尹曼曼，樓覺(jué)人

(上海海利生物技術(shù)股份有限公司/上海市獸用生物制品工程技術(shù)中心，上海 奉賢 201403)

兔病毒性出血癥(Rabbit hemorrhagic disease，RHD)俗稱“ 兔瘟”，是由 RHD 病毒(RHDV)引起的一種急性、敗血性傳染病，對(duì)養(yǎng)兔業(yè)造成重大危害，死亡率高達(dá)90 %以上[1]。1984年該病首次在中國(guó)發(fā)現(xiàn)，之后在世界范圍內(nèi)迅速蔓延[2]。

至今仍未有一種能夠使RHDV 長(zhǎng)期穩(wěn)定傳代的細(xì)胞[3]，因此目前用于預(yù)防和控制RHD 疫情的疫苗主要是組織滅活疫苗，該疫苗不僅成本高，且一旦強(qiáng)毒滅活不徹底，會(huì)進(jìn)一步傳播病毒[4]。RHDV 只有一個(gè)血清型，其核衣殼僅由一個(gè)60 ku 的主要結(jié)構(gòu)蛋白VP60組成，各分離株VP60 基因高度保守，其核苷酸和氨基酸同源性均在90 %以上，VP60 在病毒診斷和疫苗設(shè)計(jì)方面發(fā)揮著重要的作用[5]。因此科研工作者相繼開(kāi)展對(duì)RHDV 基因工程苗的研制，相繼在大腸桿菌、桿狀病毒、痘病毒、酵母以及家蠶中表達(dá)了VP60 蛋白，表達(dá)的VP60 可以形成與天然RHDV 病毒粒子在物理形態(tài)上類似的不含病毒核酸的病毒樣顆粒(VLP)，其能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答[5-8]。2017年2月江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院兔病學(xué)科團(tuán)隊(duì)研發(fā)的RHDV 桿狀病毒載體滅活疫苗(BAC-VP60 株)獲得國(guó)家新獸藥一類注冊(cè)證書，這是我國(guó)也是世界上第一個(gè)獲得政府許可的針對(duì)兔瘟的亞單位疫苗[9]。嚴(yán)維巍等在畢赤酵母GS115 中表達(dá)了與天然 RHDV 結(jié)構(gòu)相似的 VLPs，表達(dá)的重組蛋白可以凝集人“ O”型紅細(xì)胞，該血凝性可以被抗RHDV 的高免血清所抑制[9]。但未驗(yàn)證畢赤酵母表達(dá)的VLP 對(duì)RHDV 的攻毒保護(hù)效果。

本研究利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定高效表達(dá)的 VP60 重組菌，在酵母內(nèi)表達(dá) RHDV VLPs，形成的VLPs 結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定和均一，表達(dá)量更高，并研究了其對(duì)實(shí)驗(yàn)兔的免疫保護(hù)性，為RHDV 亞單位疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 RHD組織滅活疫苗購(gòu)自某生物科技有限公司；攻毒用RHDV 為無(wú)菌采集的NB強(qiáng)毒株感染致死的SPF 兔肝臟和脾臟研磨所得的肝脾組織毒(LD50為106.0/mL)，由中國(guó)農(nóng)科院上海獸醫(yī)研究所劉光清研究員惠贈(zèng)。5 周齡SPF 實(shí)驗(yàn)兔，購(gòu)自山東青島康大生物科技有限公司。

表達(dá)載體pPIC3.5K 質(zhì)粒和畢赤酵母KM71 菌株購(gòu)自Invitrogen 公司；分子克隆所需各種酶和試劑盒等均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；RHDV 抗體ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自KernelTM公司；小鼠抗VP60單克隆抗體(MAb)購(gòu)自山東綠都生物有限公司；山羊抗小鼠HRP-IgG 購(gòu)自金斯瑞生物科技有限公司；Micro BCA Protein Assay Kit 購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；辣根過(guò)氧化物酶DAB 顯色試劑盒、葡萄糖、D- 生物素購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。配置 MD 和 MM 平板以及 BMGY 和 BMMY 培養(yǎng)基所用的YNB 無(wú)氨基酵母氮源購(gòu)自美國(guó)BD 公司；市售組織滅活疫苗購(gòu)自南京天邦生物科技有限公司。

1.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC3.5K-VP60 的構(gòu)建與鑒定RHDV 的 VP60 蛋白氨基酸序列相對(duì)保守，按照畢赤酵母密碼子偏好表保證其氨基酸序列不變的前提下對(duì)VP60 基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并在其兩端分別添加BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，得到具有自主專利的一條DNA 序列，由金唯智生物科技有限公司合成該DNA。合成的 VP60 DNA 經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后克隆至經(jīng)相同酶切的pPIC3.5K 載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒 pPIC3.5K-VP60，經(jīng)BamH Ⅰ/EcoRⅠ雙酶切鑒定正確的質(zhì)粒由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序鑒定。

1.3 重組菌pPIC3.5K-VP60/KM71 的篩選 將pPIC3.5K-VP60 質(zhì)粒經(jīng)SalⅠ線性化后電轉(zhuǎn)化KM71菌株，轉(zhuǎn)化后均勻涂布到MD年板上，倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，挑取單克隆以供篩選。同時(shí)將MD 板上的陽(yáng)性克隆點(diǎn)樣在MM 平板，進(jìn)一步純化陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子，經(jīng)SalⅠ單酶切的pPIC3.5K 空質(zhì)粒按照同樣方法電轉(zhuǎn)入KM71 作為對(duì)照。

1.4 重組VP60 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定 將篩選和純化后的陽(yáng)性酵母菌接種至BMGY 中，28 ℃，250 r/min 培養(yǎng)至 OD600nm=2～6，1 500 r/min 離心 5 min 收集酵母細(xì)胞并重懸至BMMY 中繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，每24 h 補(bǔ)加甲醇至終濃度為0.5 %。誘導(dǎo)48 h 后，離心收集酵母細(xì)胞并用PBS 重懸、破碎酵母菌體，上清用于 SDS-PAGE 分析，轉(zhuǎn)化pPIC3.5K 空載體的菌株經(jīng)同樣處理后作為對(duì)照。轉(zhuǎn)膜后分別用小鼠抗 VP60 MAb 體(1∶1 000)為一抗，山羊抗小鼠 HRP-IgG (1∶2 000)為二抗，westen blot檢測(cè)VP60 蛋白的表達(dá)。

1.5 重組VP60 蛋白的純化及電鏡觀察 取適量誘導(dǎo)后離心收集的酵母菌體，破菌后上清液按終濃度5 %加入 PEG6000，攪拌均勻后4 ℃過(guò)夜沉淀后棄上清，充分復(fù)溶沉淀后再次以 12 000 r/min 離心10 min，棄沉淀，上清經(jīng) SDS- PAGE 檢測(cè)并利用透射電鏡觀察是否形成了VLP。

1.6 VLP 疫苗的制備 純化后的 RHDV VLP 經(jīng)BCA 法檢測(cè)總濃度，SDS-PAGE 后通過(guò)灰度分析計(jì)算目的蛋白濃度，調(diào)整目的蛋白濃度為30 μg/mL、10 μg/mL，按 9∶1 加入 MONTANIDE GEL 01 PR 佐劑常溫?cái)嚢?0 min 配制成疫苗。

1.7 免疫和攻毒保護(hù)試驗(yàn) 將20 只35日齡健康實(shí)驗(yàn)兔，隨機(jī)分成 4組，每組 5 只，1、2 和 3組分別用 30 μg/mL VLP 疫苗、10 μg/mL VLP 疫苗、市售組織滅活疫苗經(jīng)皮下注射接種實(shí)驗(yàn)兔，1 mL/ 只。第4組為對(duì)照組，經(jīng)相同方式和劑量注射相同佐劑乳化的PBS。

免疫后 21 d 采血，采 用 RHDV 抗體 ELISA 試劑盒檢測(cè)實(shí)驗(yàn)兔血清中抗體水平，并用RHDV NB株肝脾組織毒(LD50為 106.0/mL)以1mL/ 只經(jīng)實(shí)驗(yàn)兔頸背部皮下兩點(diǎn)注射病毒液，連續(xù)觀察14 d，記錄每組實(shí)驗(yàn)兔死亡情況并計(jì)算保護(hù)率；并在攻毒后14 d迫殺實(shí)驗(yàn)兔，觀察各組實(shí)驗(yàn)兔各臟器眼觀病變。

1.8 抗體消長(zhǎng)規(guī)律檢測(cè) 另選用15 只35日齡健康實(shí)驗(yàn)兔，除無(wú) 10 μg/mL 劑量組以外，分組和免疫方式同 1.7，于免疫后的 0、2 周～24 周采血，分離血清，采用ELISA 試劑盒檢測(cè)實(shí)驗(yàn)兔血清中RHDV 抗體的消長(zhǎng)規(guī)律。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pPIC3.5K-VP60 的構(gòu)建與鑒定 優(yōu)化后合成的VP60 DNA 序克隆至pPIC3.5K 載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC3.5K-VP60。重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切得到約9 000 bp 和1 800 bp 的兩條片段，與預(yù)期相符；該質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果經(jīng)Clustal W2 序列比對(duì)，結(jié)果和優(yōu)化過(guò)的VP60 DNA 序列完全一致。表明正確構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC3.5K-VP60。

2.2 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及western blot 分析 將pPIC3.5K-VP60 質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化 KM71，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后，離心收集的酵母細(xì)胞破菌液上清用于SDS-PAGE 和western blot分析。SDS-PAGE結(jié)果顯示：重組菌pPIC3.5K-VP60/KM71 經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后，在 60 ku 左右出現(xiàn)目的條帶，而空載體轉(zhuǎn)化菌pPIC3.5K/KM71 無(wú)此條帶(圖1A)；用小鼠抗 VP60 MAb 經(jīng) western blot驗(yàn)證顯示：重組菌 pPIC3.5K-VP60/KM71 在 60 ku 左右出現(xiàn)特異性條帶，而 pPIC3.5K/KM71 無(wú)此條帶(圖1B)。表明，重組菌 pPIC3.5K-VP60/KM71 經(jīng)培養(yǎng)和甲醇誘導(dǎo)后能夠在酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)VP60 蛋白。

圖1 RHDV VP60 蛋白表達(dá)的SDS-PAGE 檢測(cè)(A)和western blot 鑒定(B)Fig.1 Detection and identification of the RHDV VP60 expression in Pichia pastoris by SDS-PAGE (A) and western blot (B)

2.3 VP60 蛋白的純化以及電鏡觀察 將表達(dá)的重組VP60蛋白經(jīng)PEG6000沉淀純化，SDS-PAGE 檢測(cè)結(jié)果顯示純化后去除了大部分的雜蛋白，灰度掃描分析其純度達(dá)80 %以上(圖2)。檢測(cè)后蛋白濃度為 650 μg/mL。

將純化后蛋白樣品經(jīng)負(fù)染后在電鏡下觀察可見(jiàn)大小為30 nm～40 nm 球形顆粒，pPIC3.5K/KM71 酵母菌經(jīng)相同處理后未觀察到類似顆粒(圖3)，表明在畢赤酵母中表達(dá)的RHDV VP60 蛋白能夠組裝成VLPs。

圖2 純化后的RHDV VP60 重組蛋白的SDS-PAGE 檢測(cè)Fig.2 Detection of the purified RHDV recombinant VP60 by SDS-PAGE

圖3 電鏡觀察RHDV 形成的VLPsFig.3 The observation of the VLPs under transmission electron microscopy

2.4 動(dòng)物免疫和攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果 將純化的RHDV VLP 加入佐劑制備為疫苗后免疫實(shí)驗(yàn)兔，免疫21 d 時(shí)的血清抗體檢測(cè)結(jié)果顯示，所有疫苗免疫組實(shí)驗(yàn)兔抗體均陽(yáng)轉(zhuǎn)(OD450nm＞0.3 為陽(yáng)性)，VLP 疫苗免疫組兔產(chǎn)生的抗體平均水平高于市售的組織滅活苗(圖4)。且 30 μg/mL VLP 疫苗免疫實(shí)驗(yàn)兔產(chǎn)生的抗體平均水平最高。

疫苗免疫實(shí)驗(yàn)兔21 d 時(shí)用RHDV 肝脾組織毒攻擊所有實(shí)驗(yàn)兔。結(jié)果顯示，PBS 對(duì)照組實(shí)驗(yàn)兔于攻毒后約20 h 開(kāi)始發(fā)病，表現(xiàn)出RHD 典型的臨床癥狀，如體溫升高，精神不振和神經(jīng)癥狀等，48 h 內(nèi)5 只兔全部死亡。而疫苗免疫實(shí)驗(yàn)組攻毒后個(gè)別兔有一過(guò)性的食欲不振和體溫升高，攻毒后14 d 內(nèi)15 只實(shí)驗(yàn)兔全部健活，迫殺存活實(shí)驗(yàn)兔顯示其各個(gè)臟器無(wú)眼觀的病理變化，3組實(shí)驗(yàn)兔均獲得100 %保護(hù)(表1)。結(jié)果表明以 10 μg/mL VLP 免疫實(shí)驗(yàn)兔后即可和市售組織苗一樣，能夠100 %保護(hù)實(shí)驗(yàn)兔抵御RHDV 強(qiáng)毒的攻擊。但本實(shí)驗(yàn)未發(fā)表的數(shù)據(jù)顯示10 μg VLP 免疫實(shí)驗(yàn)兔后于第三個(gè)月抗體開(kāi)始下降，并低于市售疫苗組，為了達(dá)到可靠的免疫保護(hù)期，抗體消長(zhǎng)規(guī)律試驗(yàn)中兔的免疫劑量仍為30 μg/頭份。

圖4 免疫不同劑量VLP 疫苗后21 d 實(shí)驗(yàn)兔血清中的抗體水平Fig.4 The serum antibody titers in rabbits immunized with different doses of VLPs vaccine at 21 days

表1 RHDV VLP 疫苗的攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The protection of the rabbits immunized with the VLPs against RHDV challenging

2.5 實(shí)驗(yàn)兔免疫后的抗體消長(zhǎng)規(guī)律檢測(cè)結(jié)果 采用30 μg/mL VLP 疫苗和市售疫苗分別免疫實(shí)驗(yàn)兔，免疫后于不同時(shí)間點(diǎn)采血檢測(cè)兩組實(shí)驗(yàn)兔血清抗體平均效價(jià)。結(jié)果顯示：從免疫后第2 周開(kāi)始，所有免疫兔抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)，VLP 疫苗和市售疫苗實(shí)驗(yàn)兔血清抗體分別在免疫后第1 個(gè)月和第2 個(gè)月時(shí)達(dá)到最高，第4 個(gè)月兩組實(shí)驗(yàn)兔抗體水平普遍開(kāi)始下降，但第6 個(gè)月抗體仍維持在一定水平，均高于免疫后21 d時(shí)能夠提供攻毒保護(hù)作用的最低抗體水平(表1，OD450nm=0.618 即可提供攻毒保護(hù))，并且 VLP 疫苗免疫兔后產(chǎn)生的抗體水平整體高于市售疫苗(圖5)。表明VLP 疫苗具有較好的免疫原性，且至少能夠?qū)?shí)驗(yàn)兔提供6 個(gè)月的完全保護(hù)。

圖5 VLP 免疫兔后的抗體消長(zhǎng)規(guī)律檢測(cè)結(jié)果Fig.5 The average serum antibody titer at different time post immunized with the VLPs

3 討 論

VLP 不含有核酸，不存在擴(kuò)散強(qiáng)毒的危險(xiǎn)，生物安全性高，其由一種或幾種抗原蛋白的多個(gè)單體組裝而成，可以高密度地呈現(xiàn)類似于天然病毒的抗原表位，因此相對(duì)于其它亞單位疫苗，低劑量的VLP 即可誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T 細(xì)胞和Th 細(xì)胞的產(chǎn)生，高效誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)[10]。因此，VLP已經(jīng)成為一項(xiàng)被廣泛接受的用于人類開(kāi)發(fā)安全、高效疫苗的技術(shù)，還可以用來(lái)作為運(yùn)載工具開(kāi)發(fā)嵌合疫苗和治療性疫苗，Braeden 等通過(guò)在RHDV VP60插入小鼠拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα 和生存素的表位，構(gòu)建了嵌合多價(jià)的VLP，在小鼠的結(jié)直腸癌模型中均表現(xiàn)出了良好的效果[11]。另外，許多應(yīng)用酵母系統(tǒng)表達(dá)的VLP 開(kāi)發(fā)的疫苗，如 HPV-VLP 疫苗已經(jīng)成功上市[12]。

巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是80年代開(kāi)發(fā)的一種異源蛋白真核表達(dá)系統(tǒng)，其具有穩(wěn)定性好、表達(dá)效率高、容易規(guī)?；⒊杀镜土疤腔确g后修飾功能的特點(diǎn)，比桿狀病毒或哺乳動(dòng)物組織培養(yǎng)等真核表達(dá)系統(tǒng)更快捷、廉價(jià)、表達(dá)水平更高[12]。因此本研究選擇畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)密碼子的偏愛(ài)性明顯，對(duì)外源基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化是決定其表達(dá)量的重要因素。對(duì)酵母使用密碼子的統(tǒng)計(jì)分析顯示在61 個(gè)密碼子中有25 個(gè)密碼子是酵母所偏愛(ài)的[13]。本研究根據(jù)該偏好性對(duì)野生型VP60 基因進(jìn)行了密碼子的優(yōu)化，較大的提高了其表達(dá)量。經(jīng)蛋白灰度分析顯示蛋白表達(dá)量可達(dá) 200 μg/mL～250 μg/mL。

在酵母細(xì)胞胞內(nèi)環(huán)境下自主形成的RHDV VLPs大小和形狀均一、穩(wěn)定，配置成疫苗免疫實(shí)驗(yàn)兔后，鑒于傳統(tǒng)的人“ O”型紅細(xì)胞的血凝抑制試驗(yàn)測(cè)RHDV 抗體的方法存在主觀性強(qiáng)、重復(fù)性差和人血紅細(xì)胞獲取不易等缺點(diǎn)[14]，本研究利用針對(duì)VP60蛋白的ELISA 試劑盒代替血凝的方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)兔的血清抗體效價(jià)，結(jié)果顯示RHDV VLP 免疫實(shí)驗(yàn)兔后可以刺激機(jī)體產(chǎn)生至少持續(xù)6 個(gè)月的高水平的抗體，攻毒試驗(yàn)顯示該VLP 疫苗可以保護(hù)實(shí)驗(yàn)兔免受RHDV 的攻擊，保護(hù)率達(dá)到 100 %。結(jié)果表明 VLP具有很好的免疫原性，本研究為開(kāi)發(fā)兔出血癥VLP疫苗提供了新的思路和手段。