黎旭光， 劉開睿， 仇成江， 張生， 余麗， 黃有星

（1.廣東省中醫(yī)院腹部外科，廣東廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405；3.廣東省中醫(yī)院甲狀腺血管外科，廣東廣州 510006）

胰腺癌（pancreatic cancer）是一種預(yù)后極差的惡性腫瘤，總體5年生存率低于5%[1]。目前，手術(shù)和化療是治療胰腺癌的主要手段。由于超過(guò)90%的患者在確診時(shí)已喪失手術(shù)機(jī)會(huì)，以化療為主的綜合治療的重要性日益突出[2]。吉西他濱（Gemcitabine，GEM）作為胰腺癌的一線化療藥物，其延長(zhǎng)的中位生存期僅為5.4～5.6個(gè)月，療效亟待改善[3]。中醫(yī)藥是腫瘤輔助治療的重要手段，經(jīng)多年的臨床實(shí)踐形成了扶正祛邪、益氣養(yǎng)陰、活血祛瘀等治療法則。加味扶正抑瘤湯由黃芪、龜板、全蝎和四君子湯等組成，具有滋陰補(bǔ)氣、活血祛瘀之功。前期研究表明，此方對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用[4-7]，然而關(guān)于其對(duì)胰腺癌細(xì)胞作用的研究尚未見報(bào)道。本研究擬探討加味扶正抑瘤湯對(duì)胰腺癌細(xì)胞Panc-1體內(nèi)和體外腫瘤生物學(xué)行為的影響，并進(jìn)一步分析加味扶正抑瘤湯聯(lián)合一線化療藥物吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞的作用效果，從而明確加味扶正抑瘤湯在胰腺癌治療中的作用，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，采用含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱。

1.2藥物、試劑與儀器加味扶正抑瘤湯組方包括生黃芪30 g、西洋參15 g（另煎）、龜板15 g（先煎）、全蝎10 g、白花蛇舌草30 g、王不留行15 g、白術(shù)10 g、茯苓15 g、生甘草10 g、牡丹皮10 g、槲寄生15 g等，各味中藥材均購(gòu)自中國(guó)康美藥業(yè)；吉西他濱（法國(guó)禮來(lái)公司，批號(hào)：H20161030）。胎牛血清（杭州四季青公司，批號(hào)：11011-8611）；DMEM（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：12100046）；Matrigel基質(zhì)膠（美國(guó)BD公司，批號(hào)：YS000649）；MTT試劑盒（中國(guó)碧云天公司，批號(hào)：C0009）；Annexin V-FITC（美國(guó)Thermo公司，批號(hào)：BMS500FI-100）。Heracell CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；CS-24超聲水浴鍋（中國(guó)朗博公司）；BenchMateC8微量離心機(jī)（美國(guó) Oxfordlab公司）；RPR1204V藥品冷藏箱、MK3酶標(biāo)儀、Attune NxT流式細(xì)胞儀（美國(guó)Thermo公司）。

1.3藥物制備方法

1.3.1 加味扶正抑瘤湯制備 ①用于大鼠：將上述劑量的中藥置煎煮容器內(nèi)，加相當(dāng)于藥材5倍量的冷水浸泡1 h，煮沸30 min，過(guò)濾；藥渣再加3倍量的水，繼續(xù)煎煮20 min，過(guò)濾；合并2次濾液，于水浴鍋上濃縮成96 mL。②用于細(xì)胞：將中藥包按質(zhì)量1∶15進(jìn)行水提，水浴鍋60℃超聲浸泡80 min，共3次。過(guò)濾、合并濾液，得到終質(zhì)量濃度為1 g/mL的濃縮液175 mL用于體外實(shí)驗(yàn)，保存至4℃冰箱備用。使用時(shí)取出部分濃縮液，經(jīng)12 000 r/min、15 min離心后，用0.45 μm濾膜過(guò)濾后調(diào)至pH7.0，在無(wú)菌條件下用0.22 μm濾膜過(guò)濾備用。

1.3.2 吉西他濱溶液配制 稱取200 mg吉西他濱溶于20 μL DMSO溶液，加4.98 mL高糖DMEM完全培養(yǎng)基制成40 g/L的吉西他濱濃縮液，經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾后備用。

1.4體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組與給藥實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組、中藥組、西藥組、聯(lián)合用藥組等4組?？瞻捉M：僅加PBS；中藥組（100 g/L加味扶正抑瘤湯）：1 mL 1 000 g/L加味扶正抑瘤湯濃縮液+9 mL完全培養(yǎng)基；西藥組（20 μmol/mL吉西他濱）：取1 mL吉西他濱濃縮液+6.49 mL完全培養(yǎng)基配制成1 mol/L工作液，再取1 mL工作液+49 mL完全培養(yǎng)基配制；聯(lián)合用藥組（100 g/L加味扶正抑瘤湯濃縮液+20 μmol/mL吉西他濱）：5 mL 1 000 g/L加味扶正抑瘤湯濃縮液+1 mL吉西他濱工作液+44 mL完全培養(yǎng)基。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力取Panc-1細(xì)胞，細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底80%時(shí)，消化細(xì)胞，按1×104個(gè)/孔接種于96孔板培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，按不同處理組別分別加入相應(yīng)含藥培養(yǎng)基。作用24、48、72 h后，每孔分別加入5 g/L MTT溶液20 μL，應(yīng)用酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[D（λ）]。取各復(fù)孔D（570 nm）值的平均值作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.6 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲取20μmol/L Matrigel基質(zhì)膠，加入80 μmol/L 4℃預(yù)冷的無(wú)血清高糖DMEM培養(yǎng)基中，制備成100 μmol/L無(wú)血清Matrigel混合物。均勻加入Transwell小室，于37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的 CO2的培養(yǎng)箱6 h待Matrigel基質(zhì)膠凝固。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Panc-1細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，取1×105個(gè)細(xì)胞，稀釋至200 μmol/L無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中。于24孔板內(nèi)分別加入800 μmol/L不同處理組的含藥培養(yǎng)基，分別放入含Matrigel基質(zhì)膠和不含Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室。將200 μL含1×105個(gè)細(xì)胞的無(wú)血清DMEM細(xì)胞懸液均勻加入小室內(nèi)，隨后將24孔板放入37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2的培養(yǎng)箱。無(wú)基質(zhì)膠的小室孵育24 h（檢測(cè)細(xì)胞遷移能力），含基質(zhì)膠的小室孵育36 h（檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力）。取出小室，PBS沖洗，于40 g/L多聚甲醛溶液中固定細(xì)胞，1%結(jié)晶紫溶液染色，用棉棒將小室內(nèi)層細(xì)胞擦去，自然風(fēng)干后，于光學(xué)顯微鏡下拍照及細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.7 Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行消化、離心、重懸；將細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)并置入恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h；使用不同處理組含藥培養(yǎng)基處理細(xì)胞；放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h；使用無(wú)EDTA胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，1 500 r/min離心10 min去上清；使用2 mL PBS重懸細(xì)胞，再次1 500 r/min離心10 min去上清，重復(fù)本步驟1次后去除PBS；加入400 μL的Binding buffer重懸細(xì)胞，將細(xì)胞分為2管，每管200 mL，其中一管設(shè)為空白對(duì)照，另一管為處理組繼續(xù)加入試劑進(jìn)行處理；處理組加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，再加入5 μL碘化丙啶混勻后室溫下避光孵育15 min；孵育完畢后于1 h內(nèi)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.8體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)

1.8.1 動(dòng)物 40只6周齡健康雄性C57/BL小鼠，體質(zhì)量約0.02 kg，購(gòu)于中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.8.2 分組、造模與給藥 將40只小鼠分為4組，即空白組、中藥組、西藥組、聯(lián)合用藥組，每組10只。每組小鼠均自由飲水、進(jìn)食。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，于小鼠左上肢內(nèi)側(cè)注射1×107個(gè)Panc-1胰腺癌細(xì)胞，建立胰腺癌小鼠動(dòng)物模型。建模后，空白組自由飼養(yǎng)；中藥組給予劑量為400 g/kg的加味扶正抑瘤湯灌胃，每日2次；西藥組給予劑量為0.4 g/kg吉西他濱溶液灌胃，每日2次；聯(lián)合用藥組給予0.4g/kg吉西他濱+400 g/kg加味扶正抑瘤湯灌胃，每日2次。

1.8.3 指標(biāo)觀察 21 d后處死小鼠取瘤體，肉眼觀察不同分組小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況。剝離瘤塊，稱取瘤質(zhì)量，按下式計(jì)算腫瘤抑制率（p）。抑制率（%）=[（空白組平均瘤質(zhì)量-實(shí)驗(yàn)組平均瘤質(zhì)量）/空白組平均瘤質(zhì)量]×100%。用40 g/L多聚甲醛將標(biāo)本固定并拍照。

1.9統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 21.0（IBM）統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，數(shù)據(jù)分析前均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)排除抽樣誤差，多組比較采用方差分析或Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，組間比較采用Bonferroni法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1加味扶正抑瘤湯對(duì)胰腺癌細(xì)胞Panc-1增殖功能的影響圖1結(jié)果顯示：中藥組、西藥組、聯(lián)合用藥組24 hD（570 nm）與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組48、72 hD（570 nm）比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步通過(guò)Bonferroni法進(jìn)行組間差異比較發(fā)現(xiàn)，藥物作用48 h后，聯(lián)合用藥組D（570 nm）明顯低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而中藥組、西藥組D（570 nm）與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示聯(lián)合用藥相對(duì)于單獨(dú)用藥可以更有效抑制胰腺癌細(xì)胞增殖。藥物作用72 h后，與空白組比較，西藥組、聯(lián)合用藥組D（570 nm）明顯降低（P＜0.05），且聯(lián)合用藥組D（570 nm）低于西藥組，而中藥組D（570 nm）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示西藥組對(duì)胰腺癌細(xì)胞的抑制作用不及聯(lián)合用藥組。上述結(jié)果綜合提示，加味扶正抑瘤湯對(duì)胰腺癌Panc-1細(xì)胞增殖無(wú)顯著抑制作用，但可以加強(qiáng)吉西他濱對(duì)胰腺癌Panc-1細(xì)胞增殖的抑制效果。

圖1 各組不同時(shí)間段內(nèi)胰腺癌Panc-1細(xì)胞增殖能力比較Figure 1 Comparison of the proliferation of pancreatic cancer Panc-1 cells in various groups in different time periods()

2.2加味扶正抑瘤湯對(duì)胰腺癌Panc-1細(xì)胞遷移與侵襲的影響遷移結(jié)果顯示：空白組、中藥組、西藥組及聯(lián)合用藥組穿膜細(xì)胞個(gè)數(shù)分別為（166.67±18.358）、（158.56 ± 18.07）、（90.44±16.024）、（47.89±14.33），由方差分析得F=103.088，P＜0.01；進(jìn)一步經(jīng)Bonferroni檢驗(yàn)，與空白組比較，除中藥組，其他2組穿膜細(xì)胞個(gè)數(shù)均降低（P＜0.05），且聯(lián)合用藥組降低更明顯。見圖2。

侵襲結(jié)果顯示：空白組、中藥組、西藥組及聯(lián)合用藥組穿膜細(xì)胞個(gè)數(shù)分別為（108.78±13.055）、（102.67±12.689）、（44.44±12.218）、（17.11±8.978），由方差分析得F=128.456，P＜0.01；進(jìn)一步經(jīng)Bonferroni檢驗(yàn)，與空白組比較，除中藥組，其他2組穿膜細(xì)胞個(gè)數(shù)均降低（P＜0.05），且聯(lián)合用藥組降低更明顯。見圖3。

圖2 各組胰腺癌Panc-1細(xì)胞遷移能力比較Figure 2 Comparison of the migration of pancreatic cancer Panc-1 cells in various groups

圖3 各組胰腺癌Panc-1細(xì)胞侵襲能力比較Figure 3 Comparison of the invasion of pancreatic cancer Panc-1 cells in various groups

上述2項(xiàng)結(jié)果提示，雖然100 g/L的加味扶正抑瘤湯對(duì)胰腺癌Panc-1細(xì)胞的遷移侵襲能力沒(méi)有顯著影響，但可以顯著提高吉西他濱對(duì)胰腺癌Panc-1細(xì)胞遷移侵襲能力的抑制作用。

2.3加味扶正抑瘤湯對(duì)胰腺癌Panc-1細(xì)胞凋亡功能的影響圖4結(jié)果顯示，空白組、中藥組、西藥組及聯(lián)合用藥組晚期凋亡率分別為（2.951±0.996）%、（7.293±2.581）%、（29.366± 4.904）%、（55.100±4.882）%，由Kruskal-Wallis檢驗(yàn)得F=32.522，P＜0.01。進(jìn)一步經(jīng)Bonferroni檢驗(yàn)，與空白組比較，除中藥組外，其他2組細(xì)胞凋亡率均明顯增加（P＜0.05），且聯(lián)合用藥較單獨(dú)化療能更顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。提示加味扶正抑瘤湯可以協(xié)同吉西他濱誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡。

圖4 各組胰腺癌Panc-1細(xì)胞凋亡情況比較Figure 4 Comparison of the apoptosis of pancreatic cancer Panc-1 cells in various groups

2.4加味扶正抑瘤湯對(duì)小鼠體內(nèi)胰腺癌瘤體的影響小鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)情況結(jié)果顯示，中藥組、西藥組及聯(lián)合用藥組體內(nèi)抑瘤率分別為（7.20±3.52）%、（38.90±5.91）%、（61.63±6.46）%，由方差分析得F=226.410，P＜0.01；進(jìn)一步經(jīng)Bonferroni檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)任何2組體內(nèi)抑瘤率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中聯(lián)合用藥組的抑瘤率相對(duì)西藥組平均高22.73%。提示加味扶正抑瘤湯可以協(xié)同吉西他濱抑制胰腺癌細(xì)胞Panc-1在體內(nèi)生長(zhǎng)。見圖5。

3 討論

胰腺癌是惡性度極高的消化系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病率及死亡率近年來(lái)仍有上升趨勢(shì)。由于具有起病隱匿、進(jìn)展迅速、早期轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，胰腺癌手術(shù)可切除率不足10%，5年生存率低于5%，預(yù)后極差，嚴(yán)重影響國(guó)民健康[2]。吉西他濱作為治療胰腺癌的一線化療藥物，能改善患者生存質(zhì)量，但由于胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱存在先天或后天的耐藥性，導(dǎo)致其在改善生存期方面不甚理想，吉西他濱治療后1年生存率仍不足20%[8]。近年來(lái)許多研究發(fā)現(xiàn)采用吉西他濱聯(lián)合中藥提取物或湯劑治療，可以有效逆轉(zhuǎn)胰腺癌對(duì)吉西他濱的耐藥性并提高其治療敏感性，這些研究結(jié)果揭示了胰腺癌中西醫(yī)結(jié)合治療模式的臨床應(yīng)用前景[9，10]。

胰腺癌屬中醫(yī)學(xué)“積聚”、“黃疸”、“腹痛”、“伏梁”等范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其病機(jī)以脾胃虛損、正氣虧虛為本，濕瘀毒內(nèi)蘊(yùn)為標(biāo)，標(biāo)本相互轉(zhuǎn)化，治療首當(dāng)辨別標(biāo)本虛實(shí)，施以清熱利濕、疏肝理氣、益氣健脾等療法[11]。加味扶正抑瘤湯為本院外科治療腫瘤的經(jīng)驗(yàn)方，通過(guò)扶正培本可改善機(jī)體內(nèi)環(huán)境，提高自身抗腫瘤能力，通過(guò)抑瘤散結(jié)消癥可殺滅體內(nèi)惡性腫瘤細(xì)胞。該方由生黃芪、西洋參、龜板、全蝎、白花蛇舌草、王不留行、白術(shù)、茯苓、生甘草、牡丹皮、槲寄生組成。以生黃芪、西洋參補(bǔ)氣為君藥；以龜板、槲寄生滋陰補(bǔ)腎，全蝎、白花蛇舌草攻散瘀毒為臣藥；白術(shù)、茯苓、甘草，取四君子湯之意，益氣健脾；以王不留行、牡丹皮活血祛瘀，生甘草緩急止痛，白花蛇舌草兼解毒利濕為佐藥，生甘草調(diào)和諸藥，兼為使藥。諸藥配伍，具有補(bǔ)氣滋陰、健脾補(bǔ)腎，活血祛瘀解毒的功效，達(dá)到扶正抑瘤的目的。既往研究表明，加味扶正抑瘤湯可以通過(guò)抑制Bcl-2 mRNA及促進(jìn)p53 mRNA表達(dá)起到抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖功能[4]；在肝細(xì)胞癌中，隨著藥物濃度的增加，可以顯著抑制肝癌細(xì)胞增殖遷移侵襲能力[6]；對(duì)晚期前列腺癌還能顯著減少骨轉(zhuǎn)移灶數(shù)目，延長(zhǎng)生存期，提高生活質(zhì)量[5，7]。上述研究表明，加味扶正抑瘤湯可通過(guò)多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。

圖5 各組小鼠體內(nèi)胰腺癌瘤體比較Figure 5 Comparison of the tumor growth in various groups

本研究首先驗(yàn)證加味扶正抑瘤湯對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡及體內(nèi)生長(zhǎng)的影響。盡管文獻(xiàn)報(bào)道加味扶正抑瘤湯可以顯著抑制多種惡性腫瘤進(jìn)展，但是本研究結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)治療劑量的加味扶正抑瘤湯無(wú)論對(duì)胰腺癌細(xì)胞還是小鼠體內(nèi)瘤體均無(wú)顯著抑制效應(yīng)。該結(jié)果一方面從分子機(jī)制角度提示不同組織臟器的惡性腫瘤在發(fā)生發(fā)展中存在差異，另一方面從傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的角度也說(shuō)明胰腺癌的中藥治療不僅僅局限于扶正及抑瘤之法，還需要根據(jù)疾病的不同階段辨證施治，符合中醫(yī)學(xué)“同病異治”的原則。本研究進(jìn)一步檢驗(yàn)聯(lián)合用藥組與單藥應(yīng)用在抑制腫瘤發(fā)展上的區(qū)別，結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥組對(duì)胰腺癌Panc-1細(xì)胞體內(nèi)外生物學(xué)行為的抑制效果顯著強(qiáng)于吉西他濱單藥的效果。雖然該研究未進(jìn)一步揭示背后的分子機(jī)制，但是結(jié)合目前的研究報(bào)道，推測(cè)加味扶正抑瘤湯可能通過(guò)協(xié)同吉西他濱進(jìn)一步放大下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的抑制效果。該現(xiàn)象潛在的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，加味扶正抑瘤湯對(duì)胰腺癌Panc-1細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及凋亡方面無(wú)顯著抑制作用，但是在與吉西他濱聯(lián)用后，可以顯著提高吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞的抑制作用，有望在胰腺癌的治療中扮演增效劑的作用，起到輔助化療的效果。