趙春梅，陳柏杰，金榮榮

（哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學院，黑龍江 哈爾濱 150029）

植物葉色突變是自然界中常見的突變形式，光合色素的變化直接影響光合作用，同時對植物其他代謝功能也產(chǎn)生一定影響[1-2]。在作物育種工作中，葉色突變體常常作為直觀的形態(tài)學標記以簡化育種的流程，在生產(chǎn)實踐中具有重要的應用價值[3]。光照強度過強或過弱都不利于葉綠素的合成，特別在植物細胞葉綠素缺少的情況下，對植物的影響更大。強光照射會使處于激發(fā)態(tài)的葉綠素在傳遞能量的過程中增加活性氧的數(shù)量[4]，活性氧是氧化性極強的物質(zhì)，對植物細胞傷害很大；弱光會破壞葉片細胞膜的完整性，導致細胞內(nèi)的電解質(zhì)外滲，同樣會引起細胞內(nèi)過氧化反應[5]。

甜瓜（Cucumis meloL.）是夏日里人們喜愛的消暑水果，甜瓜葉片黃化突變體是由核基因控制的隱性突變，葉片在整個生長期都呈現(xiàn)黃綠色，其對光照強度的反應較野生型更加敏感。本試驗選用甜瓜葉色黃化突變體以及野生型來研究不同光照強度對其生理指標的影響，通過比較分析，選擇適合甜瓜黃化苗生長的光照強度，為今后的育種工作提供一定的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試甜瓜葉色黃化突變體（Y）和野生型（G）為哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學院西甜瓜研究室提供。

1.2 試驗方法

突變體（Y）和野生型（G）種子經(jīng)催芽后，播種于培養(yǎng)缽中，置于溫室培養(yǎng)，選取5片真葉期、長勢一致的甜瓜植株進行遮陰處理，試驗設(shè)置4個處理，每個處理5株，分別為全光照（100%光照強度，Y100、G100）、輕度遮光（90%光照強度，1層白紗網(wǎng)遮陰，Y90、G90）、中度遮光（60%光照強度，1層黑紗網(wǎng)遮陰，Y60、G60）、深度遮光（25%光照強度，2層黑紗網(wǎng)遮陰，Y25、G25）[6]。甜瓜材料于遮陰處理0、7、14、21 d和30 d后進行采樣，所有植株全部采樣，每株采2～3片葉片用于葉綠素含量、可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)及抗氧化酶活性檢測。

1.2.1 葉綠素含量測定

葉綠素含量采用紫外吸收方法測定[7]。將新鮮葉片擦拭干凈，去主脈后稱取0.5 g，每個處理重復3次；然后使用10 mL 95%乙醇溶液勻漿至組織變白，將提取液過濾后定容至25 mL，采用分光光度計在波長665 nm和649 nm下測定吸光度。

1.2.2 抗氧化酶檢測

超氧化物歧化酶（SOD）采用氮藍四唑（NBT）方法，過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性檢測參考李合生等[7]的方法。取甜瓜葉片0.5 g于預冷的研缽中，加入1 mL預冷的磷酸緩沖液在冰浴上研磨成漿，3 000 g離心5 min后，取上清液備用。SOD檢測，提取液中加入SOD顯色液，反應20 min后測定吸光值；POD檢測，提取液煮沸5 min后加入POD反應體系，于37 ℃保溫15 min，然后置于冰浴中，加入2.0 mL 20%三氯乙酸終止反應，470 nm波長測定吸光度；CAT檢測，測定瓶中加入酶液2.5 mL，加入2.5 mL 0.1 mol/L的H2O2，30 ℃保溫10 min，加入10%H2SO4溶液2.5 mL，用0.1 mol/L的KMnO4標準溶液滴定至粉紅色；APX檢測，試管中加入1 mL磷酸緩沖液，0.4 mL抗壞血酸（5 mmol/L），0.1 mL的H2O2，2.4 mL去離子水，加入0.1 mL稀釋的酶液，在290 nm波長下測定吸光度，每30 s計數(shù)1次，記錄180 s。

1.2.3 可溶性糖含量測定

采用苯酚法測定可溶性糖的含量，具體方法參照李合生等[7]的方法。取0.3 g葉片，分別放入3支試管，加入10 mL蒸餾水，塑料膜封口，于沸水中提取30 min，將提取液過濾入25 mL容量瓶定容。取0.5 mL樣品加入1.5 mL蒸餾水，加入苯酚、濃硫酸溶液，顯色后在485 nm波長下測定吸光度。

1.2.4 可溶性蛋白質(zhì)含量測定

采用紫外吸收法，具體方法參照李合生等[7]的方法。稱取0.5 g新鮮葉片，用5 mL磷酸緩沖液勻漿，10 000 r/min離心10 min，取上清液，將上清液用磷酸緩沖液稀釋后，用紫外分光光度計分別在280 nm和260 nm波長下測定吸光度。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光照強度對甜瓜突變體葉綠素含量的影響

由圖1可知，不同的光照強度對突變體葉綠素含量的影響不同，在輕度遮光條件下，葉綠素含量隨著光照時間的增加而增加；在中度遮光和深度遮光下，葉綠素含量隨著光照時間的增加而減少。突變體在輕度遮光條件下葉綠素的含量比全光照要高，并且隨著光照時間的增加尤為明顯。野生型葉綠素含量高于突變體葉綠素含量，葉綠素含量變化趨勢與突變體相似。

2.2 不同光照強度對甜瓜突變體可溶性糖的影響

由圖2可知，在全光照和輕度遮光條件下，突變體和野生型的可溶性糖含量均有所增加，但是突變體可溶性糖含量較野生型低。由于中度以上遮光直接影響光合作用，突變體和野生型的可溶性糖的含量都呈減少趨勢。

圖1 光照強度對甜瓜突變體和野生型幼苗葉綠素含量的影響

圖2 光照強度對甜瓜突變體和野生型幼苗可溶性糖含量的影響

2.3 不同光照強度對甜瓜突變體可溶性蛋白質(zhì)的影響

突變體和野生型可溶性蛋白的含量在中度以上遮光下呈現(xiàn)先下降后平穩(wěn)的趨勢；在全光照和輕度遮光下，兩者的變化趨勢差別較大。全光照條件下，0 d時突變體的可溶性蛋白的含量略低于野生型，隨著時間的增加，突變體的可溶性蛋白含量迅速增加；30 d時，突變體中可溶性蛋白含量是野生型的1.3倍。輕度遮光下，野生型蛋白含量高于突變體，隨著時間的增加一直保持高于突變體的趨勢（圖3）。

2.4 不同光照強度對甜瓜突變體SOD活性的影響

由圖4知，突變體在全光照和輕度遮光下，SOD活性略有上升，然后略有降低，變化不明顯；在深度遮光下，突變體的SOD活性迅速上升，在處理14 d達到最大值，然后快速下降；中度遮光SOD的活性先逐漸上升，在21 d時達到最大活性，然后下降。野生型在中度及深度遮光下，SOD活性分別在7 d和14 d達到最大值。

2.5 不同光照強度對甜瓜突變體POD活性的影響

不同光照條件對突變體和野生型POD活性影響不同。甜瓜突變體在中度以上遮光后POD活性在7 d內(nèi)增幅較大，然后增幅減??；野生型的POD活性則是先上升，然后在14 d后出現(xiàn)緩慢的下降趨勢。全光照和輕度遮光下，突變體和野生型POD活性變化略有波動，但變化都不大（圖5）。

圖3 光照強度對甜瓜突變體和野生型幼苗可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

圖4 光照強度對甜瓜突變體和野生型幼苗SOD活性的影響

2.6 不同光照強度對甜瓜突變體CAT活性的影響

突變體CAT活性在不同的光照強度下的變化比較復雜，在全光照下CAT整體呈上升趨勢；在輕度遮光下，則緩慢的增加。中度遮光和深度遮光下，CAT先增加，然后下降。野生型在中度和深度遮光下CAT活性呈先增加后下降的趨勢，在輕度遮光條件下，CAT的活性略有波動，變化不顯著。

2.7 不同光照強度對甜瓜突變體APX活性的影響

在全光照和輕度遮光下，突變體和野生型的APX變化都不大，但是在中度以上遮光條件下，APX都是先上升，然后下降?？傮w來說，突變體的APX活性都較野生型高。

3 結(jié)論與討論

葉綠素是光合作用中吸收光能的色素分子，強光照通常會抑制植物的葉綠素合成，甚至出現(xiàn)光抑制和光氧化[8]。突變體全光照下葉綠素含量低于輕度遮光時含量，說明強光照破壞了葉綠素的合成或者加速了葉綠素的降解。深度遮光同樣會影響葉綠素的合成，因為葉綠素合成過程中一些酶受光照影響，例如，鎂離子螯合酶受光照后活性增強，葉綠素合成增加[9]。植物在遮光后短時間內(nèi)葉綠素會增加，但長時間遮光會造成葉綠素合成減少[10]。在本試驗中深度遮光下突變和野生型甜瓜葉綠素的含量隨著時間的增加而減少，并且深度遮光對突變體的葉綠素含量破壞作用更大。

圖5 光照強度對甜瓜突變體和野生型幼苗POD活性的影響

圖6 光照強度對甜瓜突變體和野生型幼苗CAT活性的影響

圖7 光照強度對甜瓜突變體和野生型幼苗APX活性的影響

可溶性糖和可溶性蛋白是反應植物生長狀態(tài)的重要生理指標。突變體葉綠素的減少導致捕光能力減弱，全光照能夠破壞光系統(tǒng)Ⅱ結(jié)構(gòu)，導致葉片的光合速率降低；因此，突變體中可溶性糖含量較低。深度遮光導致光系統(tǒng)Ⅱ原初光能轉(zhuǎn)換效率降低，同樣影響突變體的光合速率。甜瓜突變體抗氧化酶的活性高于野生型，推測突變體細胞處于氧化的狀態(tài)。植物在受到氧化脅迫時，通常積累大量的可溶性糖調(diào)節(jié)細胞滲透作用，保護蛋白質(zhì)的穩(wěn)定，但是甜瓜突變體可溶性糖含量增加不顯著，這降低了對蛋白質(zhì)的保護作用，會導致細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解。在低溫、干旱、光脅迫等過程中植物通常增加蛋白質(zhì)表達量來應答脅迫對植物造成的傷害[11]。本試驗中，光照引起的氧化脅迫提高了突變體內(nèi)抗氧化酶及其他可溶性蛋白的含量，這可能是植物響應氧化脅迫所產(chǎn)生的一種積極調(diào)控方式。深度遮光條件下，甜瓜葉綠素和可溶性糖含量減少，蛋白質(zhì)也無法大量積累。

全光照和輕度遮光條件下，甜瓜葉色黃化突變體的SOD、POD、CAT和APX的活性都是高于野生型。高光引起光系統(tǒng)Ⅱ產(chǎn)生大量活性氧分子，因此清除這些有害物質(zhì)的抗氧化酶活性會增強。SOD是第一個清除活性氧分子的重要酶。SOD的活性受光活化，在一定范圍內(nèi)酶活隨光強度的增大而增強[12]。全光照下，光照時間的增加對突變體產(chǎn)生了光脅迫，突變體SOD的活性有一個緩慢的增加過程，并且在7 d達到最大值。伴隨著活性氧分子被清除，SOD的活性又出現(xiàn)降低，而野生型甜瓜由于葉綠素含量比較高使其受光脅迫的程度較低，因此SOD的活性變化不大；突變體對深度遮光引起的的脅迫應答反應比較持久，SOD的活性在14 d和21 d后才開始降低。POD的變化趨勢在突變體和野生型中變化差異較大。在全光照下，POD活性最大值在兩者中出現(xiàn)的時間不同，但反應趨勢相似。在深度遮光下，突變體中POD的活性一直處于增加的狀態(tài)，而野生型中POD的活性雖然有所增加，但是增幅不大，并且趨于平衡狀態(tài)。植物POD除主要參與有毒物質(zhì)活性氧的清除外，還能夠催化葉綠素的分解，造成膜脂過氧化[13]。在深度遮光條件下，突變體中POD活性升高，加速了葉綠素的分解，導致葉綠素含量進一步減少。CAT是催化H2O2分解成水的抗氧化酶。在植物體內(nèi)，活性氧分子經(jīng)過SOD、POD等酶的作用產(chǎn)生H2O2，大量的H2O2積累也會對植物產(chǎn)生毒害作用，因此CAT能夠清除多余的H2O2[14]。在突變體中，CAT的活性比野生型高幾倍，再次證明突變體細胞處于氧化的狀態(tài)。突變體在全光照和輕度遮光條件下，CAT增加表明植物在積極地清除過量的H2O2，而中度和深度遮光后期，CAT的含量在減少說明植物已經(jīng)沒有能力清除過多的H2O2，降低了對植物的保護作用。APX通過抗壞血酸—谷胱甘肽循環(huán)清除細胞內(nèi)的H2O2，轉(zhuǎn)基因植物可以提高光系統(tǒng)Ⅱ的光化學活性和抗氧化活性[15]。在全光照下，突變體和野生型細胞內(nèi)的APX活性變化不大，深度遮光下，APX有小幅的增高，然后下降，這表明光照強度對甜瓜突變體的APX活性影響與野生型相似。

通過對突變體在不同時期、不同的光照強度下的葉綠素和氧化狀態(tài)的變化以及與野生型的對比分析，結(jié)果表明突變體更適合在輕度遮光的條件下生長，一方面有利于葉綠素的積累，另一方面可以減少強光對突變體造成的氧化脅迫。