戚向陽 孟 珂 章 棋 劉合生 柳云麗 喻柯柯 陳秋平 曹少謙

（浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院 浙江寧波315100）

Ⅱ型糖尿病是一種典型的代謝綜合癥，可誘發(fā)機(jī)體多種代謝異常。有研究表明，胰島β 細(xì)胞功能受損和凋亡是糖尿病發(fā)病的主要誘因[1-3]，而糖脂毒性是損傷胰島β 細(xì)胞功能的重要原因[4-5]。研究表明，高糖損傷胰島β 細(xì)胞的機(jī)制之一是抑制胰島素基因轉(zhuǎn)錄因子Pdx-1 的活性及其表達(dá)水平[6]。Pdx-1 在胰腺發(fā)育、胰島β 細(xì)胞分化及維持成熟胰島β 細(xì)胞正常功能方面起著關(guān)鍵作用，可調(diào)節(jié)胰島β 細(xì)胞葡萄糖激酶基因、 葡萄糖轉(zhuǎn)運子GLUT-2 的表達(dá)[7]。Pdx-1 表達(dá)受損可誘發(fā)高血糖及血脂異常[8]。動物實驗[9]表明，糖尿病鼠的持續(xù)高血糖可明顯抑制Pdx-1 基因和胰島素基因表達(dá)，降低Pdx-1 轉(zhuǎn)錄因子與胰島素基因啟動子結(jié)合能力，降低胰島素分泌量。此外，Pdx-1 還調(diào)控其它與胰島素分泌相關(guān)基因的表達(dá)，影響β 細(xì)胞的葡萄糖刺激的胰島素分泌功能（GSIS）及胰島素分泌時相的改變[10]。上調(diào)Pdx-1 蛋白表達(dá)，減弱INS-1細(xì)胞糖脂毒性，是保護(hù)胰島β 細(xì)胞和緩解糖尿病患者癥狀的一種有效途徑。

目前市場上降糖藥物種類繁多，可是均對人體具有一定毒副作用。有研究發(fā)現(xiàn)許多天然產(chǎn)物，尤其是多酚類化合物具有明顯的降血糖作用。如茶多酚可以降低餐后高血糖，調(diào)節(jié)血脂，緩解胰島素抵抗[11]。天竺桂提取物中的B-型多酚具有一定的降血糖活性，可保護(hù)棕櫚酸或H2O2誘導(dǎo)損傷的INS-1 細(xì)胞。楊梅花色苷能減少H2O2誘導(dǎo)的胰島INS-1 細(xì)胞的凋亡和壞死，減少細(xì)胞內(nèi)過量ROS的產(chǎn)生，同時能減少自噬性細(xì)胞的死亡[12]。然而，有關(guān)楊梅多酚化合物對高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的胰島β 細(xì)胞凋亡和功能受損的保護(hù)作用尚未見有關(guān)文獻(xiàn)。本文以胰島β 細(xì)胞INS-1 細(xì)胞作為試驗對象，探討楊梅多酚提取物對高糖誘導(dǎo)INS-1 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用以及對Pdx-1 轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平的影響，為天然安全的降糖功能因子的篩選提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

INS-1 細(xì)胞，上海基免實業(yè)有限公司。RPMI 1640 培養(yǎng)基，北京Hyclone 公司；β-巰基乙醇，美國Gibco 公司；丙酮酸鈉、 葡萄糖、MTT、Hoechst 33342、吖啶橙（PI）、臺盼藍(lán)及胰蛋白酶，美國Sigma 公司；胎牛血清，北京全式金生物技術(shù)有限公司；二甲亞砜（細(xì)胞培養(yǎng)級），北京索萊寶科技有限公司；青霉素-鏈霉素溶液，江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、細(xì)胞與組織裂解液（P1003）、actin 抗體、Pdx-1 抗體（Cell Signaling Technology）、HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠lgG （H+L）、Anti-rabbit lgG HRP-Linked 抗 體 及30%Acr-Bis（29∶1），江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；脫脂奶粉原產(chǎn)地美國；NaCl 注射液（生理鹽水）、定影粉、顯影粉、四甲基乙二胺、超敏發(fā)光液、甲醇、吐溫20、正丁醇、氫氧化鈉、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、二甲亞砜、異丙醇等，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器及設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱，日本三洋公司；熒光倒置顯微鏡，日本Nikon 公司；96 孔板離心機(jī)及自動混勻器，德國Eppendorf 公司；通用酶標(biāo)儀，美國Thermo 公司；電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 楊梅多酚提取物的制備 稱取一定量的楊梅果實，去核，以質(zhì)量體積比1∶2 的比例加入丙酮溶劑，利用超聲波溶劑提取法重復(fù)提取3～4 次，至提取液顏色幾乎為白色，旋蒸去除溶劑。再以60%的乙醇水溶液為洗脫劑過LXA-8 大孔樹脂，收集洗脫液，再旋蒸去除洗脫劑，冷凍干燥得楊梅多酚粗提物粉末。其總酚含量為65.52%。

1.3.2 細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng) 取出液氮罐中凍存的胰島INS-1 細(xì)胞于37 ℃水浴中快速解凍。無菌條件下打開螺蓋，將細(xì)胞吸入無菌離心管中，加1～2 mL 含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，1 000 r/min 離心5 min 后棄上清液，加5 mL 培養(yǎng)液重懸，反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的INS-1 專用培養(yǎng)基中，于37 ℃，飽和濕度，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底面的70%～90%時，即可以用0.125%的胰蛋白酶消化，傳代擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.3.3 MTT 法檢測INS-1 細(xì)胞活性 取一定量細(xì)胞培養(yǎng)液，在待測細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT 溶液，37 ℃孵育4 h 至有藍(lán)紫色結(jié)晶析出，3 000 r/min 離心10 min，棄去上清液，每孔加入100 μL 二甲亞砜，400 r/min 振蕩10 min使甲瓚結(jié)晶溶解，酶標(biāo)儀檢測492 nm 波長處的吸光度。按下式計算細(xì)胞成活率：

細(xì)胞成活率（%）= OD 值/OD0值×100

式中，OD——不同處理組的吸光值；OD0——對照組的吸光值。

1.3.4 Hoechst 33342/PI 雙染觀察INS-1 細(xì)胞凋亡和壞死 取一定量細(xì)胞培養(yǎng)液，棄上清液，用PBS 清洗2 次，每次3 min。分別加入500 μL 5 μg/mL Hoechst 33342 和500 μL 5 μg/mL PI 工作液，室溫孵育15 min。染色后磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2 次，每次3 min，吸棄上清，熒光顯微鏡觀察：用紫外光濾光片 （UV） 觀察Hoechst 33342 染色情況，凋亡細(xì)胞呈亮藍(lán)色熒光，正常細(xì)胞呈弱藍(lán)色熒光。用綠光濾光片（G）觀察PI 染色情況，晚期凋亡和壞死細(xì)胞呈亮紅色熒光，正常細(xì)胞呈現(xiàn)弱紅色熒光。

1.3.5 高糖及楊梅多酚提取物對胰島細(xì)胞活性的影響 取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，按1.2×104cell/孔接種于96 孔板，CO2培養(yǎng)箱中5%CO2，37 ℃培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)液。分別設(shè)置對照組（CON）、不同濃度的高糖損傷組（HG 組），不同濃度的樣品組（Sample）。根據(jù)試驗分組對細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，其中，CON 組：加入200 μL 完全培養(yǎng)基；HG組：加入200 μL 不同濃度（16，20，25，40 mmol/L）HG；Sample 組：分別加入200 μL 0.1～200 μg/mL的楊梅多酚提取物。然后置于37 ℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時間，每組設(shè)3 個平行。各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，按MTT 法檢測INS-1 細(xì)胞活性。

1.3.6 楊梅多酚提取物對糖毒性損傷細(xì)胞活性的保護(hù)作用 分別設(shè)置對照（CON）組、高糖模型組（HG 組）、樣品（Sample）組，并根據(jù)試驗分組對細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。CON 組：加入200 μL 完全培養(yǎng)基；HG 組：加入100 μL 50 mmol/L HG 和100 μL 完全培養(yǎng)基，使體系中HG 終濃度25 mmol/L；Sample 組：分別加入100 μL 50 mmol/L HG 和100 μL 初始質(zhì)量濃度為1，2，6，10，20，40 μg/mL 楊梅多酚提取物，放置于37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每組設(shè)3 個平行。各組細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后，按MTT 法測定INS-1 細(xì)胞活性。

1.3.7 楊梅多酚提取物對糖毒性損傷細(xì)胞凋亡和壞死的影響 取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，按2×105cell/孔接種于12 孔板，于CO2培養(yǎng)箱中5%CO2，37 ℃培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)液。分別設(shè)置對照 組（CON 組）、高糖模型組（HG 組）、樣品組（Sample 組），根據(jù)試驗分組對細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)：CON組：加入2 mL 完全培養(yǎng)基；HG 組：加入1 mL 50 mmol/L HG 和1 mL 完全培養(yǎng)基，使體系最終含25 mmol/L HG；Sample 組：分別加入1 mL 50 mmol/L HG 和1 mL 初始質(zhì)量濃度為1，2，6，10，20，40 μg/mL CBE。放置于37 ℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每組設(shè)3 個平行。各組損傷結(jié)束后，按Hoechst 33342/PI 雙染法觀察細(xì)胞。

1.3.8 Western blot 檢測Pdx-1 蛋白的表達(dá) 按2.7 方法進(jìn)行試驗分組并對細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，各組損傷結(jié)束后，棄上清液，用PBS 清洗2 次，每次約3 min。每孔分別加入100 μL 細(xì)胞裂解液，反復(fù)吹吸使細(xì)胞充分裂解，全部吸出，置于冰上凍融30 min，然后在4 ℃、13 000 r/min 離心30 min，離心后取上清液按BCA 試劑盒法分析蛋白質(zhì)含量。

采用BIO-RAD 電泳儀進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，聚丙烯酰胺凝膠分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%，在凝膠的一端加樣孔內(nèi)加入預(yù)染蛋白分子Marker，在中間各孔加入8～20 μL 蛋白樣品，每孔總蛋白上樣量保持一致，采用60 V 恒壓進(jìn)行濃縮膠電泳，90 V 恒壓進(jìn)行分離膠的電泳。然后通過轉(zhuǎn)印系統(tǒng)使蛋白從凝膠上轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC）上，置于5%脫脂奶粉中室溫封閉0.5～1 h。加一抗（小鼠Pdx-1 抗體，稀釋比例為1 ∶1 000）4℃孵育過夜后，棄一抗，用TBST 洗膜1 h。再加二抗（HRP 二抗，1 ∶1 000）室溫孵育1 h，棄二抗，用TBST 洗膜1 h。加入ECL 化學(xué)發(fā)光液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時立即放入雙蒸水中終止反應(yīng)，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高糖對INS-1 細(xì)胞活力的影響

如圖1所示，不同濃度的高糖均能顯著降低INS-1 細(xì)胞的成活率，且成活率隨高糖濃度及損傷時間的變化呈現(xiàn)出不同的變化。INS-1 細(xì)胞用16，20，25，40 mmol/L 的高糖溶液損傷36 h 后，與對照組相比，細(xì)胞活力隨著高糖濃度的升高逐漸下降。當(dāng)INS-1 細(xì)胞用HG 損傷48 h 后，細(xì)胞活力分別為82.323%±2.71%，74.319%±3.209%，70.811%±3.279%，44.341%±0.918%。MTT 試驗結(jié)果證明了高糖刺激導(dǎo)致INS-1 細(xì)胞的活性受到抑制和影響。采用高糖濃度25 mmol/L 損傷48 h 時，細(xì)胞的損傷達(dá)到30%左右，若損傷時間進(jìn)一步延長，雖然細(xì)胞活力進(jìn)一步降低，但對對照組影響較大，營養(yǎng)物質(zhì)的消耗會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此綜合試驗結(jié)果，選擇25 mmol/L，HG 損傷48 h 作為高糖模型的試驗條件。

圖1 高糖對INS-1 細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effects of high glucose on INS-1 cell viability

2.2 楊梅多酚提取物對INS-1 細(xì)胞生長的影響

楊梅多酚提取物在0.1～20 μg/mL 范圍內(nèi)對細(xì)胞生長有明顯促進(jìn)作用，當(dāng)提取物質(zhì)量濃度高于20 μg/mL，INS-1 細(xì)胞的活性隨楊梅多酚提取物濃度的增加而逐漸降低，高濃度的楊梅多酚提取物對INS-1 細(xì)胞的生長均有明顯的抑制作用（圖2）。因此，選定質(zhì)量濃度范圍為0～20 μg/mL的楊梅多酚提取物研究其對糖毒性損傷細(xì)胞活性的保護(hù)作用。

2.3 楊梅多酚提取物對高糖損傷INS-1 細(xì)胞活力的影響

如圖3所示，高糖損傷模型組細(xì)胞活性下降69.333%，在試驗的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（0.5～20 μg/mL），楊梅多酚提取物對HG 誘導(dǎo)損傷的INS-1 細(xì)胞均有保護(hù)作用，以質(zhì)量濃度5 μg/mL 的保護(hù)效

圖2 楊梅多酚提取物對細(xì)胞活性的影響Fig.2 The effects of Chinese bayberry polyphenol extract on the INS-1 cell viability

2.4 楊梅多酚提取物對高糖誘導(dǎo)INS-1 細(xì)胞凋亡和壞死的影響

圖4及圖5分別表示楊梅多酚提取物對高糖誘導(dǎo)INS-1 細(xì)胞凋亡和壞死的影響。對照組只有極少數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)亮熒光，高糖損傷組被染成亮熒光的細(xì)胞數(shù)目明顯增多，不同質(zhì)量濃度的楊梅多酚提取物干預(yù)組呈亮熒光的細(xì)胞數(shù)目相比HG 損傷組顯著減少。表明HG 對INS-1 細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，使正常細(xì)胞發(fā)生凋亡并進(jìn)一步發(fā)展到細(xì)胞壞死，在此試驗的質(zhì)量濃度范圍內(nèi) （0.5～20 μg/mL），楊梅多酚提取物的干預(yù)對HG 損傷的INS-1細(xì)胞有顯著的保護(hù)作用，以質(zhì)量濃度5 μg/mL 的保護(hù)效果較好。且低、中質(zhì)量濃度（0.5～5 μg/mL）楊梅多酚提取物對糖毒性誘導(dǎo)的INS-1 細(xì)胞凋亡及壞死的保護(hù)作用隨著CBE 質(zhì)量濃度的增加保護(hù)作用增強(qiáng)，然而在5～20 μg/mL 范圍內(nèi)，CBE 對細(xì)胞的保護(hù)作用沒有劑量-效應(yīng)關(guān)系。

2.5 楊梅多酚提取物對Pdx-1 表達(dá)水平的影響

采用Western blot 試驗觀察楊梅多酚提取物處理后的Pdx-1 蛋白表達(dá)水平，如圖6所示，對比果較好，與損傷組相比，細(xì)胞活性上升了14.078%。且在低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（0.5～5 μg/mL），楊梅多酚提取物的保護(hù)作用與質(zhì)量濃度之間呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，推測楊梅多酚提取物對“糖毒性” 損傷的INS-1 細(xì)胞的保護(hù)作用與楊梅多酚提取物促進(jìn)細(xì)胞增殖生長作用之間存在密切聯(lián)系。HG 損傷組，在0.5～5 μg/mL 范圍內(nèi)，Pdx-1 蛋白表達(dá)水平隨著楊梅多酚提取物作用濃度增加逐漸提高。前面的研究發(fā)現(xiàn)楊梅多酚提取物對HG 誘導(dǎo)損傷的INS-1 細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用，Western blot 試驗結(jié)果表明這種保護(hù)作用可能是通過上調(diào)Pdx-1 蛋白的表達(dá)，刺激胰島β 細(xì)胞的增值與分化，進(jìn)而增加胰島素的分泌來實現(xiàn)的。

圖3 楊梅多酚提取物對高糖誘導(dǎo)INS-1 細(xì)胞損傷的影響Fig.3 The effects of Chinese bayberry polyphenol extracts on INS-1 cell injured by HG

3 結(jié)論與討論

圖4 楊梅多酚提取物對高糖誘導(dǎo)INS-1 細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 The effects of Chinese bayberry polyphenol extracts on INS-1 cell apoptosis injured by HG

圖5 楊梅多酚提取物對高糖誘導(dǎo)INS-1 細(xì)胞壞死的影響Fig.5 The effects of Chinese bayberry polyphenol extracts on INS-1 cell necrocytosis injured by HG

圖6 Western blot 檢測Pdx-1 蛋白表達(dá)水平Fig.6 Pdx-1 protein expression levels analysis by Western blot

有研究表明糖毒性可以通過減少胰島β 細(xì)胞的數(shù)量，抑制胰島素基因的表達(dá)，來降低胰島素的合成和分泌量[13]。本試驗以大鼠胰島β 細(xì)胞系INS-1 細(xì)胞作為試驗對象，首先探討了楊梅多酚提取物對胰島細(xì)胞活性的影響，發(fā)現(xiàn)楊梅多酚提取物在0.1～20 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，對正常胰島細(xì)胞生長有明顯的促進(jìn)作用，而高質(zhì)量濃度的楊梅多酚提取物（≧20 μg/mL）對INS-1 細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用。該結(jié)果與張波[11]研究結(jié)果一致，其研究發(fā)現(xiàn)低濃度楊梅花色苷能顯著促進(jìn)INS-1 胰島細(xì)胞增殖，而高濃度則抑制細(xì)胞增殖。這是否是由于楊梅多酚化合物在INS-1 增殖過程產(chǎn)生有毒代謝產(chǎn)物還有待進(jìn)一步探討。同時，本試驗還以25 mmol/L 葡萄糖損傷48 h 作為糖毒性損傷條件，模擬機(jī)體內(nèi)血糖代謝紊亂導(dǎo)致的胰島素抵抗環(huán)境，研究楊梅多酚提取物對糖毒性造成細(xì)胞活性下降，細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞壞死是否具有保護(hù)作用。結(jié)果表明，高糖損傷組細(xì)胞活性下降至69.3%，在所試驗的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（0.5～20 μg/mL），楊梅多酚提取物對HG 誘導(dǎo)損傷的INS-1 細(xì)胞有保護(hù)作用，且楊梅多酚提取物在低質(zhì)量濃度（0.5～5 μg/mL）范圍內(nèi)保護(hù)作用呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，與損傷組相比，5 μg/mL 楊梅多酚提取物對INS-1 細(xì)胞活性的保護(hù)作用最好，可達(dá)14%以上。熒光染色結(jié)果證實楊梅多酚提取物對高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和壞死具有保護(hù)作用，且在低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（0.5～5 μg/mL），楊梅多酚提取物對高糖誘導(dǎo)的INS-1 細(xì)胞凋亡和壞死的保護(hù)作用，隨質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)。同時，本研究還證實楊梅多酚提取物能顯著上調(diào)Pdx-1 蛋白的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)黃連素可通過增加細(xì)胞Pdx-1 的表達(dá)水平，改善高糖高脂對細(xì)胞的損害作用，其可能機(jī)制為上調(diào)Pdx-1 表達(dá)水平，增強(qiáng)胰島素、GLUT-2 基因的轉(zhuǎn)錄活性，改善胰島細(xì)胞功能[14]。據(jù)報道，紅薯葉黃酮能改善四氧嘧啶糖尿病小鼠胰腺Pdx-1的表達(dá)水平，增強(qiáng)胰島β 細(xì)胞的分泌胰島素能力，降低血糖[15]。也有文獻(xiàn)報道，胰島β 細(xì)胞數(shù)量的增多有利于增加胰島素分泌量，從而改善糖尿病的糖代謝異常[16]。結(jié)合本試驗研究結(jié)果，推測楊梅多酚化合物對HG 誘導(dǎo)的INS-1 細(xì)胞的保護(hù)作用可能通過上調(diào)Pdx-1 表達(dá)水平，刺激胰島β 細(xì)胞的增值與分化，增強(qiáng)胰島素分泌能力而實現(xiàn)。