馮林，石慶勝，陸中華，馬美蘭，厲永強，姜娟萍，陳衛(wèi)良*，毛碧增*

(1.浙江大學 農(nóng)業(yè)與生物技術學院，浙江 杭州 310058； 2.浙江省農(nóng)技推廣中心，浙江 杭州 310058；3.東陽市農(nóng)業(yè)科學研究所，浙江 東陽 322100)

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中庫和流的重要樞紐，作為土壤物質(zhì)轉(zhuǎn)化和能量流動的主要推動者，可合成、分解有機質(zhì)，并積極參與氮、磷、鉀和碳等養(yǎng)分循環(huán)，在一定程度上反映土壤的肥力狀況，從而對地表植被的生長產(chǎn)生影響[1-3]。土壤微生物以正反饋或負反饋的形式作用于地上植物群落，而土壤理化性質(zhì)、地形和季節(jié)等條件與土壤微生物的數(shù)量和分布密切相關，保持土壤微生物的多樣性對提高土壤質(zhì)量、促進作物生長發(fā)育及保護農(nóng)田生態(tài)環(huán)境具有重要意義[4]。外界因素(如不同作物輪作換茬、輪作年限)對土壤微生物和理化性質(zhì)的影響十分明顯，是當前研究的熱點問題之一。

不同作物不同區(qū)系會形成不同的土壤微生物群落，通過換茬種植可有效豐富根際微生物種群，改良土壤環(huán)境[5]。目前，水稻-油菜輪作、水稻-小麥輪作、玉米-大豆輪作換茬等模式研究廣泛，然而與中藥材換茬種植研究對土壤微生物和理化性質(zhì)的影響還較少。元胡(Corydalisyanhusuo)是浙江省道地藥材“浙八味”之一，具有活血、行氣、止痛之功效[6]。在元胡主產(chǎn)區(qū)浙江省東陽市農(nóng)業(yè)科學研究所試驗基地研究元胡種植對水稻冬閑田土壤微生物數(shù)量、生物量和土壤理化性質(zhì)的影響，完善水稻與中藥材換茬種植的科學模式。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗地位于浙江省東陽市農(nóng)業(yè)科學研究所的試驗基地(28°59′～29°30′N、120°05′～120° 44′E)，屬亞熱帶季風氣候區(qū)，多年平均年降雨量1 351 mm，年日照2 002 h，年平均氣溫17 ℃，土壤為水稻土。

1.2 處理設計

水稻收割后，翻耕整地，設12壟，每壟田長6 m，寬5 m。對照1(CK1)為水稻收獲田塊翻耕后的土樣(2017年10月24日收集)；處理(YH)為隨機選取其中9壟后茬種植元胡的土樣(2018年5月2日收集)；對照2(CK2)為水稻收獲田塊翻耕后茬空閑的土樣(2018年5月2日取的土樣)。采用“S”形取樣法，在壟中定5點采集0～20 cm的土層土壤，用滅菌鑷子去除植物根系、石礫等雜物，將土樣收集于無菌封口袋中，密封置于冰袋上帶回實驗室，測定土壤微生物數(shù)量、土壤微生物種類、土壤微生物生物量和理化性質(zhì)。

1.3 測定方法

1.3.1 微生物分離與計數(shù)

土壤細菌用LB培養(yǎng)基、真菌用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，采用傳統(tǒng)的微生物平板計數(shù)法分離與測定微生物數(shù)量[7]。

1.3.2 微生物鑒定

細菌鑒定。采用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA；采用通用引物519F(CAGCMGCCGCGGTAATWC)和907R(CCGTCAA TTCMTTTRAGTTT)擴增16S rDNA基因的 V4-V5區(qū)；PCR擴增體系為50 mL，包括25 mL的 Master Mix酶，各2 mL的正反向引物，1 mL DNA 模板，20 mL ddH2O；擴增條件為95 ℃預變性3 min，95 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸 60 s，35個循環(huán)，最后72 ℃擴增7 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物；擴增產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術有限公司測序，采用Blast比對序列確定菌屬。

真菌鑒定。采用UNIQ-10柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA；采用通用ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)和ITS6(GAAGGT GAAGTCGTAACAAGG)擴增真菌18SrRNA基因；PCR擴增體系為25 mL，包括13 mL Master Mix酶，正反向引物各1 mL，1 mL DNA模板，9 mL ddH2O；擴增條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)，最后72 ℃擴增10 min。采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術有限公司測序，采用Blast比對序列確定菌屬。

1.3.3 土壤理化性質(zhì)測定

土壤全氮含量測定參照標準NY/T 53-1987，全磷含量測定參照標準NY/T 88-1988，全鉀測定參照標準NY/T 87-1988。土壤有機碳采用重鉻酸鉀外加熱法測定；堿解氮測定采用堿解擴散法；有效磷測定采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法；速效鉀測定采用火焰光度計法。土壤微生物量碳氮采用氯仿熏蒸法，用K2Cr2O7氧化法測碳、靛酚藍比色法測氮[8]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016軟件整理試驗數(shù)據(jù)，SPSS 20.0 進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤微生物數(shù)量

分別對水稻收獲田塊翻耕后的土樣(CK1)、水稻收獲田塊翻耕后茬空閑的土樣(CK2)和水稻收獲田塊翻耕后茬種植元胡的土樣(YH)進行微生物分離研究。

由表1可見，與CK1相比，CK2和YH細菌數(shù)量分別降低64.6%和76.9%，降低差異顯著；CK2和YH放線菌數(shù)量分別提高518.4%和812.2%，提高差異顯著；與CK2相比，YH細菌數(shù)量降低35.1%，放線菌數(shù)量提高47.66%，差異不顯著。

表1 種植元胡對土壤微生物數(shù)量的影響

注：同列數(shù)據(jù)后無相同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。表2～3同。

2.2 土壤微生物種類

從CK1中分離得到14株細菌和18株真菌，經(jīng)分子生物學鑒定，14株細菌分別為芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、沙雷氏菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、葡萄球菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬等6個屬；18株真菌分別為青霉菌屬、木霉菌屬、鐮刀菌屬、踝節(jié)菌屬、栓菌屬、曲霉菌屬、毛霉菌屬等7個屬。從CK2中分離得到16株細菌和11株真菌，經(jīng)分子生物學鑒定，16株細菌分別為芽孢桿菌屬、地桿菌屬、鞘氨醇桿菌屬等3個屬；11株真菌分別為青霉菌屬、踝節(jié)菌屬、木霉菌屬、梭孢殼屬等4個屬。從YH中分離得到25株細菌和18株真菌，經(jīng)分子生物學鑒定，25株細菌分別為芽孢桿菌屬、梭形桿菌屬、金黃桿菌屬、鏈霉菌屬等4個屬，18株真菌分別為青霉菌屬、木霉菌屬、踝節(jié)菌屬、赤霉菌屬、毛霉菌屬等5個屬。部分菌株形態(tài)見圖1。

圖1 部分菌落的形態(tài)

2.3 土壤基本理化性質(zhì)

元胡種植以后，對土壤全氮、全磷、全鉀、堿解氮、速效磷、速效鉀等土壤基本理化性質(zhì)的影響見表2，對土壤微生物碳氮的影響見表3。

表2 種植元胡對土壤氮、磷、鉀的影響

土壤是各種有機、無機和礦物元素的混合體，土壤中碳、氮、磷和鉀含量代表著土壤的肥力水平[9]。如表2可知，與CK1相比，CK2土壤全氮、全磷、速效鉀、有機碳和有機質(zhì)含量降低，其中全氮、有機碳和有機質(zhì)含量降低達到顯著性水平，全鉀、堿解氮和速效磷含量升高，其中速效磷含量升高達到顯著性水平；YH土壤全氮、全磷、堿解氮、速效鉀、有機碳和有機質(zhì)含量降低，其中全氮、速效鉀和有機碳含量降低達到顯著性水平；全鉀和速效磷含量升高，其中速效磷含量升高達到顯著性水平。與CK2相比，YH土壤全氮、全磷、全鉀、堿解氮、速效磷和速效鉀含量降低，有機碳和有機質(zhì)含量升高，但上述指標均未達到顯著性差異。由此可見，種植元胡對水稻冬閑田土壤的氮磷鉀含量水平影響較小。

表3 種植元胡對土壤微生物碳氮的影響

土壤微生物量是一個動態(tài)變化的過程，能間接反映土壤微生物數(shù)量的多少。土壤微生物碳和土壤微生物氮分別只占耕作層土壤總有機碳和全氮含量的3%和5%左右[10-11]。土壤微生物量碳與土壤總有機碳的比值稱為微生物熵，可作為土壤碳動態(tài)和土壤質(zhì)量研究的有效指標[12]。CK2土壤微生物量碳、微生物量氮和微生物熵最高，YH次之。與CK1相比，CK2和YH土壤微生物量碳、微生物量氮和微生物熵顯著提高達到顯著性水平，其中YH土壤微生物量碳、微生物量氮和微生物熵分別提高68.2%、57.7%、206.5%。與CK2相比，YH土壤微生物量碳、微生物量氮和微生物熵有所降低，但差異不顯著。土壤微生物碳氮比的變化表明，微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，一般情況下細菌SMBC/SMBN在5∶1左右，放線菌在6∶1左右，真菌在10∶1左右[13]。試驗發(fā)現(xiàn)，CK2和YH土壤微生物碳氮比接近9∶1，表明該田塊以真菌為主，細菌和放線菌也占有一定的比例。

2.4 元胡收益

元胡667 m2產(chǎn)量118 kg，市場價格43元·kg-1，667 m2效益5 074元，種植元胡能科學利用水稻冬閑田土地資源，增加農(nóng)民收入。水稻+元胡是一種高效的新型農(nóng)業(yè)耕作制度，對土地資源充分利用及農(nóng)民增益、鄉(xiāng)村振興具有重要意義。

3 小結(jié)與討論

不同栽培模式下作物殘體和根系分泌物在土壤中的積累不同，導致碳氮源數(shù)量和種類發(fā)生變化，根系分泌物能直接影響微生物的種類和數(shù)量[14-15]。研究表明，西蘭花和早稻輪作后，土壤細菌、真菌和放線菌的數(shù)量均有變化。本研究結(jié)果顯示，種植元胡后可減少土壤細菌數(shù)量，增加放線菌數(shù)量，這與張立成等[16]報道的稻-稻-油菜輪作顯著增加細菌數(shù)量有差異，與田福發(fā)等[17]報道的菇-菜輪作顯著增加放線菌數(shù)量的結(jié)論基本一致。試驗地在種植元胡后微生物種類有變化，細菌以芽孢桿菌屬居多，真菌以青霉菌屬和木霉菌屬占優(yōu)勢，這可能和常年良好的翻耕措施，及時清除病原菌越冬的雜草和病殘體有關。宋騰蛟等[18]報道元胡土壤細菌功能基因組成在道地和非道地產(chǎn)區(qū)間差異較大，功能基因組成與元胡生長密切相關，本試驗在種植元胡后的土樣中也分離到了芽孢桿菌屬、梭形桿菌屬、金黃桿菌屬和放線菌屬，各個屬細菌對元胡道地性的相關性還將進行更加深入的研究。檢測發(fā)現(xiàn)，冬閑田和種植元胡后的田塊未檢測到葡萄球菌屬、假單胞菌屬、鐮刀菌屬等致病菌，說明冬閑田種植元胡不會加劇葡萄球菌、假單胞菌屬、鐮刀菌的積累；種植元胡后發(fā)現(xiàn)土壤有益真菌屬種類增多，可能和元胡根系分泌物有關。

速效養(yǎng)分對外界環(huán)境因素(如輪作模式等)的干擾響應較為敏感，可作為預警土壤質(zhì)量變化的敏感指標[19]。CK1、CK2和YH土壤全氮含量最高，全鉀含量次之，全磷含量最低，3種處理差異不顯著。YH土壤速效鉀含量最高，堿解氮含量次之，速效磷含量最低，且與CK1相比，CK2和YH土壤速效磷含量增加達到顯著性水平，表明元胡生長需要的磷肥大于氮鉀肥，在生產(chǎn)中應注意增施磷肥，這與卜容燕等[20]認為在兼顧“重旱輕水”的策略下應充分考慮前茬作物水稻磷肥后效的基礎上優(yōu)化磷肥的推薦一致。與CK1相比，CK2和YH土壤堿解氮和速效鉀含量降低，這可能是由于土壤細菌屬如芽孢桿菌屬、產(chǎn)檢桿菌屬和梭形桿菌屬等固氮菌屬數(shù)量下降所致。

土壤微生物量是反映土壤變化的敏感性指標，微生物參與土壤中有機質(zhì)和氮素的轉(zhuǎn)化，輪作換茬有利于土壤微生物量的累積[21]。李曉婷等[22]研究表明，燕麥-苜蓿-馬鈴薯輪作模式下，土壤微生物量碳和微生物量氮顯著高于3種作物連作。張帆等[23]研究表明，水稻-黑麥草輪作明顯提高了土壤微生物量碳和微生物熵，水稻-紫云英輪作明顯提高了土壤微生物量氮。本試驗中，與CK1相比，YH土壤微生物量碳、微生物量氮和微生物熵分別提高68.2%、57.7%和206.5%，這可能是因為種植元胡后增加了根系分泌物多樣性，豐富了土壤中碳源、氮源的轉(zhuǎn)化途徑。與CK2相比，YH土壤微生物量碳、微生物量氮和微生物熵略有降低，差異不顯著，這可能是因為種植元胡影響了土壤pH，使元胡藥理活性成分(如揮發(fā)油[24])對微生物生長繁殖造成一定影響所致。