劉照琨,關(guān)靖喆,路麗群,于鵬成,劉明旭,吳麗佳,路義鑫

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 動(dòng)物疾病防控技術(shù)與制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱 150030)

旋毛蟲病是一種危害嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病,因生食或食用未煮熟含有感染性包囊的肉類食品而感染,呈全球性分布,危害嚴(yán)重[1]。絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serine protease inhibitor,SPI)是一類對(duì)絲氨酸蛋白酶活性有抑制作用的蛋白質(zhì)超家族。多個(gè)研究表明,寄生蟲SPI不但能夠通過調(diào)節(jié)蛋白酶活性影響蛋白質(zhì)代謝參與凝血、炎癥反應(yīng)等許多生理和病理過程,而且也是生物體免疫系統(tǒng)的重要組成部分[2-4],旋毛蟲SPI能夠抵制宿主的免疫反應(yīng),在蟲體與宿主相互作用中發(fā)揮著重要的作用。

佐劑常用來增強(qiáng)免疫效果,篩選適宜的佐劑尤為重要。為了探討不同佐劑類型對(duì)兩種SPIs(TsAd-SPI和TsKaSPI)的免疫效果的影響,本試驗(yàn)選取鋁佐劑、Montanide ISA206和弗氏佐劑研究了其對(duì)BALB/c小鼠的免疫保護(hù)作用,為進(jìn)一步研究SPIs與宿主的相互作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及重組蛋白 試驗(yàn)用旋毛蟲(Trichinella spiralis)T1分離株(ISS3),由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲教研室用健康的昆明系小鼠持續(xù)傳代保存。6～8周齡雄性BALB/c小鼠,購自遼寧長生生物公司；TsAdSPI和TsKaSPI重組蛋白由本實(shí)驗(yàn)室已成功構(gòu)建的載體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),純化后獲得。

1.2 主要試劑 弗氏佐劑(FCA/FIA)、鋁佐劑(Alum)、IgG1、 IgG2a,均購自 Sigma Aldrich 公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG,購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Montanide ISA 206佐劑,購自 Seppic公司；其他試劑,購自國內(nèi)外生物公司。

1.3 試驗(yàn)分組及免疫程序 將60只6～8周齡雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為6組,每組10只,每種蛋白3組,分別為高劑量組、中劑量組、低劑量組,將純化后的兩種重組蛋白分別用PBS稀釋后,以腹腔注射的方法免疫小鼠。初次免疫加完全弗氏佐劑,加強(qiáng)免疫用不完全弗氏佐劑,每次免疫高、中、低劑量組每只分別接種100、50 μg 和 20 μg,免疫 3 次,間隔2周。根據(jù)小鼠血清抗體的水平,選擇抗體效價(jià)最優(yōu)的50 μg/只免疫劑量進(jìn)行佐劑比較試驗(yàn)。另將160只BALB/c小鼠隨機(jī)分為兩種蛋白的弗氏佐劑組、氫氧化鋁組、Montanide ISA 206組和 PBS對(duì)照組,共8組,每組20只。兩種蛋白的4個(gè)組均以最優(yōu)劑量50 μg/只進(jìn)行免疫,共免疫 3次,間隔 2周。弗氏佐劑組：首次免疫加完全弗氏佐劑,加強(qiáng)免疫用不完全弗氏佐劑,氫氧化鋁組和 Montanide ISA 720組：3次免疫分別用相應(yīng)的佐劑；PBS對(duì)照組：3次每只均注射 PBS 100 μL。

1.4 血清抗體檢測 免疫前及免疫后第1、3、5周對(duì)每組免疫小鼠眼球取血,分離血清。1 μg純化后的兩種重組蛋白用包被液稀釋后,每孔100 μl分別包被96孔ELISA板,4℃ 過夜。洗滌后,將收集的不同劑量及不同佐劑組小鼠免疫前及免疫后第1、3、5周的血清樣本用封閉液1∶200倍稀釋,37℃ 孵育1.5 h。洗滌后,每組分別加入封閉液1∶5 000倍稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG；三免后(第5周)的血清加入封閉液1∶500倍稀釋的 Ig G1和 Ig G2a,37℃ 孵育1 h。洗滌后加底物顯色液,用酶標(biāo)儀于波長450 nm測定吸光度值。

1.5 攻蟲感染 末次免疫后2周,不同佐劑組每只小鼠均經(jīng)口感染500條旋毛蟲肌幼蟲。攻蟲后第1、3、7、10天剖殺小鼠,取出小腸,縱向剖開后剪成2～3 cm片斷,除去小腸內(nèi)容物,放入盛有生理鹽水的平皿內(nèi),置于37℃孵育3～4 h,顯微鏡下計(jì)數(shù)成蟲,計(jì)算減蟲率。

1.6 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用EXCEL,GraphPad Prism 5軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)上處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,同時(shí)采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行f檢驗(yàn)、方差分析與相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 兩種重組蛋白的表達(dá)及純化 將實(shí)驗(yàn)室保存TsAdSPI和TsKaSPI表達(dá)載體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),通過SDS-PAGE檢驗(yàn)誘導(dǎo)結(jié)果,純化后的兩種蛋白TsAdSPI和TsKaSPI,SDS-PAGE檢驗(yàn)?zāi)康臈l帶單一,大小正確,如圖1和圖2所示。

圖1 重組蛋白TsAdSPI純化結(jié)果分析

圖2 重組蛋白TsKaSPI純化結(jié)果分析

2.2 兩種蛋白不同劑量組結(jié)果分析 用20、50、100 μg TsAdSPI和TsKaSPI分別與等體積弗氏佐劑乳化后免疫小鼠,與免疫前(0周)相比均使重組蛋白特異性 IgG水平顯著升高。在二免后,兩種20 μg重組蛋白免疫組 IgG水平均顯著低于50 μg和100 μg 免疫組(P ＜ 0.001),而 50 μg 免疫組與100 μg免疫組 IgG水平無顯著差異(P＞0.05),如圖3和圖4所示。因此,兩種蛋白均選擇50 μg為最優(yōu)免疫劑量。

圖3 不同劑量TsAdSPI免疫小鼠IgG分析

圖4 不同劑量TsKaSPI免疫小鼠IgG分析

2.3 兩種蛋白不同佐劑組結(jié)果分析

2.3.1 特異性抗體IgG檢測 TsAdSPI和TsKaSPI分別與弗氏佐劑(FCA/FIA)、鋁佐劑(Alum)、ISA 206佐劑乳化后免疫小鼠,與對(duì)照組相比均誘導(dǎo)TsAdSPI和TsKaSPI特異性 IgG水平顯著升高(圖5、圖6)。兩種蛋白的鋁佐劑組 IgG水平與弗氏佐劑組無明顯差異。ISA 206免疫組IgG水平二免后明顯低于弗氏佐劑組,但在三免后IgG水平明顯升高,并高于弗氏佐劑組。

圖5 不同佐劑TsAdSPI免疫小鼠IgG分析

圖6 不同佐劑TsKaSPI免疫小鼠IgG分析

不同佐劑免疫組小鼠與對(duì)照組小鼠相比抗TsAdSPI和TsKaSPI特異性 Ig G1及IgG2a的水平均顯著升高(P＜0.001),3種佐劑免疫組之間無明顯差異(圖7、圖8)。兩種重組蛋白分別與3種佐劑乳化后免疫小鼠均可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生混合型Ig G1/Ig G2a(Th1/Th2)反應(yīng),并以 Ig G1(Th2)為主。

圖7 不同佐劑TsAdSPI免疫小鼠IgG亞型分析

圖8 不同佐劑TsKaSPI免疫小鼠IgG亞型分析

2.3.2 成蟲減蟲率 TsAdSPI的鋁佐劑、ISA 206佐劑、弗氏佐劑免疫組小鼠在感染后第1、3、7、10天成蟲減蟲率分別為：41.05%、45.26%、53.15%；19.20%、26.72%、30.11%；17.20%、23.23%、18.68%；29.57%、33.85%、25.98%,3種佐劑免疫原均可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗旋毛蟲成蟲感染相似的免疫力,ISA 206佐劑組稍優(yōu)于其他兩組,如圖9。TsKaSPI的鋁佐劑、ISA 206佐劑、弗氏佐劑免疫組小鼠在第1、3、7、10 天成蟲減蟲率分別為：22.22%、20.14%、17.36%；21.67%、21.33%、25.42%；23.42%、24.83%、19.05%；24.10%、25.47%、22.05%,鋁佐劑及ISA 206佐劑組減蟲率相近,均優(yōu)于弗氏佐劑組,如圖10。

圖9 不同佐劑TsAdSPI免疫小鼠成蟲減蟲率

圖10 不同佐劑TsKaSPI免疫小鼠成蟲減蟲率

3 討論

絲氨酸蛋白酶抑制劑可以通過抑制宿主絲氨酸蛋白酶的活性,使其免受宿主體內(nèi)蛋白酶類降解,從而逃避宿主的防御機(jī)制,有利于寄生蟲在宿主體內(nèi)入侵和存活[8]。由本實(shí)驗(yàn)室重組的TsAdSPI和TsKaSPI具有良好的抗原性,已被證實(shí)是旋毛蟲病診斷候選抗原之一[9-10]。由于機(jī)體的免疫誘導(dǎo)機(jī)制非常復(fù)雜,除了與抗原本身的免疫原性強(qiáng)弱有關(guān)外,多種因素也影響機(jī)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答強(qiáng)度及類型,包括接種途徑、劑量、次數(shù)、免疫間隔時(shí)間以及免疫佐劑的類型等[11]。本研究使用3種劑量(20、50 μg 和 100 μg)的兩種絲氨酸蛋白酶抑制劑TsAdSPI和TsKaSPI分別免疫小鼠,結(jié)果顯示,50 μg蛋白劑量免疫組與100 μg蛋白劑量免疫組均誘導(dǎo)產(chǎn)生類似的抗體水平,且均高于20 μg免疫組,所以,50 μg可作為該抗原免疫的最優(yōu)劑量。

免疫佐劑可以增強(qiáng)免疫應(yīng)答的水平,且不同佐劑產(chǎn)生的免疫應(yīng)答有所不同,所以在免疫應(yīng)答及保護(hù)性研究中需要選擇合適的佐劑制定免疫方案[12]。竇蘭清[13]的研究表明,旋毛蟲成蟲可溶性抗原與弗氏佐劑、白油-司班佐劑、ISA 206佐劑和蜂膠佐劑乳化后免疫,4種佐劑均具有免疫增強(qiáng)作用。李強(qiáng)[1]的研究表明,佐劑 FCA/FIA、IMS1312、ISA720、Quil-A及氫氧化鋁均能不同程度增強(qiáng)rsT87對(duì)小鼠的保護(hù)性免疫力,其中佐劑ISA720、Quil-A和氫氧化鋁的保護(hù)效果更好。本研究比較了鋁佐劑、弗氏佐劑和 Montanide ISA206三種佐劑對(duì)TsAdSPI和TsKaSPI兩種蛋白免疫效果的影響,結(jié)果顯示,3種佐劑均能誘導(dǎo)較高的免疫應(yīng)答及成蟲減蟲率,與上述兩位研究者的結(jié)論相一致。通過對(duì)抗體水平及減蟲率的比較,ISA206和鋁佐劑的保護(hù)效果更好。

旋毛蟲為了成功感染宿主,必須在其寄生過程中調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答以避免其自體毀滅,同時(shí)又不至于對(duì)宿主造成嚴(yán)重?fù)p傷,因此旋毛蟲感染時(shí)同時(shí)具備Th1和Th2型免疫應(yīng)答特征[14]。本研究的IgG亞型結(jié)果顯示,鋁佐劑、弗氏佐劑和 Montanide ISA206各組均誘導(dǎo)產(chǎn)生了Th2為主的 Th1/Th2混合免疫應(yīng)答,與以往研究結(jié)果相一致。結(jié)果表明,佐劑不能從根本上改變免疫應(yīng)答,但可以影響免疫應(yīng)答的強(qiáng)度。選擇合適的佐劑能夠最大限度的幫助抗原發(fā)揮誘導(dǎo)免疫保護(hù)作用。Montanide ISA 206在本試驗(yàn)中展現(xiàn)出了良好的免疫保護(hù)性,與傳統(tǒng)的油乳劑相比更為穩(wěn)定并且黏度低,易于注射,乳化技術(shù)較簡單,易于掌握,可作為旋毛蟲的免疫佐劑。