米智華,高 巨

(揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 江蘇省蘇北人民醫(yī)院 麻醉科,江蘇 揚(yáng)州,225001)

抑郁癥又稱抑郁障礙(DD),是臨床上常見的情感性精神障礙(AD),主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能損害和軀體癥狀，以心境低落、思維遲緩、意志活動減退為主要特征[1]。電休克治療(ECT)是目前公認(rèn)的治療重度抑郁癥(MDD)最為有效的治療手段，具有效率高、起效快等特點(diǎn)，但ECT治療可導(dǎo)致患者學(xué)習(xí)記憶功能損害[2-3]。針刺是中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的瑰寶，在緩解抑郁癥狀方面具有獨(dú)特的功效。動物實(shí)驗(yàn)[4]證實(shí)，電針在減輕腦損傷、改善學(xué)習(xí)記憶功能等方面，具有顯著的效果。電針預(yù)處理可激活腦缺血再灌注損傷模型小鼠的AMPK信號通路，減輕海馬神經(jīng)元凋亡。在POCD大鼠模型中，電針預(yù)處理也可通過上調(diào)海馬腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信號通路，改善大鼠術(shù)后認(rèn)知功能障礙[5]。迄今為止，未見將電針應(yīng)用于抑郁電休克治療的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬通過電針預(yù)處理，觀察其對抑郁模型大鼠電休克治療后學(xué)習(xí)記憶能力的影響，并探討AMPK信號通路的作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性SD大鼠，體質(zhì)量為180～220 g,購于揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。飼養(yǎng)環(huán)境:飼養(yǎng)環(huán)境要保持安靜，室溫(25.00±2.00)℃,濕度(55.00±10.00)%,大鼠可自由攝食飲水，養(yǎng)成固定的晝夜節(jié)律(12 h/12 h)。本實(shí)驗(yàn)通過揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理審核。實(shí)驗(yàn)開始前，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

采用Open-field評分法將水平運(yùn)動次數(shù)加垂直運(yùn)動次數(shù)低于40次或大于100次的大鼠剔除，選擇相近的75只大鼠，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組(Ⅰ組)、模型組(Ⅱ組)、電休克組(Ⅲ組)、電針+電休克組(Ⅳ組)、Sham+電休克組(Ⅴ組)，每組15只。

1.3 模型建立

正常對照組每籠5只正常飼養(yǎng)，不做其他實(shí)驗(yàn)干預(yù)。其余4組參照《神經(jīng)生物學(xué)實(shí)用實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[6]介紹的方法，選擇其中7種刺激模式造模，包括禁水禁食(24 h)、冰水游泳(4 ℃,5 min)、傾斜鼠籠(45°)、晝夜顛倒(24 h)、潮濕墊料(24 h)、夾尾(1 min)、水平震蕩(5 min),每天隨機(jī)安排1種刺激方式，每種刺激在實(shí)驗(yàn)全程中使用3次。連續(xù)干預(yù)21 d。

1.4 干預(yù)措施

1.4.1 麻醉方法:采用腹腔注射異丙酚(北京費(fèi)森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司，國藥準(zhǔn)字J20160089)100 mg/kg進(jìn)行麻醉，給藥2 min后大鼠出現(xiàn)翻正反應(yīng)消失，即達(dá)到麻醉效果。

1.4.2 電針預(yù)處理:麻醉成功后，將大鼠四肢固定在實(shí)驗(yàn)操作臺上，采用15.00 mm×0.26 mm針灸針針刺穴位。參照《常用動物腧穴圖譜》[7]進(jìn)行取穴。選取百會穴、印堂穴(見圖1)。百會穴向前沿皮刺入2 mm,印堂穴針尖向下沿皮刺2 mm,接華佗牌SDZ-Ⅱ型電針儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)。調(diào)節(jié)刺激參數(shù):疏密波，頻率2 Hz/10 Hz,電流強(qiáng)度1 mA,大鼠胡須輕微抖動視為電針刺激有效的標(biāo)志，持續(xù)30 min。Ⅰ～Ⅲ組不進(jìn)行電針干預(yù)。Ⅳ組在ECT治療前30 min,先行電針刺百會穴、印堂穴，疏密波，強(qiáng)度1 mA,頻率2 Hz/15 Hz。Ⅴ組在ECT治療前30 min,先進(jìn)行非穴位(百會穴、印堂穴旁開5 mm)電針刺激，操作方法及參數(shù)設(shè)置同Ⅳ組。

(a.側(cè)面觀;b.正面觀)

圖1 大鼠穴位示意圖

1.4.3 電休克治療:電針干預(yù)結(jié)束后，按組別進(jìn)行電休克。Ⅱ組僅進(jìn)行麻醉，不行ECT治療;Ⅲ～Ⅴ組進(jìn)行ECT治療。采用改良電休克治療儀(Niviqure公司，印度)進(jìn)行電刺激。大鼠雙耳連接電極，調(diào)整治療參數(shù)為雙向矩形波，電量120 mC,頻率125 Hz,放電時(shí)間1 s,波幅0.8 A,波寬1.5 ms,電阻500～1 500 Ω。按下放電按鈕，大鼠出現(xiàn)強(qiáng)直-陣攣-肌肉松弛表現(xiàn),1次/d,連續(xù)6 d。

1.5 評價(jià)指標(biāo)

1.5.1 Morris水迷宮:Morris水迷宮由1個(gè)圓柱形水池(直徑1.2 m,高0.5 m)和圖像采集分析系統(tǒng)組成。實(shí)驗(yàn)過程中，保持水溫22～24 ℃,水深0.3 m。將水池平均劃分為A、B、C、D共4個(gè)象限，每個(gè)象限的中點(diǎn)作為入水點(diǎn)。在D象限的中央放置圓柱形透明平臺(直徑10.0 cm,高29.0 cm)。在水迷宮的上方安置攝像系統(tǒng)，實(shí)時(shí)記錄大鼠的運(yùn)動軌跡。在訓(xùn)練期間，保持迷宮內(nèi)外環(huán)境恒定不變[8]。適應(yīng)性飼養(yǎng)大鼠7 d后，開始實(shí)驗(yàn)(作為實(shí)驗(yàn)第1天)。分別于實(shí)驗(yàn)的第1天(造模前第6天)、第28天(造模成功后第1天)和第40天(ECT結(jié)束后第1天)進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。

定位航行實(shí)驗(yàn)主要用于評估大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。每天在相同的時(shí)間段進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每次實(shí)驗(yàn)的第1～4天進(jìn)行大鼠游泳訓(xùn)練，第5天記錄其定位航行時(shí)間。訓(xùn)練開始時(shí)，將平臺置于D象限。訓(xùn)練前將大鼠先放在平臺上適應(yīng)30 s,再將大鼠從池壁任意一個(gè)起始點(diǎn)面向池壁放入。攝像系統(tǒng)追蹤記錄大鼠尋找平臺的時(shí)間(即逃避潛伏期)和游泳路徑，拍攝并連接路徑追蹤系統(tǒng)進(jìn)行采集。每次游泳時(shí)限為100 s,在100 s內(nèi)未找到平臺者系統(tǒng)自動停止記錄(逃避潛伏期記為100 s)。將大鼠引導(dǎo)至平臺上，休息30 s后進(jìn)行下一次試驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)第5天(造模前第2天)、第32天(造模成功后第5天)、第44天(ECT治療結(jié)束后第5天)，將大鼠從每一象限連續(xù)2次放入水池，記錄其尋找平臺的平均時(shí)間作為其逃避潛伏期，并記錄其游泳路徑[9]。

空間探索實(shí)驗(yàn)主要用于觀察大鼠的空間記憶能力。在實(shí)驗(yàn)的第6天(造模前1天)、第33天(ECT治療前1天)、第45天(ECT治療結(jié)束后第6天)，撤除原平臺，將大鼠從任意1個(gè)象限的入水點(diǎn)面向水池壁放入水池中(所有大鼠均從同一位置入水)。記錄100 s內(nèi)大鼠穿越原平臺區(qū)域的次數(shù)[10]。

1.5.2 AMPK與磷酸化AMPK(p-AMPK)表達(dá)的測定:于實(shí)驗(yàn)第6天(造模前1 d)、實(shí)驗(yàn)第33天(造模成功后6 d)和實(shí)驗(yàn)第45天(ECT治療后6 d),水迷宮測試結(jié)束后即刻，從各組隨機(jī)選取5只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉，迅速斷頭并置于冰面上，分離大腦左右半球皮質(zhì)，剝離器暴露并取出海馬組織，置于-80 ℃冰箱保存。采用Western blot法測定海馬AMPK及p-AMPK的表達(dá)。在海馬組織中加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑PMSF(碧云天生物試劑研究所)進(jìn)行冰上裂解2 h,超聲裂解、低溫離心取上清液,95 ℃變性5 min,-20 ℃冰箱凍存。檢測p-AMPK指標(biāo)的組織裂解時(shí)，另需加入磷酸酶抑制劑(碧云天生物技術(shù)研究所)。采用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF膜(Millipore公司，美國)，加小鼠抗大鼠GAPDH內(nèi)參抗體(稀釋度1∶500)、AMPK一抗(稀釋度1∶500)、p-AMPK一抗(稀釋度1∶300)(Thermo公司，美國)置于搖床上室溫孵育2 h,磷酸鹽緩沖溶液(PBST)充分漂洗后加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(稀釋度1∶6 000,北京中杉金橋科技公司)，搖床室溫孵育1 h,膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育后顯影照相。采用Quantity one圖像分析軟件(Bio-Rad公司，美國)檢測AMPK和p-AMPK的灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值反映目的蛋白的表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，服從正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間及組內(nèi)比較采用單因素方差分析(One-ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

與Ⅰ組比較,Ⅱ～Ⅴ組第32天時(shí)以及Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅴ組第44天時(shí)逃避潛伏期和游泳路徑明顯延長;與第5天時(shí)比較,Ⅱ～Ⅴ組第32天時(shí)以及Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅴ組第44天時(shí)逃避潛伏期和游泳路徑明顯延長;與Ⅲ組比較，Ⅳ組第44天時(shí)逃避潛伏期和游泳路徑明顯縮短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1、2。

表1 各組大鼠逃避潛伏期比較 s

Ⅰ組:正常對照組;Ⅱ組:模型組;Ⅲ組:電休克組;
Ⅳ組:電針+電休克組;Ⅴ組:Sham+電休克組。
與Ⅰ組比較,*P<0.05;與實(shí)驗(yàn)第5天比較,#P<0.05;
與Ⅲ組比較,△P<0.05。

表2 各組大鼠游泳路徑比較 cm

Ⅰ組:正常對照組;Ⅱ組:模型組;Ⅲ組:電休克組;
Ⅳ組:電針+電休克組;Ⅴ組:Sham+電休克組。
與Ⅰ組比較,*P<0.05;與實(shí)驗(yàn)第5天比較,#P<0.05;
與Ⅲ組比較,△P<0.05。

2.2 各組空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

與Ⅰ組比較,Ⅱ～Ⅴ組第32天時(shí)及Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅴ組第44天時(shí)穿越平臺次數(shù)明顯減少;與第5天時(shí)比較,Ⅱ～Ⅴ組第32天時(shí)及Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅴ組第44天時(shí)穿越平臺次數(shù)明顯減少;與Ⅲ組比較,Ⅳ組第44天時(shí)穿越平臺次數(shù)明顯增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠穿越平臺次數(shù)比較 次

Ⅰ組:正常對照組;Ⅱ組:模型組;Ⅲ組:電休克組;
Ⅳ組:電針+電休克組;Ⅴ組:Sham+電休克組。
與Ⅰ組比較,*P<0.05;與實(shí)驗(yàn)第5天比較,#P<0.05;
與Ⅲ組比較,△P<0.05。

2.3 各組海馬AMPK和p-AMPK表達(dá)比較

與Ⅰ組比較,Ⅱ～Ⅴ組第32天時(shí)及Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅴ組第44天時(shí)AMPK、p-AMPK表達(dá)水平明顯下調(diào);與第5天時(shí)比較,Ⅱ～Ⅴ組第32天時(shí)及Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅴ組第44天時(shí)AMPK、p-AMPK表達(dá)明顯下調(diào);與Ⅲ組比較,Ⅳ組第44天時(shí)AMPK、p-AMPK表達(dá)明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表4。

表4 各組大鼠海馬AMPK、p-AMPK表達(dá)水平比較

Ⅰ組:正常對照組;Ⅱ組:模型組;Ⅲ組:電休克組;Ⅳ組:電針+電休克組;Ⅴ組:Sham+電休克組。
AMPK:腺苷酸活化蛋白激酶;p-AMPK:磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶。
與Ⅰ組比較,*P<0.05;與實(shí)驗(yàn)第5天比較,#P<0.05;與Ⅲ組比較,△P<0.05。

3 討 論

近年來，全球抑郁癥患者的人數(shù)正在持續(xù)增長，即將成為威脅人類生命健康的第二大疾病[11]。重度抑郁癥患者甚至有自殺傾向，給家庭和社會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，抑郁癥的防治及其機(jī)制研究已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域高度關(guān)注的熱點(diǎn)問題。

在抑郁癥的動物實(shí)驗(yàn)中，有多種造模方法，包括使用藥物(利血平)、急性應(yīng)激、強(qiáng)迫游泳等。但是，大多存在模型特征性不穩(wěn)定、造模成功率低等弊端。慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激(CUMS)可較好地模擬臨床中抑郁癥的發(fā)病過程，誘導(dǎo)類似的神經(jīng)生物學(xué)改變[12],具有模型穩(wěn)定、實(shí)施方便等特點(diǎn)，已逐步成為抑郁癥造模的經(jīng)典方法。本實(shí)驗(yàn)中，作者采用CUMS刺激21 d后，各組大鼠均出現(xiàn)明顯的抑郁樣癥狀，證明造模成功。

電休克治療技術(shù)最早由意大利神經(jīng)精神病學(xué)家Ugo cerletti和Lucino Bini在1938年發(fā)明創(chuàng)造。與傳統(tǒng)的抗抑郁藥物相比，電休克可以更有效、更迅速地發(fā)揮其作用，而且通常只經(jīng)過幾次治療就能獲得明顯的臨床改善[13]。但是，治療后可導(dǎo)致嚴(yán)重的認(rèn)知功能受損，其具體機(jī)制不明。Fraser等[14]推測可能與電刺激導(dǎo)致物理損傷以及麻醉藥物導(dǎo)致的腦細(xì)胞缺氧、代謝及遞質(zhì)紊亂有關(guān)。

百會穴為督脈經(jīng)穴，位于巔頂部，其深處為腦之所在，具有振奮諸陽、激發(fā)經(jīng)氣、醒腦開竅、益氣調(diào)神的功效，為治腦病要穴;印堂穴屬經(jīng)外奇穴，位于前額，兩眉頭的中間，具有通竅蘇厥、寧心安神、鎮(zhèn)驚止眩之效，其為臨床調(diào)神的主穴，能調(diào)節(jié)髓海機(jī)能，益智醒腦，發(fā)揮抗癡呆的效用[15]。針灸作為中國的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)方法，具有無毒、無副作用等特點(diǎn)，在腦功能保護(hù)方面更具獨(dú)特的效果。李斐斐等[16]研究發(fā)現(xiàn)，電針百會、大椎等穴位可提高小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元突觸蛋白的表達(dá)，改善突觸的超微結(jié)構(gòu)，從而有效改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

AMPK是一種蛋白激酶，由1個(gè)催化亞基(α亞基)和2個(gè)調(diào)節(jié)亞基(β亞基、γ亞基)組成的異三聚體[17]。最初從肝臟中分離出來，但3種亞基均可在人體和哺乳動物的多種組織中表達(dá)，包括肺、腎、心臟、骨骼肌和大腦[18]。AMPK在大多數(shù)哺乳動物組織和細(xì)胞類型中都有表達(dá)，包括在大腦神經(jīng)元中，它被認(rèn)為在控制能量平衡方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[19]。AMPK可通過調(diào)節(jié)下游多種信號通路激活導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙，具有重要的腦保護(hù)效應(yīng)[20]。

在本實(shí)驗(yàn)中，電休克治療后各組大鼠的抑郁癥狀均得到了明顯的改善，說明電休克在緩解抑郁癥狀方面具有顯著效果。但是，治療后各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降，說明電休克在治療抑郁癥的同時(shí)可導(dǎo)致腦功能受損。電針預(yù)處理后，大鼠的逃避潛伏期和游泳路徑明顯短于電休克組，穿越平臺次數(shù)明顯增加，且海馬AMPK和p-AMPK的表達(dá)明顯上調(diào)，說明電針刺百會穴、印堂穴可以改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，可能與AMPK信號通路上調(diào)有關(guān)。在電休克治療中，進(jìn)行電針預(yù)處理具有重要的腦功能保護(hù)效應(yīng)。

綜上所述，電針預(yù)處理不但可以提高電休克治療的效果，還可以減輕術(shù)后學(xué)習(xí)記憶能力的損害，其機(jī)制可能與上調(diào)AMPK信號通路有關(guān)。