王禹程 馬海樂 楊 雪 黃姍芬 黃 暢 李云亮*

（1 江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 江蘇鎮(zhèn)江212013 2 國家農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)裝備研發(fā)分中心 江蘇鎮(zhèn)江212013）

大豆粕是大豆提取油料后的副產(chǎn)品[1-2]，其蛋白含量豐富，高達(dá)30%～50%，其氨基酸組成合理、平衡，各種必需氨基酸的含量均較高，尤其是賴氨酸、色氨酸和蘇氨酸[3-4]。近年來，我國每年壓榨豆油所用大豆約4 000 萬t，由此產(chǎn)生了大量的豆粕，這些豆粕除少部分用于發(fā)酵醬油，生產(chǎn)濃縮蛋白和分離蛋白，大部分用于制作動物飼料，然而這些利用方式，許多潛在的活性物質(zhì)未被有效利用，造成優(yōu)質(zhì)蛋白資源的浪費(fèi)[5]。有研究表明，微生物發(fā)酵法制備的大豆粕發(fā)酵物具有很多生物學(xué)功效，例如抗氧化[6-9]，降血壓[10-11]，增強(qiáng)免疫力[12-14]，提高機(jī)體生長性能[15]，調(diào)節(jié)腸道功能及保證腸道組織結(jié)構(gòu)正常[16-17]等，用該方法制備大豆粕發(fā)酵物是對大豆粕有效利用的一種方式。目前有研究表明一些植物經(jīng)微生物發(fā)酵后能有效改善睡眠[18-19]，而大豆粕發(fā)酵物改善睡眠方面的研究還鮮見報道。

天麻為蘭科多年寄生植物，其干燥塊根是我國貴重中藥，主產(chǎn)于云南、四川、陜西及貴州等地。早在2 000年前《神農(nóng)本草經(jīng)》就記載了天麻的功效，天麻具有平肝息風(fēng)止痙之功效[20-21]。隨著研究的深入，天麻的鎮(zhèn)靜、促眠作用被大量試驗(yàn)證實(shí)[22-23]，其能夠影響大鼠丘腦、腦干、皮層等腦結(jié)構(gòu)，釋放多巴胺和去甲腎上腺素，天麻素能使正常成人腦電圖中的α 波出現(xiàn)睡眠波形。目前豆粕發(fā)酵物與天麻的混合物在改善睡眠功效方面的研究尚為空白。

本文研究了豆粕發(fā)酵物及其與天麻的混合物對改善小鼠睡眠功效的影響，為大豆粕高值化利用開辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試劑

材料：大豆粕（粉碎過60 目篩），中儲糧鎮(zhèn)江糧油有限公司提供；天麻（粉碎過60 目篩），亳州市勝元堂中藥材有限公司；巴比妥鈉、 戊巴比妥鈉，中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

TK-600A 手提萬能打粉機(jī)，長沙市通康機(jī)電有限公司；IS-RDD3 搖床，上海?，斣囼?yàn)設(shè)備有限公司；SW-CJ-2FD 超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 發(fā)酵菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）10160，江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院保藏。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 大豆粕枯草芽孢桿菌發(fā)酵物的制備 大豆粕發(fā)酵物的制備參考羅娟的方法[24]，并略作修改。

豆粕發(fā)酵培養(yǎng)條件：20%豆粕，2%玉米黃粉，1% KH2PO4，10%枯草芽孢桿菌菌種接種量（V/V），培養(yǎng)溫度35 ℃，發(fā)酵3 d。將發(fā)酵后的豆粕發(fā)酵物通過熱風(fēng)干燥，再粉碎過60 目篩得豆粕發(fā)酵物粉末，干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 改善睡眠動物試驗(yàn) 試驗(yàn)選用400 只健康雄性ICR 小鼠，體重為20 g±2 g，由江蘇大學(xué)動物飼養(yǎng)中心提供，許可證編號：SCXK （蘇）2013-0011，動物試驗(yàn)室許可證編號：SYXK （蘇）2013-0036。

試驗(yàn)小鼠隨機(jī)選取80 只分4 組，每組20 只用于急性毒性試驗(yàn)，其余320 只隨機(jī)分成4 批，每批分4 組，第1 組為對照組（control），第2 組為豆粕發(fā)酵物組 （soybean meal fermented product，SMFP），第3 組為天麻組（gastrodiae），第4 組為混合組（mixture，豆粕發(fā)酵物粉末與天麻粉末按質(zhì)量比1∶1 配制），每組20 只，第2 組、第3 組和第4組分別以2.5 g/kg BW·d 劑量灌胃豆粕發(fā)酵物、天麻和豆粕發(fā)酵物-天麻混合物溶液，對照組灌胃等體積蒸餾水。320 只小鼠連續(xù)灌胃14 d 后開展直接睡眠試驗(yàn)、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗(yàn)、巴比妥鈉睡眠潛伏期試驗(yàn)和延長戊巴比妥鈉睡眠時間試驗(yàn)。試驗(yàn)在25 ℃±2 ℃安靜環(huán)境下進(jìn)行。

1.4.3 急性毒性試驗(yàn) 最大耐受劑量法：80 只小鼠隨機(jī)均分成4 組，其中3 組以睡眠試驗(yàn)10 倍劑量即25 g/kg BW（平均分3 次灌，每次間隔6 h 以上）分別灌胃豆粕發(fā)酵物、 天麻粉末和豆粕發(fā)酵物-天麻混合物，1 組灌胃等劑量蒸餾水作為對照。連續(xù)觀察7 d，觀察80 只小鼠中毒癥狀及死亡情況。

1.4.4 直接睡眠試驗(yàn) 3 組小鼠以2.5 g/kg BW劑量分別一次性灌胃的豆粕發(fā)酵物、天麻、豆粕發(fā)酵物-天麻混合物，對照組給予等體積蒸餾水，觀察動物是否出現(xiàn)睡眠現(xiàn)象。睡眠以翻正反射消失為指標(biāo)。當(dāng)小鼠置于背臥位時，會立即翻正身位，如超過60 s 不能翻正者，即認(rèn)為翻正反射消失，進(jìn)入睡眠。翻正反射恢復(fù)即為動物覺醒，翻正反射消失至恢復(fù)這段時間為動物睡眠時間，記錄1 h 內(nèi)4個組中入睡動物數(shù)及睡眠時間，觀察各受試物是否有直接誘導(dǎo)睡眠作用。

1.4.5 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗(yàn) 各組小鼠末次灌胃各組受試物30 min 后，按預(yù)試驗(yàn)確定的戊巴比妥鈉最大閾下催眠劑量30 mg/kg·BW（80%～90%小鼠翻正反射不消失的劑量）對兩組小鼠腹腔注射，記錄30 min 內(nèi)入睡動物數(shù)量（翻正反射消失達(dá)1 min 以上者）。

1.4.6 巴比妥鈉睡眠潛伏期試驗(yàn) 各組小鼠末次灌胃各組受試物30 min 后，按250 mg/kg·BW 劑量腹腔注射巴比妥鈉，從注射開始到翻正反射消失所用時間為睡眠潛伏期，記錄各組小鼠睡眠潛伏期。

1.4.7 延長戊巴比妥鈉睡眠時間試驗(yàn) 各組小鼠末次灌胃各組受試物30 min 后，按50 mg/kg BW腹腔注射戊巴比妥鈉，以翻正反射消失和翻正反射恢復(fù)為指標(biāo)，兩者之間這段時間為睡眠時間。

1.4.8 小鼠臟器指數(shù) 小鼠臟器指數(shù)計算公式如式（1）：

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

試驗(yàn)結(jié)果以SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s 表示，采用One Way-ANOVA 檢驗(yàn)，差異顯著水平為P<0.05，差異極顯著水平為P<0.01。直接睡眠試驗(yàn)和戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗(yàn)以入睡動物為計數(shù)資料，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異顯著水平為P<0.05，差異極顯著水平為P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性試驗(yàn)

80 只小鼠均按睡眠試驗(yàn)10 倍劑量即25 g/kg·BW 灌胃各組受試物，平均分3 次灌胃，每次間隔6 h 以上，連續(xù)觀察7 d。80 只小鼠沒有死亡，均能自由活動，沒有任何中毒癥狀出現(xiàn)。說明所用豆粕發(fā)酵物、天麻粉末、豆粕發(fā)酵物-天麻混合物按總劑量25 g/kg·BW 灌胃對小鼠沒有毒性，小鼠對這3 種受試物最大耐受劑量均大于25 g/kg·BW。

2.2 直接睡眠試驗(yàn)結(jié)果

各組直接睡眠試驗(yàn)睡眠動物數(shù)見表1，結(jié)果表明1 h 內(nèi)4 個組小鼠均沒有睡眠，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，3組間沒有顯著性差異（P＞0.05）。說明豆粕發(fā)酵物、天麻粉末及兩者混合物對小鼠都沒有直接催眠作用，符合《保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范實(shí)施手冊》[25]中改善睡眠保健食品的要求，可進(jìn)行接下來的戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗(yàn)、 巴比妥鈉睡眠潛伏期試驗(yàn)和延長戊巴比妥鈉睡眠時間試驗(yàn)。

表1 直接睡眠試驗(yàn)睡眠動物數(shù)Table 1 Slept number of mice in directly sleeping test

2.3 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗(yàn)結(jié)果

戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗(yàn)30 min 內(nèi)睡眠動物數(shù)見表2，結(jié)果經(jīng)χ2檢驗(yàn)，其他3 組與對照組之間均有顯著性差異（P＜0.01）。表明豆粕發(fā)酵物、 天麻粉末及兩者混合物均具有顯著提高小鼠睡眠率的作用。以豆粕發(fā)酵物-天麻混合物提高小鼠睡眠率的效果最優(yōu)，高于豆粕發(fā)酵物組和天麻組，說明豆粕發(fā)酵物與天麻混合物有協(xié)同提高小鼠睡眠率的作用。

表2 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗(yàn)30 min 內(nèi)睡眠動物數(shù)Tabel 2 Slept number of mice in 30 min in subthreshold dose of pentobarbital sodium hypnotic experiments

2.4 巴比妥鈉睡眠潛伏期試驗(yàn)結(jié)果

對豆粕發(fā)酵物、 天麻粉末以及兩者混合物進(jìn)行巴比妥鈉睡眠潛伏期試驗(yàn)，研究3 種受試物協(xié)同巴比妥鈉對小鼠入睡時間的影響。結(jié)果如圖1，對照組、豆粕發(fā)酵物組、天麻組和混合組的小鼠睡眠潛伏期時間分別為358 s ± 86 s、322 s ± 77 s、268 s±63 s 和225 s±51 s，經(jīng)One Way-ANOVA檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)豆粕發(fā)酵物組相比于對照組沒有顯著性差異（P＞0.05）；但天麻組和混合組所用入睡時間相比于對照組和豆粕發(fā)酵物組均有顯著性差異（P＜0.05），且混合組所用入睡時間顯著低于天麻組（P＜0.05），這說明豆粕發(fā)酵物并沒有縮短小鼠入睡時間的作用，但是天麻粉末以及豆粕發(fā)酵物與天麻的混合物卻表現(xiàn)出顯著縮短小鼠入睡時間的功效，其中以豆粕發(fā)酵物-天麻混合物縮短小鼠睡眠潛伏期的效果最好，說明豆粕發(fā)酵物與天麻具有協(xié)同縮短小鼠睡眠潛伏期的功效。

2.5 延長戊巴比妥鈉睡眠時間試驗(yàn)結(jié)果

對豆粕發(fā)酵物、 天麻粉末以及兩者混合物進(jìn)行延長戊巴比妥鈉睡眠時間試驗(yàn)，研究3 種受試物協(xié)同戊巴比妥鈉對延長小鼠睡眠時間的影響。結(jié)果如圖2所示，對照組、豆粕發(fā)酵物組、天麻組和混合組小鼠睡眠時間分別為1 642 s ± 203 s、2837 s±263 s、1842 s±241 s 和3419 s±218 s，經(jīng)One Way-ANOVA 檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)天麻組與對照組相比沒有顯著性差異（P＞0.05），豆粕發(fā)酵物組與對照組相比有顯著差異（P＜0.05），混合物組與對照組相比有極顯著差異（P＜0.01）。而混合組小鼠睡眠時間與豆粕發(fā)酵物組相比也有顯著增加（P＜0.05），與天麻組相比極顯著增加（P＜0.01）。說明天麻粉末沒有明顯延長小鼠睡眠時間的作用，而豆粕發(fā)酵物及其與天麻的混合物有顯著延長小鼠睡眠時間的功效。其中以豆粕發(fā)酵物-天麻混合物的延長效果最優(yōu)，說明豆粕發(fā)酵物有與天麻顯著協(xié)同延長小鼠睡眠時間的功效。

2.6 受試物對小鼠體重的影響

小鼠體重在一定程度上能反映小鼠的生長狀況。自灌胃開始到灌胃14 d 結(jié)束，每3 天記錄一次各組小鼠體重，繪制成小鼠體重變化趨勢圖見圖3。經(jīng)One Way-ANOVA 檢驗(yàn)，4 組小鼠體重始終沒有顯著性差異（P＞0.05）。說明按2.5 g/kg BWod 劑量灌胃豆粕發(fā)酵物、天麻粉末以及兩者混合物對小鼠生長狀況沒有明顯的影響。

2.7 受試物對小鼠臟器指數(shù)的影響

臟器指數(shù)在一定程度上能反映小鼠的生理健康狀況。試驗(yàn)結(jié)束后，解剖各組小鼠，分別取出肝臟、脾臟、腎臟、胃，并稱重記錄，根據(jù)1.4.9 節(jié)中式（1）計算臟器指數(shù)。小鼠臟器指數(shù)結(jié)果如圖4，4 種臟器分別經(jīng)One Way-ANOVA 檢驗(yàn)，4 組小鼠4種臟器間均沒有顯著性差異（P＞0.05）。說明按2.5 g/kg·BW·d 劑量灌胃豆粕發(fā)酵物、 天麻粉末以及兩者混合物對小鼠肝臟、脾臟、腎臟、胃4 種臟器健康狀況均沒有明顯的影響。

圖1 巴比妥鈉睡眠潛伏期試驗(yàn)Fig.1 Barbital sodium sleep latency experiment

圖2 延長戊巴比妥鈉睡眠時間試驗(yàn)Fig.2 Prolonged pentobarbital sodium sleep time experiment

圖3 小鼠體重變化趨勢Fig.3 Changing trend of mice’s body weight

3 結(jié)論與討論

圖4 小鼠臟器指數(shù)Fig.4 Mice’s organ index

本文通過直接睡眠試驗(yàn)、 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗(yàn)、 巴比妥鈉睡眠潛伏期試驗(yàn)和延長戊巴比妥鈉睡眠時間試驗(yàn)，研究豆粕發(fā)酵物以及豆粕發(fā)酵延長戊巴比妥鈉睡眠時間試驗(yàn)，研究豆粕發(fā)酵物、 天麻粉末以及兩者混合物對改善小鼠睡眠功效的影響。結(jié)果表明直接灌胃2.5 g/kg BW·d劑量的豆粕發(fā)酵物、 天麻粉末以及兩者混合物均沒有直接催眠小鼠的作用（P＞0.05），灌胃14 d 后，以上3 種受試物均能協(xié)同閾下劑量戊巴比妥鈉增加小鼠入睡率（P＜0.05），但單一灌胃天麻并沒有協(xié)同戊巴比妥鈉延長小鼠睡眠時間（P＜0.05）的作用，這與齊麗娟等[26]的研究結(jié)果一致。而在協(xié)同巴比妥鈉縮短小鼠睡眠潛伏期的作用方面，單一的豆粕發(fā)酵物并沒有明顯效果。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范實(shí)施手冊》[25]，受試物在戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗(yàn)、 巴比妥鈉睡眠潛伏期試驗(yàn)和延長戊巴比妥鈉睡眠時間試驗(yàn)3 項(xiàng)試驗(yàn)中兩項(xiàng)有顯著效果，則說明豆粕發(fā)酵物、天麻以及豆粕發(fā)酵物-天麻混合物均具有改善睡眠的功效，其中豆粕發(fā)酵物與天麻的混合物改善睡眠的效果最為顯著，優(yōu)于豆粕發(fā)酵物和天麻單獨(dú)作用時的效果。以上結(jié)果說明豆粕發(fā)酵物具有改善小鼠睡眠功效，并與天麻具有協(xié)同作用?！侗静菅芰x》中有記載“天麻須別藥相佐使，然后見其功?！惫沤襻t(yī)家單獨(dú)使用天麻很少見，重在配伍使用方顯殊功[27]。本文使用豆粕發(fā)酵物與天麻混合使用在改善睡眠上具有協(xié)同效果，與古醫(yī)書用藥經(jīng)驗(yàn)相一致，豆粕發(fā)酵物-天麻混合物的效果確實(shí)比兩種配方單獨(dú)使用效果更優(yōu)。

經(jīng)過統(tǒng)計4 組小鼠體重和臟器指數(shù)發(fā)現(xiàn)，均沒有顯著差異，說明以2.5 g/kg BW·d 劑量給小鼠灌胃豆粕發(fā)酵物、天麻以及豆粕發(fā)酵物-天麻混合物沒有毒性作用，對小鼠整體和臟器的生長健康狀況沒有明顯影響。

目前研究缺少豆粕枯草芽孢桿菌發(fā)酵物的毒性相關(guān)研究，不清楚其毒理效應(yīng)，另一方面是早有研究表明天麻如果使用過量，具有毒性[22]。因此在改善睡眠試驗(yàn)之前先對豆粕發(fā)酵物、 天麻以及豆粕發(fā)酵物-天麻混合物這3 種受試物進(jìn)行最大耐受劑量毒理學(xué)試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，3 種受試物的最大耐受劑量均大于25 g/kg BW。

豆粕發(fā)酵物改善睡眠的研究較少，本文初步研究了豆粕發(fā)酵物、天麻以及豆粕發(fā)酵物-天麻混合物在協(xié)同戊巴比妥鈉、 巴比妥鈉改善睡眠方面的具體效果，為豆粕發(fā)酵物在改善睡眠方面的深入研究及大豆粕的高值化利用打下了基礎(chǔ)。在本文中只研究了豆粕發(fā)酵物與天麻等比例混合物的促進(jìn)睡眠的效果，它們之間最佳劑量及其配比將在后續(xù)的試驗(yàn)中進(jìn)一步優(yōu)化。