張鳳梅 湯高奇 田 瑋 柳艷霞* 趙改名 趙莉君

（1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 鄭州450002 2 河南省肉制品加工與質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州450002 3 河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院 鄭州451450 4 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院 鄭州450002）

美拉德反應(yīng)，也稱羰氨反應(yīng)、非酶褐變（Nonenzymatic browning），是指食品在加工、貯藏過程中含有的羰基化合物和氨基化合物在一定溫度下發(fā)生的一系列復(fù)雜反應(yīng)的總稱，對食品品質(zhì)具有重要影響[1-2]。美拉德反應(yīng)極為復(fù)雜，其反應(yīng)歷程、反應(yīng)產(chǎn)物的性質(zhì)及結(jié)構(gòu)不僅受氨基酸與糖種類、性質(zhì)的影響，同時(shí)與反應(yīng)溫度、時(shí)間、pH 值及金屬離子等有關(guān)[3]。美拉德反應(yīng)物主要是醛、酮、還原糖和氨基酸、肽及蛋白質(zhì)，其反應(yīng)產(chǎn)生的活性中間體及雜環(huán)類化合物不僅為食品提供了獨(dú)特的風(fēng)味，還具有抗氧化、抗誘變等特性，在食品、香料、色素等行業(yè)應(yīng)用廣泛[4]。鑒于美拉德反應(yīng)所受影響因素較多，生成產(chǎn)物的種類較多且結(jié)構(gòu)、性質(zhì)較為復(fù)雜等因素，科學(xué)家大多通過建立模式美拉德體系來研究產(chǎn)物的性質(zhì)，通過控制糖、氨基酸種類和反應(yīng)條件來生成不同組成的美拉德產(chǎn)物混合物[5-6]。張凌燕等[7]對模式體系美拉德的研究主要是針對高溫環(huán)境下進(jìn)行的，得到3 種氨基酸和葡萄糖美拉德產(chǎn)物的相關(guān)物理特性；孫麗平等[8]主要以賴氨酸-葡萄糖為原料研究模式美拉德反應(yīng)中揮發(fā)性產(chǎn)物，研究得出pH 和加熱時(shí)間對反應(yīng)產(chǎn)物均具有重要影響；賀湘等[3]對模式美拉德體系主要采用高壓脈沖電場進(jìn)行研究，得出體系褐變度、抗氧化活性與反應(yīng)時(shí)間及電場強(qiáng)度均呈正相關(guān)；朱文輝等[9]對于谷氨酸-葡萄糖的美拉德反應(yīng)主要采取固相的反應(yīng)條件，對各反應(yīng)階段熱解產(chǎn)物的逸出規(guī)律進(jìn)行研究；趙景麗等[10]對于溫和條件下的模式美拉德反應(yīng)僅采取單一的溫度條件和反應(yīng)時(shí)間，研究出主要的揮發(fā)性產(chǎn)物，不能很好地解釋從反應(yīng)開始到結(jié)束的物化性質(zhì)的變化。目前，關(guān)于游離氨基酸在溫和條件下的美拉德反應(yīng)研究，其體系或高溫條件或反應(yīng)時(shí)間單一，模式體系下美拉德反應(yīng)程度以及如何變化的尚不清楚。

針對當(dāng)前研究現(xiàn)狀，本試驗(yàn)采用模式美拉德反應(yīng)體系，以葡萄糖和谷氨酸為反應(yīng)物，磷酸鹽緩沖液為反應(yīng)體系，探討反應(yīng)溫度和時(shí)間對溫和條件下谷氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)程度的影響，以期對溫和條件下的模式美拉德反應(yīng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與主要儀器、設(shè)備

D-（+）-葡萄糖，純度≥99.50%，L-谷氨酸，純度≥99%，美國Sigma-Aldrich 公司；0.2mol/L pH 6.0 的磷酸鹽緩沖溶液，北京索萊寶科技有限公司；0.22 μm 濾菌膜，德國MEMBRANA 公司；UV-2600 型紫外分光光度計(jì)，日本島津企業(yè)管理（中國）有限公司；DNP-9272 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)制備有限公司；PEN3 便攜式電子鼻系統(tǒng)，德國Airsense 公司；HH-501 數(shù)顯超級(jí)恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；臺(tái)式酸度計(jì)pH213，意大利哈納。

1.2 谷氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系的構(gòu)建

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的D-葡萄糖和L-谷氨酸，分別溶解于pH 6.0、濃度0.2 mol/L 的磷酸鹽緩沖液，在無菌操作臺(tái)上經(jīng)0.22 μm 濾菌膜過濾除菌。分別移取一定體積上述溶液于15 mL 的頂空萃取瓶中混合均勻，使得二者最終濃度分別為0.02，0.06 mol/L，置于10，20，30，40 ℃的培養(yǎng)箱中，反應(yīng)時(shí)間為10，20，30，40，50，60 d，以0 d 為對照組。樣品反應(yīng)結(jié)束后置于-25 ℃冰箱中，以待檢測。

1.3 測定方法

1.3.1 美拉德反應(yīng)體系pH 值的測定 將美拉德反應(yīng)液調(diào)節(jié)至室溫25 ℃，采用臺(tái)式酸度計(jì)pH 213進(jìn)行測定，待pH 讀數(shù)穩(wěn)定后記錄數(shù)據(jù)。測定樣品前，采用“兩點(diǎn)法”對其進(jìn)行校準(zhǔn)。

1.3.2 初級(jí)階段產(chǎn)物和中級(jí)階段產(chǎn)物的測定 以蒸餾水為對照，用UV-2600 型紫外分光光度計(jì)在294 nm[11]、360 nm[12]處測定MRPs 吸光度值，分別作為表征美拉德反應(yīng)初級(jí)階段、 中級(jí)階段反應(yīng)程度的指標(biāo)。A294表示波長為294 nm 處吸光度測定值，A360表示波長為360 nm 處吸光度測定值。

1.3.3 美拉德反應(yīng)揮發(fā)性成分電子鼻測定 德國PEN3 電子鼻由10 種金屬氧化物傳感器構(gòu)成，每種傳感器對不同種類物質(zhì)的敏感性存在差異，具體性能如表1所示。

參照黨亞麗[13]試驗(yàn)方法稍作修改，用3 層保鮮膜將15 mL 頂空瓶封口，測試樣品在50 ℃恒溫水浴鍋中平衡30 min，載氣為干燥空氣，采樣時(shí)間間隔1 s，清洗時(shí)間120 s，歸零時(shí)間5 s，樣品測定時(shí)間80 s，進(jìn)樣流速為300 mL/min。

1.3.4 反應(yīng)體系葡萄糖含量測定 色譜條件：色譜儀：Dionex IC S-3000 離子色譜儀，分析柱：CarboPacPA10 分離柱 （4 mm×250 mm）與CarboPacPA10 保護(hù)柱 （4 mm×50 mm），淋洗液：50 mmol/L NaOH，流速：0.8 mL/min，柱箱溫度：30℃，進(jìn)樣體積：25 μL。檢測方式：電化學(xué)檢測器，脈沖安培檢測模式。

表1 化學(xué)傳感器及相應(yīng)的敏感物質(zhì)類型Table 1 Chemical sensors and the corresponding types of volatile substances

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用EXCEL2007，SPSS13.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析，Origin8.0 作圖。數(shù)據(jù)間多重對比采用Duncan 檢驗(yàn)分析顯著性，P<0.05 表示存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)溫度和時(shí)間對美拉德反應(yīng)體系pH 的影響

美拉德反應(yīng)體系pH 對反應(yīng)的速率和產(chǎn)物種類具有重要影響，其影響是通過羰基與氨基在不同的pH 環(huán)境中進(jìn)行不同程度的離子化實(shí)現(xiàn)的。各反應(yīng)溫度、 時(shí)間對美拉德體系pH 的影響見表2。

由表2可知，谷氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系pH 測定結(jié)果在同一時(shí)間——20，30，40 d 時(shí)，不同溫度下均存在顯著性差異（P<0.05），其中20 d 時(shí)在40 ℃時(shí)反應(yīng)體系pH 降至最低，30，40 d 時(shí)反應(yīng)體系分別在30，40 ℃的pH 值最低。而同一溫度不同時(shí)間下，僅10 ℃條件下，不同反應(yīng)時(shí)間美拉德反應(yīng)體系pH 值存在顯著差異（P<0.05），且反應(yīng)至60 d 時(shí)體系pH 值最低。

表2 谷氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系pH 變化Table 2 Changes in pH of glutamic acid and glucose Maillard reaction system

2.2 反應(yīng)溫度和時(shí)間對美拉德反應(yīng)初級(jí)階段、中級(jí)階段產(chǎn)物的影響

據(jù)報(bào)道[11]，294 nm 處的紫外吸光度值可用來表征美拉德反應(yīng)初級(jí)階段的反應(yīng)程度，吸光度值越大，表明初級(jí)階段生成的產(chǎn)物越多。反應(yīng)時(shí)間和溫度對美拉德反應(yīng)體系294 nm 處的吸光度影響如表3所示，可以看出，美拉德反應(yīng)體系294 nm處吸光度值在同一溫度下均隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而增大，在同一時(shí)間不同溫度條件下隨溫度升高吸光度也逐漸增大，其中30，40 ℃條件下的美拉德反應(yīng)體系吸光度值分別在40，30 d 以后增長較快，10，20 ℃條件下則在50 d 時(shí)增幅較大。

反應(yīng)時(shí)間和溫度對美拉德反應(yīng)體系360 nm處的吸光度影響如表4所示，可以看出，美拉德反應(yīng)體系360 nm 處吸光度值隨著溫度升高、反應(yīng)時(shí)間的增加，整體呈上升趨勢。其中40 ℃條件下的美拉德反應(yīng)體系吸光度值在50 d 之前增幅較大，50 d 之后趨于平穩(wěn)，10，20，30 ℃整個(gè)反應(yīng)階段增長緩慢。

2.3 谷氨酸-葡萄糖美拉德體系揮發(fā)性成分測定

2.3.1 描述性統(tǒng)計(jì) 采用SPSS13.0，對各反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間下的谷氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)試樣揮發(fā)性成分電子鼻測定數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)，如表5。

表3 谷氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系A(chǔ)294 變化Table 3 Changes in A294 of glutamic acid and glucose Maillard reaction system

表4 谷氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系A(chǔ)360 變化Table 4 Changes in A360 of glutamic acid and glucose Maillard reaction system

W3S 1.65±0.02 1.66±0.00 1.65±0.03 1.65±0.04 1.65±0.02 1.65±0.01 1.69±0.05 1.44±0.06 1.48±0.01 1.45±0.02 1.31±0.02 1.36±0.02 1.34±0.01 1.30±0.04 1.31±0.03 1.34±0.02 1.48±0.03 1.41±0.01 1.50±0.25 1.30±0.03 1.23±0.01 1.22±0.01 1.21±0.01 1.18±0.00計(jì)統(tǒng)性述描分成性發(fā)揮系體應(yīng)反德拉美糖萄-葡酸氨谷5 表Descriptive statistics of volatile components from the Maillard reaction in glutamic acid and glucose model system W2W W2S W1W W1S W5C W6S W3C W5S W1C 1.97±0.22 2.57±0.12 4.16±0.76 2.67±0.13 1.27±0.02 1.14±0.01 1.38±0.03 3.26±0.55 1.62±0.06 1.86±0.10 2.59±0.08 3.71±0.38 2.58±0.08 1.26±0.02 1.20±0.01 1.37±0.02 2.92±0.27 1.59±0.04 1.76±0.04 2.62±0.05 3.10±0.08 2.59±0.03 1.28±0.04 1.18±0.03 1.40±0.03 2.56±0.09 1.63±0.04 1.82±0.18 2.44±0.12 3.61±0.74 2.41±0.18 1.25±0.04 1.19±0.04 1.36±0.04 2.91±0.59 1.57±0.07 1.88±0.17 2.42±0.14 3.89±0.66 2.37±0.14 1.24±0.02 1.16±0.01 1.34±0.03 3.07±0.43 1.55±0.05 1.72±0.10 2.47±0.16 3.11±0.25 2.40±0.17 1.25±0.03 1.20±0.04 1.34±0.05 2.47±0.12 1.54±0.08 1.91±0.13 2.18±0.17 4.17±0.45 2.37±0.23 1.22±0.04 1.15±0.01 1.31±0.06 2.75±0.31 1.48±0.09 1.93±0.22 1.94±0.20 4.30±0.75 2.12±0.25 1.25±0.05 1.10±0.04 1.29±0.10 3.21±0.35 1.47±0.08 1.85±0.15 1.96±0.07 3.91±0.59 2.10±0.11 1.22±0.03 1.10±0.01 1.30±0.04 2.66±0.44 1.44±0.05 1.72±0.10 1.68±0.44 3.38±0.42 2.00±0.10 1.22±0.03 1.11±0.01 1.29±0.03 2.45±0.27 1.42±0.04 1.86±0.50 1.76±0.19 3.79±1.66 1.89±0.26 1.20±0.06 1.11±0.04 1.26±0.07 3.27±1.72 1.38±0.11 2.04±0.30 2.09±0.11 4.28±0.88 2.22±0.15 1.27±0.03 1.14±0.05 1.35±0.05 3.68±1.03 1.51±0.07 1.82±0.16 1.92±0.03 3.59±0.63 2.01±0.03 1.22±0.01 1.12±0.01 1.29±0.02 2.99±0.53 1.42±0.01 1.77±0.13 2.05±0.18 3.11±0.13 2.13±0.21 1.28±0.09 1.09±0.01 1.37±0.09 2.69±0.05 1.50±0.12 1.96±0.08 1.98±0.02 4.13±0.18 2.12±0.00 1.25±0.01 1.17±0.01 1.33±0.00 3.88±0.15 1.48±0.00 2.27±0.05 2.23±0.03 5.12±0.16 2.38±0.02 1.31±0.02 1.24±0.04 1.40±0.00 5.38±0.13 1.59±0.00 1.35±0.02 2.00±0.11 5.30±0.64 2.10±0.13 1.26±0.03 1.13±0.02 1.33±0.04 2.83±0.58 1.42±0.06 1.32±0.00 1.98±0.14 4.20±0.55 2.02±0.19 1.25±0.06 1.10±0.02 1.33±0.06 2.33±0.48 1.41±0.08 1.31±0.06 2.34±0.97 4.83±1.16 2.43±1.04 1.29±0.14 1.19±0.04 1.39±0.20 2.69±0.67 1.49±0.28 1.25±0.01 1.79±0.20 4.29±0.84 1.87±0.26 1.23±0.08 1.17±0.05 1.29±0.08 2.45±0.58 1.34±0.10 1.62±0.09 1.55±0.08 3.35±0.45 1.57±0.10 1.17±0.03 1.07±0.02 1.20±0.03 1.80±0.21 1.28±0.05 1.54±0.15 1.53±0.12 2.87±0.85 1.54±0.15 1.16±0.05 1.07±0.03 1.20±0.05 1.65±0.32 1.27±0.07 1.68±0.19 1.54±0.09 3.77±1.03 1.57±0.12 1.18±0.03 1.09±0.04 1.21±0.03 2.03±0.42 1.29±0.05 1.63±0.05 1.49±0.05 3.45±0.28 1.51±0.05 1.17±0.03 1.11±0.01 1.20±0.02 1.85±0.12 1.27±0.02 Table 5 號(hào)編1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24。差準(zhǔn)標(biāo)±別類10 ℃20 ℃30 ℃40 ℃10 ℃20 ℃30 ℃40 ℃10 ℃20 ℃30 ℃40 ℃10 ℃20 ℃30 ℃40 ℃10 ℃20 ℃30 ℃40 ℃10 ℃20 ℃30 ℃40 ℃值均平為均據(jù)10 d 20 d 30 d 40 d 50 d 60 d 數(shù)中：表注

2.3.2 主成分分析 在對谷氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系電子鼻測定數(shù)據(jù)描述性統(tǒng)計(jì)的基礎(chǔ)上，對不同反應(yīng)條件下24 類試樣揮發(fā)性成分進(jìn)行主成分分析。

由表6、圖1和表7結(jié)果分析可知，第一主成分的貢獻(xiàn)率為64.70%，相當(dāng)于6.470 個(gè)原始指標(biāo)的作用，可以反映原始信息量的64.70%，主要反映醇類，芳香族化合物，脂肪族，烴類物質(zhì)信息。第二主成分的貢獻(xiàn)率為14.80%，相當(dāng)于1.480 個(gè)原始指標(biāo)的作用，可以反映原始信息量的14.80%，主要反映硫化合物信息。第三主成分的貢獻(xiàn)率為11.33%，相當(dāng)于1.133 個(gè)原始指標(biāo)的作用，可以反映原始信息量的11.33%，主要反映芳烴化合物，硫的有機(jī)化合物，氮氧化物信息。前3 個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)達(dá)到90.83%，基本代表原始變量的絕大部分信息，因此，應(yīng)選用前3 個(gè)主成分?jǐn)?shù)據(jù)作為數(shù)據(jù)分析的有效成分。

表6 主成分的特征根及方差貢獻(xiàn)率Table 6 Eigenvalues of principal components and their variance contributions

圖1 主成分分析碎石圖Fig.1 Screen plot of PCA（principal component analysis）

表7 旋轉(zhuǎn)后的載荷因子Table 7 Rotated component matrix（a）

本研究中，第一主成分為64.70%，第二主成分為14.80%，二者包含了原始信息量的79.50%。由圖2（a）可以直觀地看出美拉德反應(yīng)體系揮發(fā)性成分與PC1 和PC2 的關(guān)系：編號(hào)為19 及1，2，3，4，5，6，7，14 的樣品分別分布在PC1 和PC2 構(gòu)成的第一、第四區(qū)間，表明該反應(yīng)條件下的美拉德體系產(chǎn)生的揮發(fā)性成分醇類、芳香族、脂肪族及烴類化合物相對較多，含量相對較高。編號(hào)為8，12，15，16，17，18，20 的樣品分布在PC1 和PC2 構(gòu)成的第二區(qū)間，表明該類樣品硫化合物含量相對較高，可能是來源于磷酸鹽中含有微量的雜質(zhì)硫元素與產(chǎn)物之間發(fā)生復(fù)雜反應(yīng)導(dǎo)致。編號(hào)為9，10，11，13，21，22，23，24 的樣品依次分布在PC1 和PC2 構(gòu)成的第三區(qū)間，表明這4 種樣品產(chǎn)生的揮發(fā)性成分相對較低，或者生成的產(chǎn)物之間相互反應(yīng)又生成了不易揮發(fā)的物質(zhì)。

第三主成分包含了原始信息量的11.33%，由圖2（b）可知各反應(yīng)條件下美拉德反應(yīng)體系揮發(fā)性成分與PC1 和PC3 的關(guān)系：編號(hào)為1，2，4，5，7，14 的樣品分布在PC1 和PC3 構(gòu)成的第一區(qū)間，表明生成的揮發(fā)性成分主要為醇類、芳香族、脂肪族及烴類化合物，此外硫化合物的含量也較高。編號(hào)為8，9，10，11，12，13，15，16 的樣品分布在PC1 和PC3 構(gòu)成的第二區(qū)間，表明揮發(fā)性成分以硫化合物含量相對較高，其來源可能是由磷酸鹽中含有的微量硫元素與產(chǎn)物相互反應(yīng)生成。編號(hào)為17，18，20，21，22，23，24 的樣品分布在PC1 和PC3 構(gòu)成的第三區(qū)間，表明生成的揮發(fā)性成分相對較少，或產(chǎn)物之間相互反應(yīng)生成了不易揮發(fā)的物質(zhì)而電子鼻無法識(shí)別。編號(hào)為19 的樣品分布在PC1 和PC3 構(gòu)成的第四區(qū)間，表明該條件下生成的揮發(fā)性成分所屬種類較多，且含量相對較高。

圖2 旋轉(zhuǎn)后的主成分載荷圖Fig.2 Biplot of rotated principal component analysis （PCA）

2.3.3 聚類分析 實(shí)際問題中，樣本對象往往具有多種特征，要想實(shí)現(xiàn)對其作出全面綜合性地分析，通常需要針對樣本所具有多種特征進(jìn)行分類，而聚類分析就是一種可以根據(jù)樣本特征的相似程度逐漸聚合，最終實(shí)現(xiàn)按照類別的綜合性質(zhì)完成聚類分析的方法。實(shí)際應(yīng)用中簡便、 分類效果較好。本研究在主成分分析的基礎(chǔ)上，采用SPSS13.0軟件，以類間平均距離（Between-groups linkage）作為測量方法，對提取的3 大主成分作為綜合指標(biāo)進(jìn)行聚類分析。

圖3中“0～25”的標(biāo)度是將各類檢測對象的不同評價(jià)指標(biāo)，按照統(tǒng)一尺度映射后的結(jié)果。當(dāng)標(biāo)度距離一定時(shí)，不同類別樣品間差異較小，谷氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系的香氣輪廓相似度較大，可聚為一類。由圖3所示，當(dāng)標(biāo)度為5 時(shí)，可將該體系24 類香氣成分聚為5 類。其中，第一大類包含7 種，占總種類數(shù)的29.17%，第二大類包含8種，占總種類數(shù)的33.33%，第三大類有1 種，占總種類的4.17%，第四、五大類各有4 種，均占總種類數(shù)的16.67%。對比主成分分析各類樣品分布結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聚類分析與PC1 和PC2 以及PC1 和PC3的主成分分析結(jié)果基本一致，可相互印證、互為補(bǔ)充。

2.4 反應(yīng)溫度和時(shí)間對美拉德反應(yīng)體系葡萄糖濃度的影響

圖3 聚類分析圖Fig.3 Dendrogram of hierarchical cluster analysis

根據(jù)動(dòng)力學(xué)原則，任何反應(yīng)的反應(yīng)程度均可以通過監(jiān)測反應(yīng)物的減少或反應(yīng)產(chǎn)物的增加來描述[14]。由表8可知，在同一溫度下，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長葡萄糖含量逐漸減少，且在0～40 d 時(shí)反應(yīng)時(shí)間對葡萄糖濃度的減少存在顯著性差異（P<0.05）。當(dāng)反應(yīng)至50，60 d 時(shí)，雖然各溫度下葡萄糖濃度仍然降低，但是，葡萄糖濃度減少較小，不具有顯著性差異，推測此時(shí)反應(yīng)速率較低或谷氨酸過量不再發(fā)生反應(yīng)。在同一時(shí)間下，10，20 d 時(shí)不同溫度下葡萄糖濃度減少，但無顯著性差異，反應(yīng)至30，40 d 時(shí)，隨著反應(yīng)溫度的升高，葡萄糖濃度減幅較大，且具有顯著性差異（P<0.05）。反應(yīng)至60 d 時(shí)雖然具有顯著性差異，但是差異較小，究其原因可能是新生成的產(chǎn)物與葡萄糖發(fā)生進(jìn)一步反應(yīng)導(dǎo)致葡萄糖含量降低。此外，在50 d 時(shí)，不同反應(yīng)溫度下葡萄糖濃度無顯著性差異，推測此時(shí)體系中美拉德反應(yīng)速率非常小或者已不發(fā)生反應(yīng)。整體而言，反應(yīng)至50 d 時(shí)，推斷美拉德反應(yīng)體系反應(yīng)速率較小或者由于葡萄糖含量的減少谷氨酸過量二者不再發(fā)生反應(yīng)。

表8 谷氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系葡萄糖濃度變化Table 8 Changes in glucose concentration of glutamic acid and glucose Maillard reaction system

2.5 谷氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系反應(yīng)底物葡萄糖含量動(dòng)力學(xué)模型研究

為探究溫和條件下谷氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系葡萄糖殘余含量與反應(yīng)時(shí)間及溫度的關(guān)系，針對HPLC 法測定反應(yīng)物葡萄糖的殘余量，采用Origin8.0 軟件中的非線性函數(shù)進(jìn)行擬合，構(gòu)建動(dòng)力學(xué)方程。根據(jù)Origin8.0 軟件中各個(gè)模型的擬合參數(shù)及相關(guān)系數(shù)R2、 殘差進(jìn)行分析，最終確定Boltzmann 模型較為理想。本試驗(yàn)中構(gòu)建的各個(gè)溫度下，葡萄糖含量隨時(shí)間變化的Boltzmann 模型的R2均大于0.90（R2越接近1 表示擬合度越好），且殘差結(jié)果分布較均勻，認(rèn)為擬合性能最佳。Boltzmann 模型動(dòng)力學(xué)方程為：y=A2+（A1-A2）/（1+exp（（x-x0）/dx）），以下是針對各個(gè)反應(yīng)溫度下葡萄糖濃度（g/L）隨時(shí)間變化符合的具體動(dòng)力學(xué)方程：

y1= 3.33+0.29/{1+exp〔（x-24.98）/12.41〕}（R2=0.9875）

y2= 3.31+0.26/{1+exp〔（x-26.31）/5.55〕}（R2=0.9602）

y3= 3.24+0.41/{1+exp〔（x-25.25）/15.09〕}（R2=0.9456）

y4= 3.30+0.31/{1+exp〔（x-20.29）/8.87〕}（R2=0.9305）

注：y1——10 ℃下葡萄糖殘余量；y2——20 ℃下葡萄糖殘余量；y3——30 ℃下葡萄糖殘余量；y4——40 ℃下葡萄糖殘余量。

圖4 葡萄糖濃度隨時(shí)間變化的Boltzmann 曲線Fig.4 The Boltzmann curve of glucose concentration change with time

同理，經(jīng)反復(fù)篩選最終確定各個(gè)時(shí)間下，葡萄糖含量隨溫度變化情況也遵循Boltzmann 模型。各個(gè)反應(yīng)時(shí)間下葡萄糖質(zhì)量濃度（g/L）隨溫度變化符合的具體動(dòng)力學(xué)方程如下所示：

Z1=3.35+774.30/{1+exp〔（x+88.34）/10.85〕}（R2=0.9702）

Z2= 3.36+0.22/{1+exp〔（x-9.42）/0.47〕}（R2=0.9138）

Z3= 3.32+17.16/{1+exp〔（x+22.02）/5.27〕}（R2=0.9817）

Z4=3.27+205.27/{1+exp〔（x+47.36）/7.28〕}（R2=0.9912）

注：Z1——30 d 下葡萄糖殘余量；Z2——40 d下葡萄糖殘余量；Z3——50 d 下葡萄糖殘余量；Z4——60 d 下葡萄糖殘余量。10，20 d 時(shí)葡萄糖濃度隨溫度變化動(dòng)力學(xué)擬合效果較差，不能較好地構(gòu)建符合動(dòng)力學(xué)方程，在此不再列出。

3 討論

反應(yīng)介質(zhì)的pH 對葡萄糖和氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)的活性形式具有決定性作用。發(fā)生美拉德反應(yīng)的前提要求還原糖呈開鏈?zhǔn)?，氨基化合物是非質(zhì)子化合物，羰基和氨基隨著反應(yīng)體系H+濃度的變化發(fā)生不同程度的離子化，在酸性體系中，氨基質(zhì)子化無法進(jìn)行親核進(jìn)攻，羰-氨的親核加成難度較大，含氮物質(zhì)的種類和產(chǎn)量都比較低，易于發(fā)生糖的異構(gòu)體和脫水反應(yīng)，產(chǎn)生糠醛類物質(zhì)。本試驗(yàn)中整個(gè)階段美拉德體系反應(yīng)發(fā)生的介質(zhì)環(huán)境基本穩(wěn)定，推斷其可能原因是體系中谷氨酸過量，并且體系pH 值較低，因而多余的谷氨酸并未參加反應(yīng)。這與曾茂茂等人[15]的研究結(jié)果較為一致，后期可以設(shè)置不同的濃度比進(jìn)行驗(yàn)證。

圖5 葡萄糖濃度隨溫度變化的Boltzmann 曲線Fig.5 The Boltzmann curve of glucose concentration with temperature

美拉德反應(yīng)是食品色澤、 風(fēng)味的重要來源之一。本試驗(yàn)中，模式體系美拉德反應(yīng)294 nm 處的吸光度值隨著溫度的升高、 反應(yīng)時(shí)間的延長逐漸增大，與溫度、時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系，表明美拉德反應(yīng)初始階段無顏色中間產(chǎn)物的生成量較大。360 nm 處的吸光度值隨著溫度的升高呈先增大后趨于平緩的趨勢，推測可能是一方面美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為類黑精等終產(chǎn)物，另一方面隨著加熱時(shí)間的延長，新生成的產(chǎn)物發(fā)生分解或合成其它物質(zhì)。本試驗(yàn)結(jié)果與趙謀明[16]、胡禮[17]研究結(jié)果較一致。

本試驗(yàn)針對模式體系中揮發(fā)性成分確定樣本與“變量”間的聯(lián)系，結(jié)合聚類分析原理，對各反應(yīng)條件下的谷氨酸-葡萄糖美拉德體系揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，最終以聚為5 類較為恰當(dāng)，其中以30℃，50 d（編號(hào)19 的樣品）時(shí)的樣本中檢測到的揮發(fā)性成分較多，推斷該條件可能是反應(yīng)的“拐點(diǎn)”，其它條件下體系中的揮發(fā)性成分檢測量較低，可能是反應(yīng)體系中的揮發(fā)性成分的確較少，反應(yīng)程度較小，也可能是反應(yīng)生成的揮發(fā)性成分進(jìn)一步發(fā)生反應(yīng)生成了不易檢測的非揮發(fā)性物質(zhì)。

葡萄糖作為該模式體系中的反應(yīng)物之一，其含量的變化可以用于推斷該反應(yīng)進(jìn)行的程度。由表8結(jié)果可知，在不同的反應(yīng)溫度條件下，模式體系中葡萄糖的含量均隨著反應(yīng)時(shí)間的延長逐漸降低，且溫度越高葡萄糖含量降低越快。這一結(jié)果與李伶俐[18]高溫條件下的研究結(jié)果基本一致。此外，為探究溫和條件下谷氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系葡萄糖殘余含量與反應(yīng)時(shí)間及溫度的關(guān)系，采用Origin8.0 構(gòu)建動(dòng)力學(xué)方程，擬合效果較佳。

4 結(jié)論

谷氨酸-葡萄糖模式美拉德反應(yīng)始終在酸性條件下進(jìn)行，發(fā)生美拉德反應(yīng)的介質(zhì)環(huán)境總體穩(wěn)定 （pH 值始終在5.0 左右），反應(yīng)產(chǎn)物量（A294nm，A360nm）與溫度和時(shí)間呈正相關(guān)，各溫度、時(shí)間下葡萄糖含量變化符合Boltzmann 模型，符合動(dòng)力學(xué)方程y=A2+（A1-A2）/{1+exp〔（x-x0）/dx〕}，（R2均大于0.90），擬合效果較佳。