張延林， 鄭剛， 熊明， 王昊， 易紹龍， 努爾阿依木·莫合塔，依不拉音·庫爾班， 黃虎， 趙鋒利

（1.新疆喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院，新疆喀什 844000；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

膿毒癥是宿主對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)而引起的致命性的多器官功能障礙[1]。多器官功能障礙綜合征（MODS）表現(xiàn)為全身多種器官的正常功能受到嚴(yán)重影響，其中胃腸道一般為最早出現(xiàn)損傷且損傷程度最為嚴(yán)重的靶器官[2]。雖然胃腸道是人體最大的細(xì)菌和內(nèi)毒素的貯存場(chǎng)所，在正常生理狀態(tài)下它們對(duì)機(jī)體幾乎無損害，但在病理情況下，細(xì)菌和內(nèi)毒素通過受損的腸黏膜向其他器官遷移而發(fā)生腸源性膿毒癥（GOS）[3]。

據(jù)臨床調(diào)查顯示，全世界范圍內(nèi)每年約有1百萬例膿毒癥患者，其死亡率高達(dá)25%，膿毒癥已成為威脅人類生命健康的重要疾病[4]。目前除一般治療措施、抗菌治療、控制感染源等治療方法外，還可運(yùn)用中醫(yī)藥進(jìn)行治療[5]。有研究表明調(diào)胃承氣湯可減輕重癥胃腸功能障礙患者的病情危重程度[6]。調(diào)胃承氣湯為《傷寒論》的緩下方，由大黃、炙甘草和芒硝3味藥物組成，具有解熱、解毒、調(diào)節(jié)胃腸道功能等藥理作用[7，8]。本研究擬探討調(diào)胃承氣湯對(duì)腸源性膿毒癥大鼠腸黏膜屏障功能的保護(hù)作用機(jī)制，以期為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物40只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量280～320 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2013-0002；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：44007200047550。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境：廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。設(shè)施使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2010-0059。

1.2受試藥物調(diào)胃承氣湯（由大黃、芒硝、炙甘草3味中藥組成），大黃（批號(hào)：130908261）、芒硝（批號(hào)：130707541）、炙甘草（批號(hào)：130713191）均購自康美藥業(yè)股份有限公司。煎煮方法：以水2 L，煎煮大黃、炙甘草至1 L，去滓，納芒硝，再用微火煮沸1～2次[9]。由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體等效劑量關(guān)系計(jì)算得給藥劑量：高劑量為9.45 g/kg，低劑量為4.73 g/kg[10]。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑大鼠白細(xì)胞介素6（IL-6）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（批號(hào)：385r1229）、大鼠內(nèi) 毒 素/脂 多 糖（LPS）ELISA試 劑 盒（批號(hào)：261180115）、腸型脂肪酸結(jié)合蛋白（iFABP）ELISA試劑盒（批號(hào)：387180115），均購自天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司。Occludin購自美國(guó)Proteintech公司，批號(hào)：66378-1-Ig。注射用烏司他?。║linastatin）購自廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：031609203。

1.4實(shí)驗(yàn)儀器Varioskan Flash型全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；5450型小型高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；Leica TP 1020型全自動(dòng)脫水機(jī)、Leica RM2235輪式切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；YD62型石蠟包埋機(jī)、YD-AB型攤烘烤片機(jī)（浙江金華益迪公司）；DHG-9203型電熱恒溫干燥鼓風(fēng)干燥箱（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；Shandon Gemini染色機(jī)（德國(guó)Thermo公司）；Olympus DP2-BSW型病理圖像采集系統(tǒng)（日本Olympus公司）。

1.5動(dòng)物模型復(fù)制采用盲腸結(jié)扎穿刺法（CLP）復(fù)制腸源性膿毒癥大鼠模型[11]。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食不禁水12 h，使用100 g/L水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠。備皮后沿腹中線開口約2 cm，小心取出盲腸置于消毒紗布上，將糞便推至盲腸尾端。用1號(hào)醫(yī)用真絲編織線于盲腸中段進(jìn)行結(jié)扎，往盲腸尾端注射1 mL生理鹽水稀釋糞便，用10 mL注射器針頭穿孔3次，使用棉簽輕輕擠壓盲腸使糞便能順利流出，然后將盲腸小心放回腹腔。逐層縫合切口，腹腔注入5 mL 37℃生理鹽水使大鼠生理復(fù)蘇。歸籠飼養(yǎng)，自由飲用水和飼料。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：造模后大鼠出現(xiàn)豎毛、乏力少動(dòng)、眼角分泌黏液、顫抖、體溫異常等生理異常，炎癥反應(yīng)失調(diào)[12]。

1.6分組與給藥將大鼠隨機(jī)分為5組，即假手術(shù)組、模型組、烏司他丁組、中藥高劑量組、中藥低劑量組，每組8只。于造模后2、10、24 h按照10 mL/kg分別給予大鼠灌胃給藥，并在最后1次給藥后0.5 h結(jié)束實(shí)驗(yàn)。中藥高、低劑量組大鼠分別給予調(diào)胃承氣湯（劑量分別為9.45、4.73 g/kg）灌胃，假手術(shù)組與模型組給予等體積生理鹽水灌胃。烏司他丁組按3 mL/kg給予大鼠腹腔注射烏司他丁（劑量為30 000 U/kg）。

1.7觀察指標(biāo)與方法

1.7.1 標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，用水合氯醛麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血，3 000 r/min離心10 min，取血清于-80℃凍存，取小腸組織10 cm固定于體積分?jǐn)?shù)10%甲醛中，以備病理組織學(xué)與免疫組化法檢測(cè)。

1.7.2 血清中各相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 嚴(yán)格按照ELISA試劑盒測(cè)試方法檢測(cè)血清中IL-6、LPS和iFABP含量。將捕獲抗體包被至微孔內(nèi)壁表層，添加標(biāo)準(zhǔn)品，添加樣品及生物素標(biāo)記抗體，添加辣根過氧化氫酶標(biāo)記的抗體，加底物顯色終止實(shí)驗(yàn)。酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度（OD）值。

1.7.3 小腸黏膜病理學(xué)檢查 將小腸組織固定于體積分?jǐn)?shù)10%甲醛1～2 d后，切成厚度為2 mm的橫截組織塊，用水沖洗后在自動(dòng)組織處理機(jī)中進(jìn)行脫水、透明和浸蠟。運(yùn)用組織包埋機(jī)進(jìn)行包埋，冷卻后切片4 μm，脫蠟。經(jīng)二甲苯脫蠟后用染色機(jī)進(jìn)行蘇木素—伊紅（HE）染色。封片，鏡下觀察。

1.7.4 occludin蛋白的免疫組化檢查 同小腸黏膜病理學(xué)檢查法制作切片，脫蠟，水化后用PBS沖洗3次，阻斷；PBS沖洗3次，抗原修復(fù)，加入血清封閉，加入Ⅰ抗，PBS沖洗3次；加入Ⅱ抗，PBS沖洗3次，滴加SP，DAB顯色5～10 min，自來水沖洗以終止反應(yīng)，復(fù)染；常規(guī)脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察。

1.8統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），進(jìn)一步兩兩比較組間均數(shù)，方差齊時(shí)用LSD法，方差不齊時(shí)用Dunnett's T3法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1大鼠一般表現(xiàn)CLP造模手術(shù)后，除假手術(shù)組外，給藥前其他各組大鼠均出現(xiàn)精神萎靡、豎毛、眼角分泌黏液等膿毒癥模型癥狀。給藥后烏司他丁組、中藥高劑量組與中藥低劑量組相應(yīng)癥狀減輕。

2.2血清中各相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果表1結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組IL-6、LPS、iFABP水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，烏司他丁組，中藥高、低劑量組IL-6、LPS、iFABP水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

2.3腸源性膿毒癥大鼠小腸黏膜損傷程度光鏡下觀察各組大鼠小腸HE染色病理切片，評(píng)價(jià)小腸組織損傷程度[13]。圖1結(jié)果顯示：假手組大鼠光鏡下小腸黏膜結(jié)構(gòu)基本正常，絨毛結(jié)構(gòu)完整，無炎性組織浸潤(rùn)；模型組可見絨毛壞死，黏膜間隙擴(kuò)大，固有層萎縮，炎性組織浸潤(rùn)嚴(yán)重；烏司他丁組絨毛結(jié)構(gòu)部分被破壞，固有層完整，黏膜間隙較小，炎性組織浸潤(rùn)相對(duì)減少；中藥高、低劑量組絨毛結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，黏膜間隙部分?jǐn)U大，炎性組織浸潤(rùn)相對(duì)減少。

2.4小腸組織緊密連接蛋白o(hù)ccludin的表達(dá)圖2與表2結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠小腸組織occludin蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.01）；與模型組比較，中藥高、低劑量組與烏司他丁組大鼠小腸組織occludin蛋白表達(dá)顯著上升（P＜0.01）。

表1 各組大鼠血清IL-6、LPS、iFABP水平比較Table 1 Comparison of the serum levels of IL-6，LPS，and iFABP in various groups ()

表1 各組大鼠血清IL-6、LPS、iFABP水平比較Table 1 Comparison of the serum levels of IL-6，LPS，and iFABP in various groups ()

①P＜0.01，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型組比較

組別假手術(shù)組模型組烏司他丁組中藥高劑量組中藥低劑量組iFABP[ρ/（pg·mL-1）]611.36±140.59 1447.43±220.49①927.01±194.10③863.14±164.28③940.63±206.32③N8 8 8 8 8 IL-6[ρ/（pg·mL-1）]76.59±12.99 115.34±13.91①90.17±18.79③96.65±19.75②85.05±8.04③LPS[J/（EU·mL-1）]5.25±0.64 8.82±0.74①6.10±0.41③7.51±0.86③5.78±0.97③

圖1 各組大鼠小腸組織光鏡下HE染色病理結(jié)果（×100）Figure 1 Comparison of the pathological features of small intestine tissues in various groups by HE staining under light microscope（×100）

圖2 各組大鼠腸黏膜occludin蛋白表達(dá)比較（免疫組化，×400）Figure 2 Comparison of the expression of occludin in intestinal mucosa of various groups（by immunohistochemistry， ×100）

表2 各組大鼠腸組織緊密連接蛋白o(hù)ccludin表達(dá)量比較Table 2 Comparison of the expression quantity of tight junction protein occludin in small intestine of various groups ()

表2 各組大鼠腸組織緊密連接蛋白o(hù)ccludin表達(dá)量比較Table 2 Comparison of the expression quantity of tight junction protein occludin in small intestine of various groups ()

①P＜0.01，與假手術(shù)組比較；②P＜0.01，與模型組比較

occludin蛋白（p/%）46.65±1.95 22.62±2.89①42.69±2.57②41.48±3.02②44.14±2.62②組別假手術(shù)組模型組烏司他丁組中藥高劑量組中藥低劑量組N8 8 8 8 8

3 討論

腸源性膿毒癥通常是由于一定原因造成腸黏膜屏障的防御機(jī)制被破壞，細(xì)菌和內(nèi)毒素通過受損部位進(jìn)入血液循環(huán)導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）。隨后，機(jī)體免疫反應(yīng)失調(diào)造成各器官功能開始惡化，最終形成多器官功能障礙綜合征（MODS），嚴(yán)重時(shí)會(huì)發(fā)生感染性休克或死亡[14]。其發(fā)病機(jī)制包括腸道微生態(tài)紊亂、腸黏膜屏障受損和機(jī)體免疫功能障礙等[15]。因此，對(duì)受損腸黏膜屏障功能的保護(hù)和改善是治療腸源性膿毒癥的有效途徑之一。

正常生理狀態(tài)下，LPS與腸型脂肪酸結(jié)合蛋白（iFABP）外周血含量微乎其微，檢測(cè)血中LPS和iFABP含量即可反映腸黏膜屏障功能的受損程度[16，17]。IL-6能打破抗炎平衡狀態(tài)并放大炎癥反應(yīng)進(jìn)程和毒性作用，造成腸黏膜等組織細(xì)胞損傷，血中IL-6含量在判斷膿毒癥嚴(yán)重程度時(shí)具有標(biāo)志性的作用[18，19]。在病理狀態(tài)下，緊密連接蛋白產(chǎn)生收縮，細(xì)胞間隙顯著擴(kuò)大，致使細(xì)菌、內(nèi)毒素等有害物質(zhì)擴(kuò)散，腸黏膜屏障功能受到嚴(yán)重破壞[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明調(diào)胃承氣湯能顯著改善膿毒癥大鼠模型血中LPS、iFABP與IL-6含量的異常，具有修復(fù)緊密連接的作用。

臨床中燒傷、手術(shù)或有嚴(yán)重創(chuàng)傷的患者由于容易受到細(xì)菌等有害物質(zhì)感染，引起機(jī)體產(chǎn)生炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)而發(fā)展成為膿毒癥[21]。胃腸道通常最先受到炎性因子攻擊，從而給腸黏膜細(xì)胞帶來嚴(yán)重的殺傷性，破壞緊密鏈接蛋白的黏膜屏障作用，使其屏障功能降低。大量細(xì)菌與LPS通過受損腸黏膜進(jìn)入血液循環(huán)，如此往復(fù)循環(huán)造成嚴(yán)重免疫失調(diào)，最終導(dǎo)致膿毒癥休克甚至死亡等嚴(yán)重后果[2]。本研究結(jié)果提示，調(diào)胃承氣湯能上調(diào)緊密連接蛋白o(hù)ccludin的表達(dá)，修復(fù)腸組織緊密連接蛋白，有效地改善與保護(hù)腸黏膜組織結(jié)構(gòu)，抑制細(xì)菌和LPS的進(jìn)一步擴(kuò)散，從中間環(huán)節(jié)阻止了炎癥反應(yīng)的放大，進(jìn)而減少了IL-6等炎性因子對(duì)各器官功能的損傷。因此，調(diào)胃承氣湯對(duì)腸源性膿毒癥大鼠腸黏膜屏障功能具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與上調(diào)occludin蛋白的表達(dá)有關(guān)。