高玲玲 王振宇 李 錚 饒偉麗 張德權(quán)

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室 北京100193）

膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)蛋白，主要存在于動物皮、骨、軟骨和肌腱等結(jié)締組織中，約占動物總蛋白的30%左右[1-2]。膠原蛋白由3 條各自呈左手螺旋的α 鏈組成，相互之間通過氫鍵結(jié)合成右手超螺旋結(jié)構(gòu)。在三螺旋結(jié)構(gòu)域內(nèi)，氨基酸序列呈（Gly-X-Y）n 周期性排列，其中X、Y 位置多為脯氨酸 （Pro，28%）和羥脯氨酸（Hyp，38%）[1，3]。

膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)對熱敏感，加熱時螺旋區(qū)解旋，3 條肽鏈彼此分開，其理化和生物學(xué)特性隨之改變。膠原蛋白的熱穩(wěn)定性是影響其開發(fā)與應(yīng)用的主要因素，也是一直以來的研究熱點和難點。研究人員利用紅外光譜、圓二色譜、差示掃描量熱儀和原子力顯微鏡等手段，從多個結(jié)構(gòu)層次上對膠原蛋白的熱穩(wěn)定性進(jìn)行研究[1，4-6]，并結(jié)合相關(guān)光譜技術(shù)對脫水加熱下膠原蛋白的結(jié)構(gòu)變化規(guī)律進(jìn)行闡釋。Tian 等[7]利用二維紅外光譜研究發(fā)現(xiàn)戊二醛交聯(lián)膠原蛋白的熱穩(wěn)定性顯著提高。肖和蘭等[8]采用二維紅外相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，升溫過程中膠原蛋白的二級結(jié)構(gòu)變化順序為：-CH-＞酰胺I＞酰胺II＞酰胺III＞-CH2-。Anna Pielesz[9]利用紅外光譜分峰擬合研究發(fā)現(xiàn)巖藻多糖對其熱穩(wěn)定性具有保護(hù)作用。

食品中，膠原蛋白主要應(yīng)用于溶液環(huán)境下，與水分子結(jié)合產(chǎn)生膠凝、保水等效果。然而，溶液狀態(tài)下熱處理對膠原蛋白結(jié)構(gòu)變化規(guī)律的影響尚缺乏研究報道。本文以羊骨膠原蛋白為原料，采用傅里葉變換紅外光譜，結(jié)合分峰擬合和二維相關(guān)分析，對不同溫度處理后水溶液中的膠原蛋白結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊骨購買自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟額爾敦肉類食品有限公司；胃蛋白酶購自美國Amresco 公司；所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

凍干機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司LGJ-25 型；差示掃描量熱儀，美國Inc TA InstrumentsQ-200 Series；烘箱，寧波江南儀器廠；水浴鍋，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；紅外光譜儀，德國Bruker Tensor 27。

1.3 羊骨膠原蛋白提取

骨膠原蛋白提取方法參考Li 等人[2]的方法，稍作修改。新鮮烏珠穆沁羊骨購買自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟，-20 ℃保存。清洗破碎后，進(jìn)行除雜蛋白、脫脂和脫鈣處理。采用胃蛋白酶-乙酸法提取羊骨膠原蛋白，通過鹽析和透析純化并凍干得到酶溶性羊骨膠原蛋白。

1.4 羊骨膠原蛋白的熱變性曲線

準(zhǔn)確稱取一定量膠原蛋白放于差示掃描量熱儀（DSC）坩堝中，從25 ℃加熱至75 ℃，升溫速率為5 ℃/min。

1.5 熱處理對羊骨膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

脫水干燥加熱。將膠原蛋白凍干品分成9 組，每組3 份。每組分別置于25～105 ℃烘箱中加熱30 min，ΔT=10 ℃。室溫冷卻后，采用紅外光譜ATR 法進(jìn)行測定，掃描波數(shù)范圍為4 000～500 cm-1，分辨率為2 cm-1，掃描信號累加32 次，以空氣為空白。

水溶液中加熱。將膠原蛋白凍干品溶于蒸餾水中，質(zhì)量濃度為4 mg/mL，攪拌均勻，分成8 組，每組3 份。每組分別置于25～95 ℃水浴中加熱30 min，ΔT=10 ℃。室溫冷卻后，采用紅外光譜ATR法進(jìn)行測定，以蒸餾水為空白。

參考倪娜[10]、Andreas Barth[11]、Shudong He[12]等人的研究，使用Peaktit 4.12 軟件對膠原蛋白在1 600～1 700 cm-1（酰胺I 帶）波長范圍內(nèi)的圖譜進(jìn)行分峰擬合，根據(jù)各子峰的峰位歸屬，計算各二級結(jié)構(gòu)（α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲）的相對百分含量。

1.6 熱處理對羊骨膠原蛋白結(jié)構(gòu)影響的二維相關(guān)分析

采用2D Shige 軟件（KwanseiGakuin）繪制以等高線表征的二維相關(guān)圖譜。根據(jù)二維相關(guān)分析讀譜規(guī)則[7]確定各基團(tuán)響應(yīng)順序。

2 結(jié)果與討論

2.1 羊骨膠原蛋白熱穩(wěn)定性

天然膠原蛋白分子呈棒狀，具有典型的三螺旋結(jié)構(gòu)。膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)對熱敏感，加熱易導(dǎo)致三螺旋結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氫鍵斷裂，三肽鏈解旋，天然構(gòu)象被破壞[5]。膠原蛋白熱變性溫度是指三螺旋結(jié)構(gòu)解旋50%時的溫度，是反映其天然螺旋結(jié)構(gòu)的一項重要指標(biāo)。如圖1所示，本研究提取的膠原蛋白熱變性溫度為49.97 ℃，說明其保留了完整的三螺旋結(jié)構(gòu)。

2.2 熱處理對羊骨膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 脫水加熱下羊骨膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)變化如圖2所示，羊骨膠原蛋白具有I 型膠原蛋白紅外光譜的特征吸收峰，即酰胺I、II 和III 吸收峰。酰胺I 區(qū)域（1 600～1 700 cm-1）是多肽骨架上C=O伸縮振動導(dǎo)致的，并且很難被側(cè)鏈構(gòu)象所影響，因此，酰胺I 區(qū)域常被用來分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)組成[11-12]。酰胺II 區(qū)域（1 550～1 600 cm-1）為N-H彎曲振動（40%～60%）和C-N 伸縮（18%～40%）[11]。酰胺III 區(qū)域（1 200～1 400 cm-1）的構(gòu)成相對復(fù)雜，與膠原蛋白分子間的相互作用有關(guān)，涉及C-N 伸縮振動、酰胺鍵中N-H 鍵的面內(nèi)彎曲以及甘氨酸主鏈和脯氨酸側(cè)鏈上CH2基團(tuán)的搖擺振動[1]。隨溫度升高，膠原蛋白的主要紅外吸收峰均向短波方向遷移，酰胺I 變化最為顯著。25～95 ℃，酰胺I 向短波方向遷移8 cm-1，表明加熱破壞了羊骨膠原蛋白的二級結(jié)構(gòu)。此外，1 454 cm-1處的吸收峰藍(lán)移至1 452 cm-1處。當(dāng)溫度繼續(xù)升高至105 ℃時，1 454，1 338，1 238 cm-1處的吸收峰分別藍(lán)移至1 448，1 336，1 236 cm-1處，這可能是由于升溫至105 ℃時膠原蛋白發(fā)生了交聯(lián)[13]。表1為膠原蛋白在波長1 234 和1 452 cm-1處吸收峰吸光度的比值。通常當(dāng)兩處吸收峰的吸光度比值接近于1.0時，說明膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)保持完整[7]。隨著溫度升高，膠原蛋白在波長1 234 和1 452 cm-1處吸收峰吸光度的比值從1.04 逐漸降低到0.87，說明隨著溫度升高，膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)的完整性被破壞、三螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生解旋。

圖1 羊骨膠原蛋白熱穩(wěn)定性Fig.1 Thermostability of sheep bone collagen

圖2 脫水加熱下羊骨膠原蛋白在1000～1700 cm-1波長范圍內(nèi)的紅外吸收光譜Fig.2 Temperature-dependent FTIR spectra in the region of 1700-1000 cm-1 of sheep bone collagen by dehydrothermal treatment

表1 加熱對羊骨膠原蛋白I（1234/1452）的影響Table 1 The effect of heat treatment on I（1234/1452） of sheep bone collagen

如圖3所示，隨溫度升高，膠原蛋白酰胺I 區(qū)域的主要子吸收峰（1 660 cm-1）吸收強(qiáng)度減小，分裂成多個子吸收峰，表明1 660 cm-1處對應(yīng)的α-螺旋結(jié)構(gòu)逐漸減少。當(dāng)溫度升高至55 ℃時，波長1 644 cm-1處出現(xiàn)子吸收峰，并隨溫度繼續(xù)升高，吸收強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，表明1 644 cm-1處對應(yīng)的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)逐漸增加，這與鐘朝輝等人[14]的研究結(jié)果一致。如圖4所示，隨溫度升高，膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋（1 650～1 660 cm-1）相對百分含量從 63.75% 降低到20.38%，β-折疊（1 600～1 640 cm-1和1 680～1 699 cm-1）從36.12% 增加到46.66%，β-轉(zhuǎn)角（1 660～1680 cm-1）從0.13% 增加到9.95%，無規(guī)則卷曲（1 640～1 650 cm-1）從0%增加到23.01%。α-螺旋含量逐漸降低，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角含量先增加后減少，無規(guī)則卷曲含量逐漸增加，說明膠原蛋白分子結(jié)構(gòu)逐漸舒展，α-螺旋首先轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊和β-轉(zhuǎn)角，進(jìn)而變成無規(guī)則卷曲，分子無序性增大。

圖3 脫水加熱下羊骨膠原蛋白酰胺I 區(qū)域分峰擬合Fig.3 Curve-fitting results of amide I band of sheep bone collagen by dehydrothermal treatment

圖4 脫水加熱下羊骨膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)相對百分含量變化Fig.4 Changes of secondary structure of sheep bonecollagen by dehydrothermal treatment

圖5 水溶液加熱下膠原蛋白在1 700～1 000 cm-1波長范圍內(nèi)的紅外吸收光譜Fig.5 Temperature-dependent FTIR spectra in the region of 1 700-1 000 cm-1 of collagen by aqueous heating

2.2.2 水溶液加熱下羊骨膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)變化 圖5所示為水溶液加熱下羊骨膠原蛋白紅外吸收光譜圖。與脫水加熱類似，隨溫度升高，膠原蛋白的主要紅外吸收峰發(fā)生遷移。隨溫度升高，水溶液中膠原蛋白酰胺I 區(qū)域最大吸收峰從1 660 cm-1藍(lán)移至1 641 cm-1，波長減小19 cm-1，1 340 cm-1處最大吸收峰藍(lán)移至1 336 cm-1，波長減小4 cm-1。然而，酰胺III 區(qū)域最大吸收峰紅移了5 cm-1，遷移至1 247 cm-1，波長1 076，1 404 和1 456 cm-1處吸收峰紅移至1 080，1 407 和1 458 cm-1。與脫水加熱相比，水溶液加熱下膠原蛋白主要吸收峰的遷移幅度更大，說明水溶液狀態(tài)下膠原蛋白更容易發(fā)生變性。如表1所示，隨溫度升高，水溶液加熱下膠原蛋白在1 240 cm-1和1 455 cm-1處最大吸收峰吸光度的比值從1.00 逐漸降低到0.84，說明隨溫度升高，膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)被破壞。

圖6 水溶液加熱下膠原蛋白酰胺I 區(qū)域分峰擬合Fig.6 Curve-fitting results of amide I band of collagen by aqueous heating

如圖6所示，與脫水加熱下類似，隨溫度升高，水溶液加熱下膠原蛋白在酰胺I 區(qū)域的主要子吸收峰（1 660 cm-1）吸收強(qiáng)度減小，逐步分裂成多個子吸收峰。如圖7所示，水溶液加熱下，膠原蛋白的α-螺旋相對百分含量從65.67%降低到6.28%%，β-折疊從33.51%減小到22.88%，β-轉(zhuǎn)角從0.82%增加到31.47%，無規(guī)則卷曲從0%增加到39.37%。膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)相對百分含量的變化趨勢與脫水加熱下相同：α-螺旋含量逐漸降低，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角含量先增加后減少，無規(guī)則卷曲含量逐漸增加，說明膠原蛋白分子結(jié)構(gòu)逐漸舒展，α-螺旋首先轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊和β-轉(zhuǎn)角，進(jìn)而變成無規(guī)則卷曲，分子無序性增大。

圖7 水溶液加熱下膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)相對百分含量變化Fig.7 Changes of secondary structure of collagen by aqueous heating

2.3 二維紅外相關(guān)光譜分析

為獲得加熱對膠原蛋白結(jié)構(gòu)影響的詳細(xì)信息，以溫度為外擾，對膠原蛋白在1 200～1 750 cm-1和950～1 450 cm-1波長范圍內(nèi)的紅外光譜進(jìn)行二維相關(guān)分析，根據(jù)二維相關(guān)光譜讀譜規(guī)則[7，15-16]，確定各基團(tuán)對溫度的響應(yīng)順序。

2.3.1 脫水加熱下膠原蛋白二維紅外光譜分析如圖8所示，為脫水加熱下膠原蛋白在1 000～1 700 cm-1波長范圍內(nèi)的二維紅外相關(guān)光譜。同步光譜中，自相干峰的強(qiáng)度大小代表在相關(guān)周期中光強(qiáng)度動態(tài)漲落的總程度，說明這些振動峰對應(yīng)的基團(tuán)隨溫度的升高而發(fā)生變化[15]。異步光譜可以為同步光譜提供一些補(bǔ)充信息，并且判斷波長ν1 和ν2 的變化順序。圖8a和圖8c中共有10 個自動峰，分別位于1 633，1 589，1 541，1 481，1 450，1 338，1 238，1 205，1 080 和1 032 cm-1處，說明這些吸收峰隨升溫的進(jìn)程而發(fā)生變化，并對變溫擾動比較敏感。如圖8b和圖8d，所有交叉峰都 是正交叉峰，如Ф（1 544，1 633）、Ф（1 452，1 544）和Ф（1 338，1 544），表明1 633，1 544，1 452，1 402 和1 338 cm-1處的吸收峰同時減少或增加。根據(jù)二維相關(guān)光譜讀譜規(guī)則，脫水加熱下膠原蛋白各吸收峰對溫度的響應(yīng)順序如表2所示。因此，膠原蛋白紅吸收峰對溫度的響應(yīng)順序為：1 033＞1 338＞1 238＞1 452＞1 544＞1 633 cm-1。根據(jù)Payne & Veis[17]和Zhong-Rui Li[2]等人研究，對紅外光譜中各吸收峰進(jìn)行譜峰指認(rèn)，如表3所示。因此，膠原蛋白各基團(tuán)對溫度的響應(yīng)順序為：脯氨酸CH3基團(tuán)搖擺振動＞CH2搖擺振動＞N-H 彎曲振動＞CH2彎曲振動＞C-N 伸縮＞C=O 伸縮振動。

圖8 脫水加熱下膠原蛋白在1 200～1 750 cm-1（a）、（b）和950～1 450 cm-1（c）、（d）范圍內(nèi)二維紅外相關(guān)光譜Fig.8 Two-dimensional infrared dcorrelation spectra in the region of 1 200-1 750 cm-1 （a）and （b）and 950-1450 cm-1 （c）and （d）of collagen by dehydrothermal treatment

表2 脫水加熱下膠原蛋白基團(tuán)對溫度的響應(yīng)順序Table 2 The order of band intensity variations of collagen response to dehydrothermal treatment

表3 膠原蛋白紅外光譜吸收峰指認(rèn)Table 3 Assignments of the major absorption bands of collagen in FTIR spectra

2.3.2 水溶液加熱下膠原蛋白二維紅外光譜分析 圖9所示為水溶液加熱下膠原蛋白二維紅外相關(guān)光譜。與脫水加熱相比，水溶液下膠原蛋白對溫度的響應(yīng)存在差異。圖9a、9c 中共7 個自動峰，分別位于1 678，1 618，1 558，1 406，1 247，1 076，1 055 cm-1處。其中，1 678，1 618 cm-1處自動峰均屬于酰胺I 區(qū)域。根據(jù)表4所示，膠原蛋白基團(tuán)對溫度的響應(yīng)順序為：1 055＞1 247＞1 406＞1 678＞1 618＞1 558 cm-1。參照表3譜峰指認(rèn)結(jié)果，水溶液加熱下膠原蛋白基團(tuán)對溫度的響應(yīng)順序為：N-H彎曲＞COO-對稱伸縮＞C=O 伸縮振動＞C-N 伸縮。

圖9 水溶液加熱下膠原蛋白在1 200～1 750 cm-1（a）、（b）和950～1 450 cm-1（c）、（d）范圍內(nèi)二維紅外相關(guān)光譜Fig.9 Two-dimensional infrared correlation spectra in the region of 1 200-1 750 cm-1 （a and b）and 950-1450 cm-1 （c and d）of collagen by aqueous heating

表4 水溶液加熱下膠原蛋白基團(tuán)對溫度的響應(yīng)順序Table 4 The order of band intensity variations of collagen response to aqueous heating

3 結(jié)論

兩種加熱環(huán)境下，羊骨膠原蛋白的結(jié)構(gòu)變化規(guī)律相同，即隨著溫度升高，膠原蛋白三螺旋區(qū)域解旋形成3 條單肽鏈，α-螺旋含量逐漸降低，無規(guī)則卷曲含量逐漸增加，分子結(jié)構(gòu)逐漸舒展，無序性增大。但膠原蛋白基團(tuán)對溫度的響應(yīng)順序不同：脫水加熱下，膠原蛋白基團(tuán)對溫度的響應(yīng)順序為脯氨酸CH3基團(tuán)搖擺振動＞CH2搖擺振動＞N-H 彎曲振動＞CH2彎曲振動＞C-N 伸縮＞C=O 伸縮振動；水溶液加熱下的響應(yīng)順序為N-H 彎曲＞COO-對稱伸縮＞C=O 伸縮振動＞C-N 伸縮。