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        環(huán)氧合酶-2和磷酸化P38絲裂原活化蛋白激酶在扁平苔蘚皮損中的表達(dá)

        2019-05-21 08:31:18趙一錦鮑海平米希婷
        中國麻風(fēng)皮膚病雜志 2019年4期
        關(guān)鍵詞:扁平苔蘚蛋白激酶免疫組化

        王 娟 白 莉 趙一錦 鮑海平 米希婷

        扁平苔蘚(lichen planus,LP)是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥性皮膚病,發(fā)病機(jī)制尚未探明,既往研究發(fā)現(xiàn)皮損中角質(zhì)形成細(xì)胞存在異常增殖與凋亡現(xiàn)象,血管密度增加[1-3]。環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)是合成前列腺素的關(guān)鍵限速酶,多種應(yīng)激和前炎性信號(hào)可誘導(dǎo)其表達(dá),參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖分化、血管形成和腫瘤浸潤等病理過程。國外學(xué)者報(bào)道,皮膚扁平苔蘚皮損處COX-2mRNA和COX-2主要產(chǎn)物前列腺素E2(PGE2)的表達(dá)水平明顯高于非皮損處,同時(shí)皮損和非皮損處的表達(dá)均比正常皮膚組織顯著升高,認(rèn)為COX-2和PGE2通過促進(jìn)樹突狀細(xì)胞遷移、活化和激活Th1、Th17免疫應(yīng)答系統(tǒng),參與扁平苔蘚的發(fā)病[4],目前國內(nèi)未見相關(guān)報(bào)道。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)介導(dǎo)了COX-2表達(dá)與前列腺素合成的信號(hào)傳導(dǎo),其家族成員P38絲裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinase,P38MAPK)是調(diào)控COX-2表達(dá)的上游激酶。為研究扁平苔蘚皮損中COX-2及其上游調(diào)控分子的表達(dá)情況,我們對(duì)皮損中COX-2和p-P38MAPK的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行了檢測(cè),探討其在扁平苔蘚發(fā)病中的可能作用。

        1 材料與方法

        1.1 臨床資料 病例組20例,選自2016年1月至2017年12月就診于我院皮膚科的扁平苔蘚患者皮損標(biāo)本,均經(jīng)臨床和病理確診,包括男12例,女8例,年齡25~68歲,平均(37.94±3.86)歲,病程3~30個(gè)月,平均病程(15±4.7)個(gè)月。其中慢性局限性11例、線狀4例、泛發(fā)性3例、肥厚性2例。取材自四肢和軀干。同時(shí)半年內(nèi)局部或全身未使用過糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑類藥物,無其它皮膚病或系統(tǒng)疾病。對(duì)照組20例正常皮膚組織標(biāo)本,均取自整形外科健康皮膚,男、女各10例,年齡21~66歲,平均(36.48±4.31)歲。兩組在性別、年齡上比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        1.2 主要試劑 兔抗人COX-2單克隆抗體、兔抗人p-P38MAPK單克隆抗體(Cell Signaling公司),即用型二步法檢測(cè)試劑盒PV-9000(GBI公司),二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑(Sigma公司)。

        1.3 免疫組化法 步驟如下:石蠟標(biāo)本連續(xù)切片至4 μm,脫蠟水化;3% H2O2溶液孵育25 min消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性;枸櫞酸鈉緩沖液抗原熱修復(fù);分別滴加稀釋的一抗:COX-2(1∶200)和p-P38MAPK(1∶250),空白對(duì)照采用PBS代替一抗;滴加二抗試劑;然后DAB顯色,蘇木素復(fù)染、脫水、封片。

        1.4 結(jié)果判定 以胞質(zhì)或胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。每張標(biāo)本隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野(×400),采用MIAS-2000圖像分析系統(tǒng)測(cè)定染色區(qū)域的積分光密度值(integrated optical density,IOD),取均值為該標(biāo)本的IOD值,由專人負(fù)責(zé)測(cè)定,測(cè)定前背景校正,保持每張標(biāo)本參數(shù)設(shè)置一致。

        1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn),指標(biāo)間相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析,以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

        2 結(jié)果

        2.1 免疫組化結(jié)果 COX-2陽性染色定位于胞質(zhì),p-P38MAPK定位于胞質(zhì)和(或)胞核。在扁平苔蘚皮損中,COX-2和p-P38MAPK陽性細(xì)胞主要分布于表皮基底層和棘層,染色呈棕黃色,部分真皮淋巴細(xì)胞也有表達(dá)(圖1);在正常皮膚組織中,二者均呈弱陽性或陰性表達(dá)(圖2)。兩組間IOD均值比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

        2.2 相關(guān)性分析 扁平苔蘚皮損中COX-2與p-P38MAPK的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.62,P<0.01)。

        圖11a、1b分別為COX-2和p-P38MAPK在扁平苔蘚組織中的表達(dá)(免疫組化,×100)圖22a、2b分別為COX-2和p-P38MAPK在正常皮膚組織中的表達(dá)(免疫組化,×100)

        表1 COX-2和p-P38MAPK在扁平苔蘚和正常皮膚的表達(dá)

        3 討論

        COX-2是花生四烯酸代謝過程中重要的限速酶,屬于誘生型蛋白酶,生理狀態(tài)下基本不表達(dá),當(dāng)細(xì)胞受到炎癥介質(zhì)、致癌因子或生長因子刺激時(shí)表達(dá)上調(diào)[5]。研究發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞的增殖離不開COX-2的調(diào)控[6],在皮膚腫瘤、銀屑病和口腔扁平苔蘚皮損中都有COX-2的表達(dá),不僅通過前列腺素等炎性因子參與炎癥反應(yīng),而且可上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)的表達(dá),促進(jìn)血管形成、細(xì)胞過度增殖[7-9]。在銀屑病、口腔扁平苔蘚皮損中均發(fā)現(xiàn)COX-2和VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)[8,9]。筆者運(yùn)用免疫組化法檢測(cè)扁平苔蘚皮損,發(fā)現(xiàn)COX-2的表達(dá)水平明顯高于正常皮膚組織,既往我們發(fā)現(xiàn)VEGF在皮損中亦高表達(dá),二者表達(dá)位置一致[2,3],提示COX-2和VEGF可能存在正向調(diào)控關(guān)系,共同參與了扁平苔蘚的發(fā)病,推測(cè)在炎癥環(huán)境下,COX-2表達(dá)增多,通過其催化產(chǎn)物PGE2參與局部炎癥反應(yīng)、促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖分化,同時(shí)上調(diào)VEGF表達(dá),促進(jìn)新生血管形成,加重炎細(xì)胞浸潤,為過度增殖的角質(zhì)形成細(xì)胞提供營養(yǎng)供給。

        MAPK是細(xì)胞內(nèi)一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,激活后經(jīng)胞內(nèi)一系列蛋白磷酸化修飾引起酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng),將細(xì)胞外刺激信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi),調(diào)節(jié)細(xì)胞周期運(yùn)行和炎癥反應(yīng),其介導(dǎo)的信號(hào)通路是細(xì)胞分裂增殖最重要的途徑之一。P38MAPK是MAPK家族的主要成員之一,在靜止細(xì)胞內(nèi),以非活化的形式存在于細(xì)胞質(zhì)與(或)細(xì)胞核,一旦被磷酸化激活,即移位于細(xì)胞核,控制多種轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)p-P38MAPK在正常皮膚組織的表皮細(xì)胞胞質(zhì)和胞核少量表達(dá),而在扁平苔蘚皮損中表現(xiàn)出明顯的親核性,大量表達(dá)于胞核,提示其介導(dǎo)的信號(hào)通路被激活,發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。

        研究發(fā)現(xiàn)P38MAPK信號(hào)系統(tǒng)可通過控制轉(zhuǎn)錄,上調(diào)COX-2的表達(dá),磷酸化的P38MAPK是介導(dǎo)信號(hào)傳遞的活性物質(zhì),抑制P38MAPK活化可減輕COX-2介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[10]。一方面活化的P38MAPK入核后激活NF-κB,后者通過與COX-2啟動(dòng)子相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合,啟動(dòng)COX-2基因的擴(kuò)增[11];另一方面,P38MAPK尚可通過調(diào)節(jié)活化蛋白-1(activator protein-1,AP-1)促進(jìn)COX-2基因轉(zhuǎn)錄,抑制NF-κB和AP-1的活性均可拮抗COX-2的表達(dá)[12]。筆者發(fā)現(xiàn)在扁平苔蘚中COX-2和p-P38MAPK的表達(dá)呈正相關(guān),提示COX-2的表達(dá)可能受到上游P38MAPK信號(hào)系統(tǒng)的調(diào)控,二者協(xié)同作用,我們推測(cè)在扁平苔蘚發(fā)病中,外界刺激信號(hào)激活P38MAPK信號(hào)系統(tǒng),經(jīng)胞內(nèi)一系列酶聯(lián)反應(yīng),將信號(hào)傳入核內(nèi),激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1,繼而促進(jìn)COX-2、cyclinD1等基因的表達(dá),參與皮損中炎癥反應(yīng)進(jìn)程和角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖,導(dǎo)致扁平苔蘚病變的產(chǎn)生。但是COX-2的表達(dá)受多個(gè)信號(hào)通路調(diào)控,可能具有組織和細(xì)胞特異性,故扁平苔蘚中COX-2的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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