符芳姿， 許振勝

（?？谑腥嗣襻t(yī)院，海南?？?570208）

骨肉瘤（osteosarcoma）是小兒和青少年惡性程度最高的骨癌之一，具有高轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)[1]。大約40%的本病患者在診斷時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，僅20%的患者能達(dá)到長(zhǎng)期存活[2]。傳統(tǒng)的手術(shù)及化療并未能明顯改善骨肉瘤的總體生存率[3]。因此，迫切需要研發(fā)新的骨肉瘤治療策略，以提高骨肉瘤的治療效果。

槲皮素（C15H10O7）屬于生物活性類(lèi)黃酮，天然存在于日常食品和傳統(tǒng)中藥如連翹、紅八角蓮、紅麻等中。槲皮素具有較高的親脂性，可自由穿過(guò)細(xì)胞膜，觸發(fā)胞內(nèi)某些生化反應(yīng)，干預(yù)細(xì)胞生命活動(dòng)。有研究表明，槲皮素具有抗癌作用[4-6]。對(duì)骨肉瘤細(xì)胞可抑制其增殖、遷移侵襲，促進(jìn)凋亡[4，7]。

本課題組前期運(yùn)用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測(cè)槲皮素對(duì)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞的增殖抑制作用，運(yùn)用流式細(xì)胞法（FCM）檢測(cè)槲皮素對(duì)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示：①細(xì)胞增殖：與空白對(duì)照組（以含DMSO的培養(yǎng)液為溶劑對(duì)照）比較，50、100、150、200、250 μg/mL槲皮素干預(yù)組24、48、72 h均顯著抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞活力（P＜0.05或P＜0.01），且呈時(shí)間、劑量依賴(lài)性。②細(xì)胞凋亡：與空白對(duì)照組比較，150、200、250 μg/mL槲皮素各干預(yù)組顯著促進(jìn)骨肉瘤MG-63細(xì)胞早期凋亡（P＜0.05或P＜0.01），且呈劑量依賴(lài)性；且200 μg/mL槲皮素可顯著促進(jìn)骨肉瘤MG-63細(xì)胞的晚期凋亡和壞死。表明槲皮素可顯著抑制MG-63細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，呈量效關(guān)系[8]。因此，本研究在前期研究基礎(chǔ)上，探討槲皮素對(duì)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞生長(zhǎng)周期及自噬影響，進(jìn)一步為槲皮素治療骨肉瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞來(lái)源與培養(yǎng)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞株來(lái)源于美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。將細(xì)胞置于37℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況及細(xì)胞狀態(tài)。4 d左右細(xì)胞密度達(dá)到大約85%左右后傳代，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2藥物、試劑與儀器槲皮素（中國(guó)藥品生物制品檢定所提供）。單體紅色熒光蛋白（mRFP）—綠色熒光蛋白（GFP）—微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）自噬雙標(biāo)腺病毒，來(lái)源于上海漢恒生物科技有限公司，批號(hào)：AP12121706。胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司）；碘化丙啶（PI，美國(guó)Sigma公司）。超凈工作臺(tái)（美國(guó)Nuaire公司）；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（深圳黑馬公司）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（德國(guó)Heraeus公司）；倒置熒光顯微鏡（日本尼康公司）；Attune?NxT流式細(xì)胞儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）。

1.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)設(shè)4組：空白對(duì)照組，150、200、250 μg/mL槲皮素組。空白對(duì)照組以0.1%DMSO的培養(yǎng)液作為溶劑對(duì)照；150、200、250 μg/mL槲皮素組分別予相應(yīng)質(zhì)量濃度槲皮素處理細(xì)胞24 h。取各組細(xì)胞，以2.5 g/L胰蛋白酶消化細(xì)胞，細(xì)胞貼壁脫落，吹打成單個(gè)細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/mL。1 000 r/min離心棄去上清，加入1 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）吹至細(xì)胞懸浮。過(guò)濾細(xì)胞懸液。重復(fù)2次。后用200 μL結(jié)合緩沖液再次震蕩至細(xì)胞懸浮，加入800 μL體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇預(yù)冷后固定，再次以1 000 r/min離心10 min棄去上清，吹至細(xì)胞懸浮。重懸細(xì)胞至500 μL PBS緩沖液中，避光孵育30 min。加PI至終質(zhì)量濃度為50 μg/mL，室溫避光30 min。上流式細(xì)胞儀分析，計(jì)數(shù)細(xì)胞周期各期的細(xì)胞數(shù)目。

1.4熒光顯微鏡觀察mRFP-GFP-LC3自噬雙標(biāo)腺病毒轉(zhuǎn)染后自噬小體的形成和自噬流的變化[9]實(shí)驗(yàn)設(shè)2組：空白對(duì)照組、槲皮素組?？瞻讓?duì)照組以0.1%DMSO的培養(yǎng)液作為溶劑對(duì)照；槲皮素組給予150、200、250 μg/mL槲皮素處理細(xì)胞24 h。次日鏡下觀察細(xì)胞，匯合率為70%左右可進(jìn)行mRFP-GFP-LC3轉(zhuǎn)染。加入的病毒量感染復(fù)數(shù)（MOI）為 10、30、50、100、300、500 內(nèi)，每個(gè)MOI值設(shè)置2個(gè)復(fù)孔。將原培養(yǎng)液吸干，加入原來(lái)培養(yǎng)液1/2的體積的培養(yǎng)液。根據(jù)公式換算：病毒個(gè)數(shù)=轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞數(shù)（傳代計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)×2）×MOI；病毒體積數(shù)=病毒個(gè)數(shù)/病毒滴度。原裝的腺病毒的病毒滴度是10 PFU/mL，根據(jù)設(shè)置的MOI與換算公式，以完全培養(yǎng)基將腺病毒稀釋到特定濃度，然后加入相應(yīng)的孔中。把含腺病毒的培養(yǎng)基吸干凈，后加入原來(lái)體積量的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后熒光顯微鏡觀察。隨機(jī)選8個(gè)視野（每個(gè)視野0.17 mm2），計(jì)算紅色熒光點(diǎn)（指示自噬溶酶體）和綠色熒光斑點(diǎn)（指示自噬體）的數(shù)量。最后將拍攝好的紅色和綠色熒光圖片，用Photoshop進(jìn)行圖片合成后，再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.5統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 17.0軟件或Prism 5.0（GraphPad）或SAS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法詳見(jiàn)各圖表注釋。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1槲皮素對(duì)MG-63細(xì)胞體外生長(zhǎng)周期的影響表1、圖1結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，槲皮素各干預(yù)組處于G1期的骨肉瘤MG-63細(xì)胞數(shù)顯著增加（P＜0.05或P＜0.01），處于S期的骨肉瘤MG-63細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.05或P＜0.01），此外，250 μg/mL槲皮素干預(yù)組顯著增加G2期骨肉瘤MG-63細(xì)胞數(shù)（P＜0.01）。表明槲皮素可誘導(dǎo)骨肉瘤MG-63細(xì)胞生長(zhǎng)周期停滯在G1期。

2.2槲皮素對(duì)mRFP-GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞自噬流的影響圖2結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，槲皮素干預(yù)組顯著增加融合（Merge）圖的紅色斑點(diǎn)（P＜0.01），顯著減少M(fèi)erge圖的黃色斑點(diǎn)（P＜0.01），這些結(jié)果表明槲皮素誘導(dǎo)自噬小體與溶酶體融合，形成自噬溶酶體的進(jìn)程順暢，即槲皮素顯著上調(diào)骨肉瘤MG-63細(xì)胞自噬水平。

表1 MG-63細(xì)胞周期分布Table 1 The distribution of MG-63 cell cycle（，n=3，p/%）

表1 MG-63細(xì)胞周期分布Table 1 The distribution of MG-63 cell cycle（，n=3，p/%）

注：?jiǎn)我蛩胤讲罘治?；①P＜0.05，②P＜0.01，與空白對(duì)照組比較

G2期細(xì)胞0 0 0 0.19±0.03②分組空白對(duì)照組150 μg/mL槲皮素組200 μg/mL槲皮素組250 μg/mL槲皮素組G1期細(xì)胞63.89±3.25 82.82±8.10①86.41±3.56②91.86±1.72②S期細(xì)胞36.10±3.25 17.17±8.10①13.58±3.56②7.93±1.65②

圖1 細(xì)胞周期流式圖Figure 1 The FCM plot for MG-63 cell cycle

圖2 槲皮素對(duì)mRFP-GFP-LC3轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞自噬流的影響Figure 2 The effect of quercetin on autophagy flux in mRFP-GFP-LC3 plasmid transfected human

3 討論

細(xì)胞周期，指細(xì)胞分裂完成后至下一個(gè)分裂結(jié)束的整個(gè)過(guò)程，一般分為DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）及細(xì)胞分裂期（M期）。本研究結(jié)果顯示，槲皮素顯著增加了停滯在G1期的MG-63細(xì)胞數(shù)量。G1期為DNA合成前期，這期細(xì)胞為不再增殖細(xì)胞，是一些已經(jīng)脫離細(xì)胞周期，永遠(yuǎn)喪失分裂能力，且日趨衰老的死亡細(xì)胞，這類(lèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生高度分化，對(duì)腫瘤增長(zhǎng)沒(méi)有作用，因此該期細(xì)胞所占數(shù)量越多，腫瘤的惡性程度越低。這表明槲皮素能有效抑制MG-63細(xì)胞進(jìn)行DNA合成，使其停滯在細(xì)胞周期的G1期。槲皮素的這一生物學(xué)效應(yīng)類(lèi)似于其作用于胃癌SGC-7901細(xì)胞[10]、人宮頸癌HeLa細(xì)胞[11]、骨肉瘤143B細(xì)胞[12]的效應(yīng)。因此，我們從體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了槲皮素能抑制骨肉瘤的增殖，誘導(dǎo)其停留在細(xì)胞周期的G1期。

自噬是指亞細(xì)胞膜經(jīng)歷一個(gè)動(dòng)態(tài)形態(tài)學(xué)改變（如自噬體形式、與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體），降解細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的過(guò)程。當(dāng)細(xì)胞遇到環(huán)境脅迫如饑餓或病原體感染時(shí)，自噬作為能量的來(lái)源，給細(xì)胞提供氨基酸以維持細(xì)胞存活，對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用。越來(lái)越多的證據(jù)表明，自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。在腫瘤形成的早期階段，自噬活動(dòng)經(jīng)常抑制癌細(xì)胞。一些抗癌藥物在導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡的同時(shí)，也可誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生自噬相關(guān)性細(xì)胞死亡[13]。自噬在骨肉瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)、分化和抗藥方面起了關(guān)鍵作用，已成為目前研究骨肉瘤的熱點(diǎn)[14]。

本課題組在檢測(cè)骨肉瘤MG-63細(xì)胞自噬情況時(shí)，選用了mRFP-GFP-LC3雙熒光標(biāo)記腺病毒轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞模型。與對(duì)照組比較，槲皮素處理組GFP標(biāo)記的藍(lán)色熒光顯著減少，merge圖中黃色斑點(diǎn)熒光幾乎不可見(jiàn)，mRFP標(biāo)記紅色熒光斑點(diǎn)明顯，這表明槲皮素可促進(jìn)MG-63細(xì)胞自噬流進(jìn)程，誘發(fā)細(xì)胞自噬。既往有研究表明，槲皮素對(duì)其他細(xì)胞系（如原代卵巢癌細(xì)胞[15]、原發(fā)性滲出性淋巴瘤細(xì)胞[16]、人食管癌Eca-109細(xì)胞[17]）有促細(xì)胞自噬作用，這支持了我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同樣，這也是第一次運(yùn)用雙標(biāo)腺病毒（mRFP-GFP-LC3）轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞模型來(lái)證明槲皮素具有促骨肉瘤自噬的作用。

然而，有研究發(fā)現(xiàn)，在化療情況下自噬也可作為腫瘤細(xì)胞發(fā)揮自我防御的機(jī)制[12]。結(jié)合前期基礎(chǔ)研究結(jié)果——槲皮素處理骨肉瘤MG-63細(xì)胞可致使其增殖、活性受到抑制，我們考慮槲皮素所誘發(fā)的自噬，更大可能是促進(jìn)MG-63細(xì)胞發(fā)生自噬相關(guān)性細(xì)胞死亡。但其防御作用不能排除，仍需進(jìn)一步體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)加以分析。

綜上所述，槲皮素可抑制人骨肉瘤MG-63細(xì)胞的增殖，使其停滯在細(xì)胞周期G1期，呈劑量依賴(lài)性地促進(jìn)骨肉瘤MG-63細(xì)胞發(fā)生自噬，從而誘發(fā)骨肉瘤細(xì)胞死亡。