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        熱處理對羊骨膠原蛋白結(jié)構(gòu)的影響

        2019-05-18 06:54:56高玲玲王振宇饒偉麗張德權(quán)
        中國食品學(xué)報 2019年3期
        關(guān)鍵詞:振動結(jié)構(gòu)

        高玲玲 王振宇 李 錚 饒偉麗 張德權(quán)

        (中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室 北京100193)

        膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)蛋白,主要存在于動物皮、骨、軟骨和肌腱等結(jié)締組織中,約占動物總蛋白的30%左右[1-2]。膠原蛋白由3 條各自呈左手螺旋的α 鏈組成,相互之間通過氫鍵結(jié)合成右手超螺旋結(jié)構(gòu)。在三螺旋結(jié)構(gòu)域內(nèi),氨基酸序列呈(Gly-X-Y)n 周期性排列,其中X、Y 位置多為脯氨酸 (Pro,28%)和羥脯氨酸(Hyp,38%)[1,3]。

        膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)對熱敏感,加熱時螺旋區(qū)解旋,3 條肽鏈彼此分開,其理化和生物學(xué)特性隨之改變。膠原蛋白的熱穩(wěn)定性是影響其開發(fā)與應(yīng)用的主要因素,也是一直以來的研究熱點和難點。研究人員利用紅外光譜、圓二色譜、差示掃描量熱儀和原子力顯微鏡等手段,從多個結(jié)構(gòu)層次上對膠原蛋白的熱穩(wěn)定性進(jìn)行研究[1,4-6],并結(jié)合相關(guān)光譜技術(shù)對脫水加熱下膠原蛋白的結(jié)構(gòu)變化規(guī)律進(jìn)行闡釋。Tian 等[7]利用二維紅外光譜研究發(fā)現(xiàn)戊二醛交聯(lián)膠原蛋白的熱穩(wěn)定性顯著提高。肖和蘭等[8]采用二維紅外相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),升溫過程中膠原蛋白的二級結(jié)構(gòu)變化順序為:-CH->酰胺I>酰胺II>酰胺III>-CH2-。Anna Pielesz[9]利用紅外光譜分峰擬合研究發(fā)現(xiàn)巖藻多糖對其熱穩(wěn)定性具有保護(hù)作用。

        食品中,膠原蛋白主要應(yīng)用于溶液環(huán)境下,與水分子結(jié)合產(chǎn)生膠凝、保水等效果。然而,溶液狀態(tài)下熱處理對膠原蛋白結(jié)構(gòu)變化規(guī)律的影響尚缺乏研究報道。本文以羊骨膠原蛋白為原料,采用傅里葉變換紅外光譜,結(jié)合分峰擬合和二維相關(guān)分析,對不同溫度處理后水溶液中的膠原蛋白結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行分析。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        羊骨購買自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟額爾敦肉類食品有限公司;胃蛋白酶購自美國Amresco 公司;所用化學(xué)試劑均為分析純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        凍干機(jī),北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司LGJ-25 型;差示掃描量熱儀,美國Inc TA InstrumentsQ-200 Series;烘箱,寧波江南儀器廠;水浴鍋,上海精宏實驗設(shè)備有限公司;紅外光譜儀,德國Bruker Tensor 27。

        1.3 羊骨膠原蛋白提取

        骨膠原蛋白提取方法參考Li 等人[2]的方法,稍作修改。新鮮烏珠穆沁羊骨購買自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟,-20 ℃保存。清洗破碎后,進(jìn)行除雜蛋白、脫脂和脫鈣處理。采用胃蛋白酶-乙酸法提取羊骨膠原蛋白,通過鹽析和透析純化并凍干得到酶溶性羊骨膠原蛋白。

        1.4 羊骨膠原蛋白的熱變性曲線

        準(zhǔn)確稱取一定量膠原蛋白放于差示掃描量熱儀(DSC)坩堝中,從25 ℃加熱至75 ℃,升溫速率為5 ℃/min。

        1.5 熱處理對羊骨膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

        脫水干燥加熱。將膠原蛋白凍干品分成9 組,每組3 份。每組分別置于25~105 ℃烘箱中加熱30 min,ΔT=10 ℃。室溫冷卻后,采用紅外光譜ATR 法進(jìn)行測定,掃描波數(shù)范圍為4 000~500 cm-1,分辨率為2 cm-1,掃描信號累加32 次,以空氣為空白。

        水溶液中加熱。將膠原蛋白凍干品溶于蒸餾水中,質(zhì)量濃度為4 mg/mL,攪拌均勻,分成8 組,每組3 份。每組分別置于25~95 ℃水浴中加熱30 min,ΔT=10 ℃。室溫冷卻后,采用紅外光譜ATR法進(jìn)行測定,以蒸餾水為空白。

        參考倪娜[10]、Andreas Barth[11]、Shudong He[12]等人的研究,使用Peaktit 4.12 軟件對膠原蛋白在1 600~1 700 cm-1(酰胺I 帶)波長范圍內(nèi)的圖譜進(jìn)行分峰擬合,根據(jù)各子峰的峰位歸屬,計算各二級結(jié)構(gòu)(α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲)的相對百分含量。

        1.6 熱處理對羊骨膠原蛋白結(jié)構(gòu)影響的二維相關(guān)分析

        采用2D Shige 軟件(KwanseiGakuin)繪制以等高線表征的二維相關(guān)圖譜。根據(jù)二維相關(guān)分析讀譜規(guī)則[7]確定各基團(tuán)響應(yīng)順序。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 羊骨膠原蛋白熱穩(wěn)定性

        天然膠原蛋白分子呈棒狀,具有典型的三螺旋結(jié)構(gòu)。膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)對熱敏感,加熱易導(dǎo)致三螺旋結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氫鍵斷裂,三肽鏈解旋,天然構(gòu)象被破壞[5]。膠原蛋白熱變性溫度是指三螺旋結(jié)構(gòu)解旋50%時的溫度,是反映其天然螺旋結(jié)構(gòu)的一項重要指標(biāo)。如圖1所示,本研究提取的膠原蛋白熱變性溫度為49.97 ℃,說明其保留了完整的三螺旋結(jié)構(gòu)。

        2.2 熱處理對羊骨膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

        2.2.1 脫水加熱下羊骨膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)變化如圖2所示,羊骨膠原蛋白具有I 型膠原蛋白紅外光譜的特征吸收峰,即酰胺I、II 和III 吸收峰。酰胺I 區(qū)域(1 600~1 700 cm-1)是多肽骨架上C=O伸縮振動導(dǎo)致的,并且很難被側(cè)鏈構(gòu)象所影響,因此,酰胺I 區(qū)域常被用來分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)組成[11-12]。酰胺II 區(qū)域(1 550~1 600 cm-1)為N-H彎曲振動(40%~60%)和C-N 伸縮(18%~40%)[11]。酰胺III 區(qū)域(1 200~1 400 cm-1)的構(gòu)成相對復(fù)雜,與膠原蛋白分子間的相互作用有關(guān),涉及C-N 伸縮振動、酰胺鍵中N-H 鍵的面內(nèi)彎曲以及甘氨酸主鏈和脯氨酸側(cè)鏈上CH2基團(tuán)的搖擺振動[1]。隨溫度升高,膠原蛋白的主要紅外吸收峰均向短波方向遷移,酰胺I 變化最為顯著。25~95 ℃,酰胺I 向短波方向遷移8 cm-1,表明加熱破壞了羊骨膠原蛋白的二級結(jié)構(gòu)。此外,1 454 cm-1處的吸收峰藍(lán)移至1 452 cm-1處。當(dāng)溫度繼續(xù)升高至105 ℃時,1 454,1 338,1 238 cm-1處的吸收峰分別藍(lán)移至1 448,1 336,1 236 cm-1處,這可能是由于升溫至105 ℃時膠原蛋白發(fā)生了交聯(lián)[13]。表1為膠原蛋白在波長1 234 和1 452 cm-1處吸收峰吸光度的比值。通常當(dāng)兩處吸收峰的吸光度比值接近于1.0時,說明膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)保持完整[7]。隨著溫度升高,膠原蛋白在波長1 234 和1 452 cm-1處吸收峰吸光度的比值從1.04 逐漸降低到0.87,說明隨著溫度升高,膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)的完整性被破壞、三螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生解旋。

        圖1 羊骨膠原蛋白熱穩(wěn)定性Fig.1 Thermostability of sheep bone collagen

        圖2 脫水加熱下羊骨膠原蛋白在1000~1700 cm-1波長范圍內(nèi)的紅外吸收光譜Fig.2 Temperature-dependent FTIR spectra in the region of 1700-1000 cm-1 of sheep bone collagen by dehydrothermal treatment

        表1 加熱對羊骨膠原蛋白I(1234/1452)的影響Table 1 The effect of heat treatment on I(1234/1452) of sheep bone collagen

        如圖3所示,隨溫度升高,膠原蛋白酰胺I 區(qū)域的主要子吸收峰(1 660 cm-1)吸收強(qiáng)度減小,分裂成多個子吸收峰,表明1 660 cm-1處對應(yīng)的α-螺旋結(jié)構(gòu)逐漸減少。當(dāng)溫度升高至55 ℃時,波長1 644 cm-1處出現(xiàn)子吸收峰,并隨溫度繼續(xù)升高,吸收強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),表明1 644 cm-1處對應(yīng)的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)逐漸增加,這與鐘朝輝等人[14]的研究結(jié)果一致。如圖4所示,隨溫度升高,膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋(1 650~1 660 cm-1)相對百分含量從 63.75% 降低到20.38%,β-折疊(1 600~1 640 cm-1和1 680~1 699 cm-1)從36.12% 增加到46.66%,β-轉(zhuǎn)角(1 660~1680 cm-1)從0.13% 增加到9.95%,無規(guī)則卷曲(1 640~1 650 cm-1)從0%增加到23.01%。α-螺旋含量逐漸降低,β-折疊和β-轉(zhuǎn)角含量先增加后減少,無規(guī)則卷曲含量逐漸增加,說明膠原蛋白分子結(jié)構(gòu)逐漸舒展,α-螺旋首先轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊和β-轉(zhuǎn)角,進(jìn)而變成無規(guī)則卷曲,分子無序性增大。

        圖3 脫水加熱下羊骨膠原蛋白酰胺I 區(qū)域分峰擬合Fig.3 Curve-fitting results of amide I band of sheep bone collagen by dehydrothermal treatment

        圖4 脫水加熱下羊骨膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)相對百分含量變化Fig.4 Changes of secondary structure of sheep bonecollagen by dehydrothermal treatment

        圖5 水溶液加熱下膠原蛋白在1 700~1 000 cm-1波長范圍內(nèi)的紅外吸收光譜Fig.5 Temperature-dependent FTIR spectra in the region of 1 700-1 000 cm-1 of collagen by aqueous heating

        2.2.2 水溶液加熱下羊骨膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)變化 圖5所示為水溶液加熱下羊骨膠原蛋白紅外吸收光譜圖。與脫水加熱類似,隨溫度升高,膠原蛋白的主要紅外吸收峰發(fā)生遷移。隨溫度升高,水溶液中膠原蛋白酰胺I 區(qū)域最大吸收峰從1 660 cm-1藍(lán)移至1 641 cm-1,波長減小19 cm-1,1 340 cm-1處最大吸收峰藍(lán)移至1 336 cm-1,波長減小4 cm-1。然而,酰胺III 區(qū)域最大吸收峰紅移了5 cm-1,遷移至1 247 cm-1,波長1 076,1 404 和1 456 cm-1處吸收峰紅移至1 080,1 407 和1 458 cm-1。與脫水加熱相比,水溶液加熱下膠原蛋白主要吸收峰的遷移幅度更大,說明水溶液狀態(tài)下膠原蛋白更容易發(fā)生變性。如表1所示,隨溫度升高,水溶液加熱下膠原蛋白在1 240 cm-1和1 455 cm-1處最大吸收峰吸光度的比值從1.00 逐漸降低到0.84,說明隨溫度升高,膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)被破壞。

        圖6 水溶液加熱下膠原蛋白酰胺I 區(qū)域分峰擬合Fig.6 Curve-fitting results of amide I band of collagen by aqueous heating

        如圖6所示,與脫水加熱下類似,隨溫度升高,水溶液加熱下膠原蛋白在酰胺I 區(qū)域的主要子吸收峰(1 660 cm-1)吸收強(qiáng)度減小,逐步分裂成多個子吸收峰。如圖7所示,水溶液加熱下,膠原蛋白的α-螺旋相對百分含量從65.67%降低到6.28%%,β-折疊從33.51%減小到22.88%,β-轉(zhuǎn)角從0.82%增加到31.47%,無規(guī)則卷曲從0%增加到39.37%。膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)相對百分含量的變化趨勢與脫水加熱下相同:α-螺旋含量逐漸降低,β-折疊和β-轉(zhuǎn)角含量先增加后減少,無規(guī)則卷曲含量逐漸增加,說明膠原蛋白分子結(jié)構(gòu)逐漸舒展,α-螺旋首先轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊和β-轉(zhuǎn)角,進(jìn)而變成無規(guī)則卷曲,分子無序性增大。

        圖7 水溶液加熱下膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)相對百分含量變化Fig.7 Changes of secondary structure of collagen by aqueous heating

        2.3 二維紅外相關(guān)光譜分析

        為獲得加熱對膠原蛋白結(jié)構(gòu)影響的詳細(xì)信息,以溫度為外擾,對膠原蛋白在1 200~1 750 cm-1和950~1 450 cm-1波長范圍內(nèi)的紅外光譜進(jìn)行二維相關(guān)分析,根據(jù)二維相關(guān)光譜讀譜規(guī)則[7,15-16],確定各基團(tuán)對溫度的響應(yīng)順序。

        2.3.1 脫水加熱下膠原蛋白二維紅外光譜分析如圖8所示,為脫水加熱下膠原蛋白在1 000~1 700 cm-1波長范圍內(nèi)的二維紅外相關(guān)光譜。同步光譜中,自相干峰的強(qiáng)度大小代表在相關(guān)周期中光強(qiáng)度動態(tài)漲落的總程度,說明這些振動峰對應(yīng)的基團(tuán)隨溫度的升高而發(fā)生變化[15]。異步光譜可以為同步光譜提供一些補(bǔ)充信息,并且判斷波長ν1 和ν2 的變化順序。圖8a和圖8c中共有10 個自動峰,分別位于1 633,1 589,1 541,1 481,1 450,1 338,1 238,1 205,1 080 和1 032 cm-1處,說明這些吸收峰隨升溫的進(jìn)程而發(fā)生變化,并對變溫擾動比較敏感。如圖8b和圖8d,所有交叉峰都 是正交叉峰,如Ф(1 544,1 633)、Ф(1 452,1 544)和Ф(1 338,1 544),表明1 633,1 544,1 452,1 402 和1 338 cm-1處的吸收峰同時減少或增加。根據(jù)二維相關(guān)光譜讀譜規(guī)則,脫水加熱下膠原蛋白各吸收峰對溫度的響應(yīng)順序如表2所示。因此,膠原蛋白紅吸收峰對溫度的響應(yīng)順序為:1 033>1 338>1 238>1 452>1 544>1 633 cm-1。根據(jù)Payne & Veis[17]和Zhong-Rui Li[2]等人研究,對紅外光譜中各吸收峰進(jìn)行譜峰指認(rèn),如表3所示。因此,膠原蛋白各基團(tuán)對溫度的響應(yīng)順序為:脯氨酸CH3基團(tuán)搖擺振動>CH2搖擺振動>N-H 彎曲振動>CH2彎曲振動>C-N 伸縮>C=O 伸縮振動。

        圖8 脫水加熱下膠原蛋白在1 200~1 750 cm-1(a)、(b)和950~1 450 cm-1(c)、(d)范圍內(nèi)二維紅外相關(guān)光譜Fig.8 Two-dimensional infrared dcorrelation spectra in the region of 1 200-1 750 cm-1 (a)and (b)and 950-1450 cm-1 (c)and (d)of collagen by dehydrothermal treatment

        表2 脫水加熱下膠原蛋白基團(tuán)對溫度的響應(yīng)順序Table 2 The order of band intensity variations of collagen response to dehydrothermal treatment

        表3 膠原蛋白紅外光譜吸收峰指認(rèn)Table 3 Assignments of the major absorption bands of collagen in FTIR spectra

        2.3.2 水溶液加熱下膠原蛋白二維紅外光譜分析 圖9所示為水溶液加熱下膠原蛋白二維紅外相關(guān)光譜。與脫水加熱相比,水溶液下膠原蛋白對溫度的響應(yīng)存在差異。圖9a、9c 中共7 個自動峰,分別位于1 678,1 618,1 558,1 406,1 247,1 076,1 055 cm-1處。其中,1 678,1 618 cm-1處自動峰均屬于酰胺I 區(qū)域。根據(jù)表4所示,膠原蛋白基團(tuán)對溫度的響應(yīng)順序為:1 055>1 247>1 406>1 678>1 618>1 558 cm-1。參照表3譜峰指認(rèn)結(jié)果,水溶液加熱下膠原蛋白基團(tuán)對溫度的響應(yīng)順序為:N-H彎曲>COO-對稱伸縮>C=O 伸縮振動>C-N 伸縮。

        圖9 水溶液加熱下膠原蛋白在1 200~1 750 cm-1(a)、(b)和950~1 450 cm-1(c)、(d)范圍內(nèi)二維紅外相關(guān)光譜Fig.9 Two-dimensional infrared correlation spectra in the region of 1 200-1 750 cm-1 (a and b)and 950-1450 cm-1 (c and d)of collagen by aqueous heating

        表4 水溶液加熱下膠原蛋白基團(tuán)對溫度的響應(yīng)順序Table 4 The order of band intensity variations of collagen response to aqueous heating

        3 結(jié)論

        兩種加熱環(huán)境下,羊骨膠原蛋白的結(jié)構(gòu)變化規(guī)律相同,即隨著溫度升高,膠原蛋白三螺旋區(qū)域解旋形成3 條單肽鏈,α-螺旋含量逐漸降低,無規(guī)則卷曲含量逐漸增加,分子結(jié)構(gòu)逐漸舒展,無序性增大。但膠原蛋白基團(tuán)對溫度的響應(yīng)順序不同:脫水加熱下,膠原蛋白基團(tuán)對溫度的響應(yīng)順序為脯氨酸CH3基團(tuán)搖擺振動>CH2搖擺振動>N-H 彎曲振動>CH2彎曲振動>C-N 伸縮>C=O 伸縮振動;水溶液加熱下的響應(yīng)順序為N-H 彎曲>COO-對稱伸縮>C=O 伸縮振動>C-N 伸縮。

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