前處理方法檢測提供前提條件。峰面積歸一化結果表明，2 種檢測器的測試準確性相當，說明BID對各組分響應能力相當，幾乎無組分歧視。單因素方差分析結果表明，2 種檢測器對各組分峰面積數據的差異均顯著，對各組分峰面積歸一化數據除花生酸和二十碳二烯酸外均差異不顯著，對花生酸和二十碳二烯酸2 種組分的響應表現為增強，其原因可能在于BID對高碳數脂肪酸甲酯的離子化效率更高[15]。上述進一步說明BID對各組分響應靈敏度高且數據準確性好，證明采用BID建立脂肪酸含量測定方法具有可行性。

2.4 方法學考察結果

表 2 目標組分線性方程、相關系數和線性范圍Table 2 Linear equations, correlation coefficients and linear ranges for target components

由表2可知，BID對目標組分表現出較高的靈敏度和良好的線性響應范圍。方法中各組分相對標準偏差在1.04%～1.35%之間，具有較高的重現性，證明采用微型樣品前處理方法在BID高靈敏度的線性區(qū)間內具有較好的方法適應性。

2.5 樣品檢測及方法應用結果

圖 2 綠豆樣品的BID氣相色譜圖Fig. 2 BID gas chromatography profile of mung bean sample

由圖2可知，以峰面積歸一化對各脂肪酸組成進行計算，結果顯示被測綠豆樣品中棕櫚酸相對含量為（24.610±0.305）%，硬脂酸為（3.979±0.050）%，油酸為（9.010±0.107）%，亞油酸為（43.865±0.456）%，γ-亞麻酸為（0.162±0.002）%，α-亞麻酸為（16.818±0.212）%，山崳酸為（1.266±0.016）%，二十碳五烯酸為（0.290±0.004）%，其中5 種含量較高的脂肪酸組分檢測結果與前人的研究報道[6]相似。與前人研究方法比較，由于BID方法的高靈敏度，能夠檢測樣品中微量組分如γ-亞麻酸等，可為相關研究提供更多組分信息。在進行大量樣品檢測應用后，證明所建方法可滿足環(huán)境脅迫及化學調控下綠豆脂肪酸品質的檢測要求，同時樣品需求量及實際消耗量僅為常規(guī)方法的百分之一，同時由于采用簡化的樣品前處理方法，樣品的檢測效率也得到提高。

3 結 論

本研究基于BID氣相色譜技術并采用微型樣品前處理建立綠豆中脂肪酸組成測定方法，該方法檢測器系統(tǒng)適應性強、靈敏度高、色譜柱組分分離選擇性好[26-27]。與以往研究報道相比，由于采用高靈敏度檢測器，能夠測出原糧中5 種常見脂肪酸之外的3 種微量組分[28]，且對微量組分檢測的峰面積相對標準偏差均小于1.35%，證明其靈敏度和穩(wěn)定性與質譜檢測器相當[29]；采用微型樣品前處理所需固體樣品量達到毫克級，能滿足珍貴樣品的分析檢測[30]，在實際應用中，本方法可實現單一綠豆植株不同結莢點內綠豆的脂肪酸組成分析，提高研究層次；實驗試劑消耗少，所用甲酯化試劑及溶劑約為文獻報道所用量5%～20%，且試劑為低值試劑，可節(jié)約分析成本[31]；樣品前處理流程簡單、快速、通量高，單一樣品前處理流程可在15 min內完成，提高了分析效率。本研究所建方法可為作物栽培、種質資源及食品科學研究提供技術保障，可拓寬BID的應用范圍，為其在微量或痕量有機物分析方法學領域提供實踐基礎。