王 娟 白 莉 趙一錦 鮑海平 米希婷
扁平苔蘚(lichen planus,LP)是一種T細胞介導的慢性炎癥性皮膚病,發(fā)病機制尚未探明,既往研究發(fā)現(xiàn)皮損中角質(zhì)形成細胞存在異常增殖與凋亡現(xiàn)象,血管密度增加[1-3]。環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)是合成前列腺素的關(guān)鍵限速酶,多種應激和前炎性信號可誘導其表達,參與炎癥反應、細胞增殖分化、血管形成和腫瘤浸潤等病理過程。國外學者報道,皮膚扁平苔蘚皮損處COX-2mRNA和COX-2主要產(chǎn)物前列腺素E2(PGE2)的表達水平明顯高于非皮損處,同時皮損和非皮損處的表達均比正常皮膚組織顯著升高,認為COX-2和PGE2通過促進樹突狀細胞遷移、活化和激活Th1、Th17免疫應答系統(tǒng),參與扁平苔蘚的發(fā)病[4],目前國內(nèi)未見相關(guān)報道。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)介導了COX-2表達與前列腺素合成的信號傳導,其家族成員P38絲裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinase,P38MAPK)是調(diào)控COX-2表達的上游激酶。為研究扁平苔蘚皮損中COX-2及其上游調(diào)控分子的表達情況,我們對皮損中COX-2和p-P38MAPK的表達強度進行了檢測,探討其在扁平苔蘚發(fā)病中的可能作用。
1.1 臨床資料 病例組20例,選自2016年1月至2017年12月就診于我院皮膚科的扁平苔蘚患者皮損標本,均經(jīng)臨床和病理確診,包括男12例,女8例,年齡25~68歲,平均(37.94±3.86)歲,病程3~30個月,平均病程(15±4.7)個月。其中慢性局限性11例、線狀4例、泛發(fā)性3例、肥厚性2例。取材自四肢和軀干。同時半年內(nèi)局部或全身未使用過糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑類藥物,無其它皮膚病或系統(tǒng)疾病。對照組20例正常皮膚組織標本,均取自整形外科健康皮膚,男、女各10例,年齡21~66歲,平均(36.48±4.31)歲。兩組在性別、年齡上比較,差異均無統(tǒng)計學意義。
1.2 主要試劑 兔抗人COX-2單克隆抗體、兔抗人p-P38MAPK單克隆抗體(Cell Signaling公司),即用型二步法檢測試劑盒PV-9000(GBI公司),二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑(Sigma公司)。
1.3 免疫組化法 步驟如下:石蠟標本連續(xù)切片至4 μm,脫蠟水化;3% H2O2溶液孵育25 min消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性;枸櫞酸鈉緩沖液抗原熱修復;分別滴加稀釋的一抗:COX-2(1∶200)和p-P38MAPK(1∶250),空白對照采用PBS代替一抗;滴加二抗試劑;然后DAB顯色,蘇木素復染、脫水、封片。
1.4 結(jié)果判定 以胞質(zhì)或胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。每張標本隨機選擇5個高倍視野(×400),采用MIAS-2000圖像分析系統(tǒng)測定染色區(qū)域的積分光密度值(integrated optical density,IOD),取均值為該標本的IOD值,由專人負責測定,測定前背景校正,保持每張標本參數(shù)設置一致。
1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析,組間比較進行t檢驗,指標間相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析,以α=0.05為檢驗水準。
2.1 免疫組化結(jié)果 COX-2陽性染色定位于胞質(zhì),p-P38MAPK定位于胞質(zhì)和(或)胞核。在扁平苔蘚皮損中,COX-2和p-P38MAPK陽性細胞主要分布于表皮基底層和棘層,染色呈棕黃色,部分真皮淋巴細胞也有表達(圖1);在正常皮膚組織中,二者均呈弱陽性或陰性表達(圖2)。兩組間IOD均值比較,差異均有統(tǒng)計學意義(表1)。
2.2 相關(guān)性分析 扁平苔蘚皮損中COX-2與p-P38MAPK的表達呈正相關(guān)(r=0.62,P<0.01)。
圖11a、1b分別為COX-2和p-P38MAPK在扁平苔蘚組織中的表達(免疫組化,×100)圖22a、2b分別為COX-2和p-P38MAPK在正常皮膚組織中的表達(免疫組化,×100)
表1 COX-2和p-P38MAPK在扁平苔蘚和正常皮膚的表達
COX-2是花生四烯酸代謝過程中重要的限速酶,屬于誘生型蛋白酶,生理狀態(tài)下基本不表達,當細胞受到炎癥介質(zhì)、致癌因子或生長因子刺激時表達上調(diào)[5]。研究發(fā)現(xiàn)上皮細胞的增殖離不開COX-2的調(diào)控[6],在皮膚腫瘤、銀屑病和口腔扁平苔蘚皮損中都有COX-2的表達,不僅通過前列腺素等炎性因子參與炎癥反應,而且可上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)的表達,促進血管形成、細胞過度增殖[7-9]。在銀屑病、口腔扁平苔蘚皮損中均發(fā)現(xiàn)COX-2和VEGF的表達呈正相關(guān)[8,9]。筆者運用免疫組化法檢測扁平苔蘚皮損,發(fā)現(xiàn)COX-2的表達水平明顯高于正常皮膚組織,既往我們發(fā)現(xiàn)VEGF在皮損中亦高表達,二者表達位置一致[2,3],提示COX-2和VEGF可能存在正向調(diào)控關(guān)系,共同參與了扁平苔蘚的發(fā)病,推測在炎癥環(huán)境下,COX-2表達增多,通過其催化產(chǎn)物PGE2參與局部炎癥反應、促進角質(zhì)形成細胞增殖分化,同時上調(diào)VEGF表達,促進新生血管形成,加重炎細胞浸潤,為過度增殖的角質(zhì)形成細胞提供營養(yǎng)供給。
MAPK是細胞內(nèi)一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,激活后經(jīng)胞內(nèi)一系列蛋白磷酸化修飾引起酶的級聯(lián)反應,將細胞外刺激信號傳導至細胞及其核內(nèi),調(diào)節(jié)細胞周期運行和炎癥反應,其介導的信號通路是細胞分裂增殖最重要的途徑之一。P38MAPK是MAPK家族的主要成員之一,在靜止細胞內(nèi),以非活化的形式存在于細胞質(zhì)與(或)細胞核,一旦被磷酸化激活,即移位于細胞核,控制多種轉(zhuǎn)錄因子的基因表達。本研究發(fā)現(xiàn)p-P38MAPK在正常皮膚組織的表皮細胞胞質(zhì)和胞核少量表達,而在扁平苔蘚皮損中表現(xiàn)出明顯的親核性,大量表達于胞核,提示其介導的信號通路被激活,發(fā)揮生物學效應。
研究發(fā)現(xiàn)P38MAPK信號系統(tǒng)可通過控制轉(zhuǎn)錄,上調(diào)COX-2的表達,磷酸化的P38MAPK是介導信號傳遞的活性物質(zhì),抑制P38MAPK活化可減輕COX-2介導的炎癥反應[10]。一方面活化的P38MAPK入核后激活NF-κB,后者通過與COX-2啟動子相應位點結(jié)合,啟動COX-2基因的擴增[11];另一方面,P38MAPK尚可通過調(diào)節(jié)活化蛋白-1(activator protein-1,AP-1)促進COX-2基因轉(zhuǎn)錄,抑制NF-κB和AP-1的活性均可拮抗COX-2的表達[12]。筆者發(fā)現(xiàn)在扁平苔蘚中COX-2和p-P38MAPK的表達呈正相關(guān),提示COX-2的表達可能受到上游P38MAPK信號系統(tǒng)的調(diào)控,二者協(xié)同作用,我們推測在扁平苔蘚發(fā)病中,外界刺激信號激活P38MAPK信號系統(tǒng),經(jīng)胞內(nèi)一系列酶聯(lián)反應,將信號傳入核內(nèi),激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1,繼而促進COX-2、cyclinD1等基因的表達,參與皮損中炎癥反應進程和角質(zhì)形成細胞的異常增殖,導致扁平苔蘚病變的產(chǎn)生。但是COX-2的表達受多個信號通路調(diào)控,可能具有組織和細胞特異性,故扁平苔蘚中COX-2的表達調(diào)控機制尚需進一步研究。