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        1 株T1樣噬菌體vB_EcoS_IME18的分離鑒定及其受體分析

        2019-05-21 11:59:02童貽剛王靜雪
        食品科學 2019年8期

        李 萍,林 洪,童貽剛,*,王靜雪,*

        (1.中國海洋大學食品科學與工程學院,山東 青島 266003;2.軍事科學院軍事醫(yī)學研究所,微生物流行病研究所病原微生物安全國家重點實驗室,北京 100071)

        應用基因工程技術生產重組蛋白被廣泛應用于生物、醫(yī)藥、食品等領域。在重組蛋白表達系統(tǒng)中,大腸桿菌BL21由于其表達系統(tǒng)操作簡單、價格廉價、目的蛋白產量大而被廣泛用作受體菌[1]。值得注意的是,應用大腸桿菌BL21進行高密度發(fā)酵的生物技術實驗室和工廠車間非常容易受到噬菌體污染。實驗室或工廠避免噬菌體污染的預防措施主要包括控制感染源、菌株輪換、傳統(tǒng)的基因工程策略和基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的噬菌體防治策略[2-4]。預防和控制噬菌體污染策略的開發(fā)需要更多噬菌體吸附過程及噬菌體受體信息的支持。

        噬菌體是一類能夠侵染細菌的病毒,烈性噬菌體的生活周期通常包括吸附、注入、復制、轉錄和翻譯、裝配和釋放。吸附是噬菌體感染的第一個步驟,噬菌體顆粒首先與宿主細胞表面碰撞,然后特異性識別其受體并緊密結合細胞[5]。噬菌體受體可以是蛋白質、多糖、脂多糖、菌毛、鞭毛和莢膜,在革蘭氏陰性菌中,外膜蛋白和脂多糖或二者的組合經常作為噬菌體受體[6]。噬菌體和細菌存在共同進化的關系[7],為了抵抗噬菌體的襲擊,細菌經常通過改變噬菌體受體來阻止噬菌體吸附,例如受體的表達下調、突變或丟失和空間阻遏[8]。在已有研究中,通過篩選噬菌體抗性突變分析噬菌體受體的方法已十分成熟[9-13]。本研究將利用篩選噬菌體抗性突變株分析噬菌體受體,為噬菌體-宿主互作研究和噬菌體污染防治提供數(shù)據(jù)支持。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        本實驗所用大腸桿菌BL21購自北京全式金生物公司,保存于本實驗室;大腸桿菌噬菌體 vB_EcoS_IME18(以下簡稱IME18)分離于本實驗室污水;質粒pKDsgack、pCas9cr4和pKDsg-p15保存于本實驗室;所使用的引物均由北京諾塞基因公司合成。

        阿奇霉素(Spec)、氨芐青霉素(Amp)、L-阿拉伯糖、脫水四環(huán)素 上海生工公司;pEASYUniSeamLess Cloning and Assembly Kit、2×Trans Taq?高保真(HiFi)聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)SuperMix、Trans 5α感受態(tài)細胞 北京全式金生物公司;Gel Extraction Kit、Plasmid Mini Kit寶生物工程(大連)有限公司;Q5?HotStart High-Fidelity 2×Master Mix 美國NEB公司;Pure PCR Template Preparation Kit 德國羅氏公司。

        1.2 儀器與設備

        Power Wave XS2酶標儀 美國BioTek公司;MiSeq測序儀 美國NEB公司;Bioruptor UCD-200TS超聲儀美國賽默飛公司;Micro Pulser電轉儀 美國Bio-Rad公司;Tannon-4200SF凝膠成像儀 上海天能科技有限公司;DNA電泳儀及相關設備 北京沃德生物醫(yī)學儀器公司;9700型PCR儀 美國Applied Biosystems公司。

        1.3 方法

        1.3.1 噬菌體的分離與純化

        取實驗室未經處理的污水,12 000 r/min離心10 min,上清液用0.22 μm的濾器過濾。將污水濾液200 μL以及對數(shù)期的BL21菌液4 mL加入2 mL 3×LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、220 r/min培養(yǎng)6 h。培養(yǎng)液用0.22 μm微孔濾膜過濾,所得濾液即為噬菌體原液。參考文獻[14]所述的雙層平板法進行噬菌體純化。

        1.3.2 噬菌體的電鏡觀察

        采用磷鎢酸負染法,通過透射電子顯微鏡觀察噬菌體形態(tài)。將銅網浸于純化的噬菌體保存液內5 min,取出后用濾紙吸干多余液體,此后將其浸于2%磷鎢酸染液中染色1 min,室溫干燥5 min,使用透射電鏡觀察噬菌體形態(tài)。

        1.3.3 噬菌體基因組的提取

        參考文獻[15]所述蛋白酶K/SDS的方法進行噬菌體基因組的提取,將DNA于-20 ℃保存。

        1.3.4 噬菌體的全基因組測序及分析

        使用Illumina公司的MiSeq測序平臺進行噬菌體IME18的DNA文庫構建和全基因組測序。選取高質量的下機數(shù)據(jù)拼接成全基因組序列。使用NCBI的BLASTn(http://blast.ncbi.nlm.nlm.nih.gov/)進行序列相似性比對;通過在線RAST(http://rast.nmpdr.org)進行全基因組快速注釋,BLASTp完善注釋結果;使用MEGA6軟件構建噬菌體末端酶大亞基進化樹;通過Inkscape 0.92.1軟件繪制噬菌體全基因組功能模式圖,噬菌體IME18與T1噬菌體基因組序列ORF比對分析圖。

        1.3.5 噬菌體的最佳感染復數(shù)(multiplicity of infection,MOI)及一步生長曲線

        參考文獻[15]所述方法進行噬菌體的最佳MOI及一步生長曲線測定。取對數(shù)期(OD600nm=0.6)的BL21菌液5 mL,按照MOI為10、1、0.1、0.01、0.001的比值依次加入噬菌體,37 ℃、220 r/min培養(yǎng)4 h至培養(yǎng)液澄清。將培養(yǎng)液上清用微孔濾膜過濾,使用雙層平板法測定上清液中噬菌體的效價。效價最高的MOI為該噬菌體的最佳MOI。

        取對數(shù)期的BL21菌液20 mL,以最佳MOI(MOI=0.01)的比值加入噬菌體,37 ℃孵育5 min,12 000 r/min離心1 min,棄上清液,沉淀用LB培養(yǎng)基洗滌兩次并重懸于20 mL LB培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)液置于37 ℃、220 r/min搖床中培養(yǎng)90 min,每隔5~10 min取樣,測定噬菌體的效價。以時間為橫坐標、噬菌體效價為縱坐標繪制一步生長曲線。

        1.3.6 噬菌體的體外殺菌效果

        取對數(shù)期的BL21菌液,按照MOI值為10、1、0、0.1、0.01、0.001依次加入噬菌體,于37 ℃、220 r/min培養(yǎng)4 h至培養(yǎng)液澄清。分別在0~2 h每隔10 min取樣,測定培養(yǎng)液的OD600nm值。

        1.3.7 噬菌體宿主譜測定

        采用噬菌體斑點實驗測定噬菌體宿主譜:取300 μL對數(shù)期的待測菌液與半固體培養(yǎng)基混勻,平鋪在含下層固體LB培養(yǎng)基的平板上,靜止5 min待其凝固,在細菌層上滴加2 μL噬菌體保存液,37 ℃培養(yǎng)8 h,觀察是否有噬菌斑出現(xiàn)。

        1.3.8 噬菌體抗性株的篩選和驗證

        取300 μL對數(shù)期的BL21菌液與100 μL梯度稀釋的噬菌體保存液(101~108PFU/mL)混合,室溫吸附5 min,按照雙層平板法培養(yǎng)噬菌體,延長培養(yǎng)時間至抗性菌株形成。采用上述噬菌體斑點法測定細菌的噬菌體敏感性。選擇無法形成噬菌斑的單克隆菌液為模板,進行16S rDNA鑒定。

        1.3.9 噬菌體抗性株的基因組提取、高通量測序、比較基因組學分析

        隨機挑選3 株鑒定正確的抗性株(BL21-R),37 ℃過夜培養(yǎng)。使用Pure PCR Template Preparation Kit提取細菌基因組DNA,將DNA于-20 ℃保存??剐灾甑娜蚪M序列如上所述通過MiSeq測序平臺和生物信息學軟件獲得。使用CLC Genomics Workbench 9.0(CLC)軟件將抗性株的contigs映射到參考菌株BL21(GenBank:NC_012971)的完整基因組上進行序列比對分析。

        1.3.10 噬菌體受體突變株的構建

        1.3.1 0.1 質粒pKDsg-tonB、pKDsg-fhuA的構建

        質粒pKDsg-tonB、pKDsg-fhuA的構建利用基于PCR擴增的循環(huán)聚合酶延伸克隆技術完成[16]。選取tonB(fhuA)基因前間區(qū)序列鄰近基序(protospacer adjacent motif,PAM)前20 bp序列作為向導RNA(small guide RNA,sgRNA),重新靶向質粒pKDsg-ack[17-19]。用于PCR擴增DNA片段的兩對引物為:pKDsg-tonB-F(pKDsg-fhuA-F)和gamR;pKDsg-tonB-R(pKDsgfhuA-R)和gamF(表1)。使用Q5?HotStart High-Fidelity 2×Master Mix,以pKDsg-ack質粒為模板進行PCR擴增。PCR儀器設置:98 ℃預變性2 min;98 ℃變性30 s,58 ℃退火2 min,72 ℃延伸2 min,35 個循環(huán);72 ℃延伸2 min。使用Gel Extraction Kit進行PCR產物的凝膠純化。通過pEASY-UniSeamLess Cloning and Assembly Kit將兩段PCR產物連接。取5 μL連接產物轉化100 μL感受態(tài)細胞Trans 5α,涂布于含Spec(50 mg/L)的LB平板上,30 ℃過夜培養(yǎng)。次日,挑取單克隆于LB液體培養(yǎng)基中30 ℃振蕩培養(yǎng)12 h。使用Plasmid Mini Kit提取質粒pKDsg-tonB、pKDsg-fhuA。

        表 1 實驗所用引物Table 1 Primer sequences used in this study

        1.3.1 0.2 重組

        設計外源寡核苷酸(Oligo-tonB、Oligo-fhuA)用于同源重組,5’端添加3 個硫代磷酸酯鍵以防止其降解[19]。使用培養(yǎng)至對數(shù)期的BL21菌液制備感受態(tài)細胞;將2 μL pCas9cr4、pKDsg-tonB(pKDsg-fhuA)質粒轉化100 μL上述感受態(tài)細胞,并涂布在含Amp(100 mg/L)、Spec(50 mg/L)的LB平板上,30 ℃過夜培養(yǎng)。將含質粒pCas9cr4、pKDsg-tonB(pKDsg-fhuA)的單克隆于30 ℃培養(yǎng)至對數(shù)期,加入終濃度為50 mmol/L的L-阿拉伯糖繼續(xù)培養(yǎng)15~20 min以誘導λ-Red同源重組系統(tǒng)表達,之后制備感受態(tài)細胞;將終濃度為2 μmol/L的外源寡核苷酸轉化上述感受態(tài)細胞,涂布于含Amp(100 mg/L)、Spec(50 mg/L)、脫水四環(huán)素(100 ug/L)的LB平板,30 ℃過夜培養(yǎng)。次日,挑取重組的突變株Δ-tonB、Δ-fhuA單克隆于LB液體培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)至對數(shù)期。

        1.3.1 0.3 突變株tonB(fhuA)基因的測序

        使用Primer-BLAST工具設計BL21的tonB(fhuA)基因鑒定引物,tonB-F和tonB-R(fhuA-F和fhuA-R)(表1)。以上述突變株菌液為模板,使用2×Trans Taq?高保真(HiFi)PCR SuperMix進行PCR擴增。將PCR產物送至北京諾塞基因公司測序。通過CLC比對突變株Δ-tonB(Δ-fhuA)和BL21的tonB(fhuA)基因差異。

        1.3.11 突變株的噬菌體敏感性驗證

        接種突變株Δ-tonB、Δ-fhuA于LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至對數(shù)期,通過噬菌體斑點實驗,噬菌體吸附實驗驗證突變株的噬菌體敏感性。噬菌體斑點實驗根據(jù)上文所述方法完成。噬菌體吸附實驗按照如下所述方法[20]:取對數(shù)期的Δ-tonB(Δ-fhuA)菌液(108CFU/mL)1 mL,12 000 r/min離心1 min,棄上清液,用磷酸鹽緩沖液洗1 次并重懸于900 μL LB培養(yǎng)基中;將噬菌體保存液(107PFU/mL)100 μL加入其中并混勻,37 ℃吸附5 min,12 000 r/min離心1 min。以LB代替噬菌體保存液為對照。通過雙層平板的方法測定上清液中的噬菌體的效價。

        2 結果與分析

        2.1 噬菌體的形態(tài)

        通過雙層平板法分離得到1 株噬菌體,命名為IME18,該噬菌體在平板上形成圓形、透亮的噬菌斑,其邊界清晰,效價約為2.4×1011PFU/mL(圖1A)。在電鏡下,噬菌體IME18頭部呈正多面體對稱,直徑約為66 nm,尾部呈非收縮性,長約150 nm(圖1B)。根據(jù)2012年國際病毒分類委員會第9次報告提出的噬菌體分類與命名標準,該噬菌體屬于長尾病毒科(Siphoviridae)。

        圖 1 噬菌體IME18生態(tài)特性Fig. 1 Ecological characteristics of phage IME18

        2.2 噬菌體全基因組分析

        噬菌體IME18(GenBank:MH051911)基因組全長為50 354 bp,G+C含量為45.6%。在線軟件tRNAscan-SE 2.0沒有預測到該噬菌體含有tRNA。經RAST分析和BLASTp比對,該噬菌體共含有82 個開放閱讀框(open reading frame,ORF),其中59 個ORF編碼假想蛋白,23 個ORF編碼功能性蛋白。功能性蛋白主要分為了4 個模塊:形態(tài)模塊(ORF2、ORF3、ORF4、ORF60、ORF67、ORF68、ORF69、ORF70、ORF71、ORF72、ORF75),DNA復制和調控模塊(ORF16、ORF55、ORF57、ORF59、ORF61、ORF62、ORF63、ORF64),DNA包裝模塊(ORF5、ORF6),裂解模塊(ORF47、ORF48)(圖2)。

        圖 2 噬菌體IME18全基因組功能模式圖Fig. 2 Functional map of bacteriophage IME18 genome

        利用比較基因組學分析噬菌體IME18基因組序列ORF與T1噬菌體ORF的同源性,結果顯示噬菌體IME18存在53 個(65%)ORF與T1噬菌體的同源性大于90%,有17 個(20%)ORF與T1噬菌體的同源性為50%~90%,另外12 個(15%)未知功能的ORF與T1噬菌體不存在同源性(圖3)。噬菌體IME18的末端酶大亞基進化分析同樣顯示了噬菌體IME18與T1類噬菌體有最近的進化關系(圖4)。比較基因組學分析和末端酶大亞基進化分析共同揭示了噬菌體IME18是Tunavirinae亞科,T1類的新成員。

        圖 3 噬菌體IME18與T1噬菌體基因組序列ORF比對分析Fig. 3 Schematic representation of the genomic organization of phage IME18 compared to phage T1

        圖 4 噬菌體IME18末端酶大亞基系統(tǒng)進化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of phage IME18 based on the terminal enzyme large subunit

        2.3 噬菌體的最佳MOI及一步生長曲線

        噬菌體IME18在MOI為0.01時具有最高效價,為2.4×1011PFU/mL。因此,噬菌體IME18的最佳MOI為0.01。

        圖 5 噬菌體IME18一步生長曲線Fig. 5 One-step growth curve of phage IME18

        如圖5所示,噬菌體IME18感染宿主菌后5 min內效價沒有明顯變化,表明噬菌體IME18的潛伏期為5 min。在5~55 min內,噬菌體效價明顯上升,之后趨于平穩(wěn),表明噬菌體的裂解時間為50 min。噬菌體IME18的爆發(fā)量為223 PFU/cell,表明噬菌體IME18具有很強的裂解能力。

        2.4 噬菌體的體外殺菌效果

        噬菌體按照不同的MOI值加入BL21的培養(yǎng)液中,在不同的時間點測定培養(yǎng)液的OD600nm值可以反映噬菌體IME18對BL21的體外裂解能力。如圖6所示,培養(yǎng)液的OD600nm值呈現(xiàn)先還緩慢上升后極速下降趨勢,MOI值越大OD600nm值下降越快。與對照組相比,不同MOI值處理的細菌OD600nm值在90 min內均顯著下降,說明噬菌體IME18對BL21的體外裂解能力較強。

        圖 6 噬菌體IME18的體外殺菌效果Fig. 6 In vitro bactericidal effect of phage IME18

        2.5 噬菌體宿主譜測定結果

        噬菌體斑點實驗結果顯示該噬菌體對大腸桿菌BL21、DH5α、MG1655、M3110、EC600和沙門氏菌Ty21a具有裂解性。對實驗室保藏的其他大腸桿菌菌株、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌均沒有明顯的裂解性(表2)。該噬菌體的裂解范圍較窄。

        表 2 噬菌體IME18的裂解譜Table 2 Lysis spectrum of phage IME18

        2.6 噬菌體抗性株的鑒定和基因組分析

        噬菌體斑點實驗表明,噬菌體抗性株對噬菌體IME18產生抗性(圖7B)。16S rDNA測序結果結合BLASTn比對顯示,抗性株沒有被其他雜菌污染。使用軟件CLC將噬菌體抗性株的contigs映射到參考BL21的全基因組序列上,查找單核苷酸變異、插入、缺失。結果顯示,存在15 718 bp序列在3 株耐受菌中同時缺失(表3)。比對BL21在GenBank的注釋結果,噬菌體抗性株共缺失了18 個編碼區(qū)序列(coding domain sequence,CDS),其中5 個CDS(CDS1、CDS3、CDS5、CDS6、CDS7)編碼細菌膜蛋白,其余13 個CDS編碼參與細菌生長代謝相關蛋白。該結果說明噬菌體抗性株能夠通過大段基因序列的缺失來抵抗噬菌體的侵染。

        圖 7 噬菌體IME18的斑點實驗Fig. 7 Spotting assay of bacteriophage IME18

        表 3 BL21中與缺失片段相關的基因注釋Table 3 Gene annotation related to deletion fragments in BL21

        2.7 tonB、fhuA基因的沉默

        據(jù)報道,T1噬菌體使用FhuA外膜蛋白作為其第1受體,TonB蛋白作為其第2受體[21-22]。通過表3可知,選擇的噬菌體抗性株沒有出現(xiàn)fhuA基因的改變,但存在tonB基因的缺失,表明TonB蛋白在本次篩選到的抗性株中發(fā)揮重要作用。因此通過構建fhuA、tonB基因突變株來進一步研究噬菌體IME18的受體。

        質粒pCas9cr4、pKDsg-tonB(pKDsg-fhuA)、外源寡核苷酸依次轉入靶細胞BL21中,L-阿拉伯糖誘導重組酶的轉錄和翻譯,脫水四環(huán)素誘導sgRNA轉錄和Cas9的表達;Cas9在sgRNA的指引下準確靶向目的基因,于PAM位點處切開DNA雙鏈;含同源臂的外源寡核苷酸在重組酶的作用下整合到被切開的DNA雙鏈上,完成基因編輯。沉默突變導致突變株Δ-tonB的TonB蛋白、Δ-fhuA的FhuA蛋白完全喪失功能。如圖8所示,突變株Δ-tonB的tonB基因只表達240 個氨基酸的前8 個,Δ-fhuA的fhuA基因只能表達747 個氨基酸的前20 個。

        2.8 突變株的噬菌體敏感性驗證

        圖 9 噬菌體IME18的斑點實驗Fig. 9 Spotting assay of bacteriophage IME18

        圖 10 噬菌體IME18的吸附評價Fig. 10 Adsorption assay of phage IME18

        噬菌體斑點實驗和吸附實驗共同測定突變株對噬菌體的敏感性。噬菌體斑點實驗結果顯示,突變株Δ-tonB、Δ-fhuA對噬菌體IME18產生抗性(圖9)。圖10噬菌體吸附實驗結果顯示,對照組上清液中的噬菌體效價與實驗組Δ-tonB、Δ-fhuA(8.65×105PFU/mL)基本一致,而實驗組BL21上清液中噬菌體效價(5.18×105PFU/mL)明顯降低。結果表明TonB、FhuA蛋白參與噬菌體IME18的吸附和侵染。

        3 討 論

        T1類噬菌體屬于長尾噬菌體科,具有直徑約60 nm的多面體頭部,長約150 nm和直徑約7 nm的非收縮性尾部的特征[23]。T1類噬菌體基因組大小約50 kb,是具有末端冗余序列的環(huán)化雙鏈DNA[24]。本研究通過對噬菌體IME18的形態(tài)特征和全基因組序列分析,推測其屬于T1類噬菌體。噬菌體IME18的效價高達2.4×1011PFU/mL,爆發(fā)量為223 PFU/cell,能夠在體外于1.5 h內顯著殺死處于對數(shù)期的宿主菌,這種強裂解性表明其可能具有潛在的應用價值。

        噬菌體尾絲蛋白通過與細菌表面噬菌體受體結合決定噬菌體的宿主范圍。研究表明,T1噬菌體使用FhuA外膜蛋白作為其第1受體,TonB蛋白作為其第2受體[21-22]。噬菌體IME18的尾絲蛋白與T1噬菌體的尾絲蛋白存在95%的同源,推測TonB、FhuA蛋白同樣在噬菌體IME18的吸附和感染中發(fā)揮關鍵作用,并得到驗證。在大腸桿菌中,外膜蛋白FhuA主要參與鐵離子配合物中鐵離子的結合和轉運,并且可以作為大腸桿菌素M、小菌素J25、T1噬菌體、T5噬菌體、phi80噬菌體和UC-1噬菌體的受體。TonB蛋白與外膜受體蛋白相互作用,把質子的質膜勢能轉化為能量,將外膜受體蛋白結合的底物運輸?shù)街苜|中,然后通過特定的ABC轉運蛋白導入細胞質[25-27]。TonB蛋白主要參與VB12、鐵離子配合物和大腸菌素M的跨膜轉運,同時被證明TonB是T1噬菌體和Φ80感染的必需蛋白[25-27]。本研究通過噬菌體斑點實驗和吸附實驗證明了TonB、FhuA蛋白參與噬菌體IME18的吸附和侵染,為噬菌體-宿主互作研究提供了數(shù)據(jù)支持。

        噬菌體一方面是引起乳品和生物發(fā)酵失敗的重要因素,另一方面也在臨床、食品、養(yǎng)殖業(yè)、工業(yè)等方面有很大的應用價值。例如,使用噬菌體治療眼角膜膿腫和間質性角膜炎;減少肉類以及水果和蔬菜中的致病菌;減少家畜和魚類中的細菌;檢測食品和臨床樣品病原體[28-31]。研究噬菌體-宿主相互作用能夠為更好利用噬菌體這一巨大資源提供理論支持。

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