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        親水性色譜檢測水產(chǎn)品中6種ATP關(guān)聯(lián)化合物

        2019-05-18 06:14:14張慧恩王彩霞
        中國食品學(xué)報(bào) 2019年4期
        關(guān)鍵詞:關(guān)聯(lián)

        張慧恩 王彩霞 楊 華*

        (1 浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院 浙江寧波315100 2 寧波御坊堂生物科技有限公司 浙江寧波315100)

        新鮮度是水產(chǎn)品的重要評(píng)價(jià)指標(biāo),目前衡量水產(chǎn)品新鮮度最常用的指標(biāo)是K 值。K 值是以水產(chǎn)品體內(nèi)核苷酸在降解過程中產(chǎn)生的一系列化合物作為指標(biāo)的鮮度判定方法[1]。活體水產(chǎn)品的肌肉運(yùn)動(dòng)和生理代謝都需要來自三磷酸腺苷(ATP)轉(zhuǎn)化提供的能量,而水產(chǎn)品死后其體內(nèi)所含的ATP在酶和微生物的共同作用下會(huì)降解為二磷酸腺苷(ADP)、腺苷酸(AMP)、肌苷酸(IMP)、次黃嘌呤核苷(HxR)和次黃嘌呤(Hx)[2]。K 值就是次黃嘌呤核苷(HxR)、次黃嘌呤(Hx)量之和與ATP 及降解產(chǎn)物總量的百分比[3]。K 值的大小,能反映魚體在死亡至自溶階段的新鮮程度,是水產(chǎn)品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要鮮度指標(biāo)[4-5]。準(zhǔn)確測定水產(chǎn)品中ATP 關(guān)聯(lián)化合物對水產(chǎn)品的鮮度評(píng)價(jià)具有重要意義。

        目前,K 值的測定方法主要通過各種分離手段,測定樣品中各ATP 關(guān)聯(lián)化合物的含量。常見的分離手段有毛細(xì)管電泳法[6-7]、離子色譜法[8]、反相高效液相色譜法[9-10]等。毛細(xì)管電泳對ATP 關(guān)聯(lián)化合物的分辨率較高,而儀器昂貴;離子色譜法在分離過程中分離柱需要長時(shí)間平衡,分析時(shí)間長;反相高效液相色譜法具有操作簡單,儀器普及等優(yōu)點(diǎn),如水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC/T3048-2014 魚類鮮度指標(biāo)K 值的測定就是用反相高效液相色譜法測定,然而傳統(tǒng)的反相高效液相色譜法分離核苷酸種類有限,特別是對ATP 關(guān)聯(lián)化合物分析測定時(shí),往往各組分之間的分離度較低,達(dá)不到完全分離的效果。目前,也有研究在反相高效液相色譜法中引入離子對試劑以提高分離效果[11-12],然而離子對試劑的引入極易污染色譜柱,對色譜柱損耗較大,流動(dòng)相平衡時(shí)間長,特別影響分析結(jié)果的重現(xiàn)性。而親水性色譜(HILIC)能夠增強(qiáng)極性物質(zhì)在色譜中保留,從而提高分離效果[13]。親水性色譜通過強(qiáng)極性固定性,結(jié)合高比例有機(jī)相/低比例水相組成的流動(dòng)相來實(shí)現(xiàn)極性化合物的分離。傳統(tǒng)的反相色譜對強(qiáng)極性和親水性的小分子物質(zhì)的保留和分離能力較弱,通常流動(dòng)相需要采用高比例的水相才能實(shí)現(xiàn)其保留,然而高比例的水相會(huì)導(dǎo)致一系列問題,比如固定相鍵合基團(tuán)的脫落和反浸潤。親水性色譜對親水性化合物有較強(qiáng)的保留能力,對親水性化合物和極性化合物有廣泛的選擇性[14]。非常適用于分離測定ATP 關(guān)聯(lián)化合物這類極性化合物。本研究利用親水性色譜,建立了水產(chǎn)品中6 種ATP 關(guān)聯(lián)化合物的測定方法。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        銀鯧(Pampus argenteus),寧波路林市場,-80℃保存。

        標(biāo)準(zhǔn)品ATP、ADP、AMP、Hx、HxR、IMP,源葉生物;乙腈為Merck 色譜純;磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、高氯酸、氫氧化鉀(均為分析純級(jí)),國藥集團(tuán)。

        1.2 儀器與設(shè)備

        Waters 2695 高效液相色譜儀;Waters 2998二極管陣列檢測器;JY92-ⅡDN 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī),寧波新芝;QL-861 漩渦振蕩儀,海門其林貝爾;冷凍離心機(jī)(eppendorf 5810R),艾本德公司;天平(Sartorius BSA124S),賽多利斯公司;pHS-3E pH 計(jì),上海雷磁;色譜柱 BEH Amide(4.6 mm×250 mm,5 μm),Waters 公司;Athena C18 (4.6 mm×250 mm,5 μm),安譜實(shí)驗(yàn)科技公司。

        1.3 樣品處理

        將魚背脊上的去皮魚肉均質(zhì)后,取2.00 g,放入50 mL 離心管中,加入預(yù)冷的20 mL 高氯酸溶液(10%),渦旋混勻,冰浴超聲裂解提取5 min。在4 ℃下離心8 000 r/min,10 min,取出上清液。再用10 mL 高氯酸溶液(10%)提取沉淀物,離心,合并上清液,用KOH 溶液將其中和至pH 6.5。先用10 mol/L KOH 溶液,接近至所需的pH 時(shí),改用1 mol/L 的KOH 溶液,用流動(dòng)相定容至50 mL,在4℃下離心8 000 r/min,15 min,0.22 μm 微孔濾膜過濾,待測。

        1.4 色譜條件

        反相色譜分析條件:色譜柱Athena C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:0.02 mol/L 磷酸二氫鉀和0.02 mol/L 磷酸氫二鉀(1 ∶1)用磷酸調(diào)節(jié)至pH 6.0;流速:1.0 mL/min;柱溫:35 ℃,檢測波長:254 nm。親水性色譜分析條件:色譜柱BEH Amide (4.6 mm×250 mm,5 μm)。流動(dòng)相:A 2.0 mmol/L 磷酸二氫鉀,B 乙腈,等度洗脫,A 20%,B 80%,流速:1.0 mL/min;柱溫:35 ℃,檢測波長:254 nm。

        1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液及標(biāo)準(zhǔn)曲線

        用流動(dòng)相配制標(biāo)準(zhǔn)系列混標(biāo)溶液,每種標(biāo)樣的濃度梯度為5.0,10.0,20.0,50.0,100.0,200.0 μmol/L,進(jìn)樣量10 μL,測定分析,根據(jù)保留時(shí)間定性,以峰面積與標(biāo)樣濃度做標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

        1.6 數(shù)據(jù)處理

        式中,M——樣品中ATP、ADP、AMP、Hx、HxR、IMP 含量(μmol/g);C——標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上計(jì)算得到的樣品中ATP、ADP、AMP、Hx、HxR、IMP含量(μmol/L);V——樣品定容體積(L);m——稱取的樣品質(zhì)量(g)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 樣品處理方法

        從食品或生物樣品中提取ATP 關(guān)聯(lián)化合物,最常用的方法是高氯酸提取[15]。我國水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC/T3048-2014 魚類鮮度指標(biāo)K 值的測定也選用此法,這是因?yàn)闃悠分械牡鞍踪|(zhì)在高氯酸中能夠很好的沉淀,減少蛋白質(zhì)對分析的干擾。然而,加入高氯酸后,樣品易形成塊狀不溶物,導(dǎo)致ATP關(guān)聯(lián)化合物不能完全釋放出來。采用冰浴超聲可使塊狀不溶物迅速分散,保證提取的目標(biāo)物充分進(jìn)入溶液中,提取液用KOH 中和后,4 ℃低溫放置2 h 可促進(jìn)高氯酸鉀析出,4 ℃下8 000 r/min,離心15 min 可將高氯酸鉀沉淀去除。

        2.2 色譜柱對分離效果的影響

        通過反相色譜柱對6 種化合物進(jìn)行分離,色譜條件參考水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC/T3048-2014,其中流動(dòng)相為0.02 mol/L 磷酸緩沖溶液pH 6.0。由于ATP 關(guān)聯(lián)化合物基本都帶有磷酸基團(tuán),結(jié)構(gòu)相似,極性較大,反相色譜柱未能對幾種物質(zhì)進(jìn)行分離,見圖1。其中ATP 與IMP、Hx 與AMP 分離度均未達(dá)到1.5。流動(dòng)相中不含有機(jī)相組分,這對反相色譜柱的使用和維護(hù)是非常不利的,在高水相的使用條件下色譜柱填料容易發(fā)生化學(xué)鍵合基團(tuán)的失效甚至脫落,單一流動(dòng)性的使用也使色譜分離過程中流動(dòng)相的作用被忽視,如在傳統(tǒng)反相色譜系統(tǒng)的流動(dòng)相中加入少量有機(jī)相(如甲醇或乙腈),將加大流動(dòng)相的洗脫能力,會(huì)使保留時(shí)間進(jìn)一步減小,物質(zhì)之間的分離效果將更差。

        親水性色譜柱因?yàn)楣潭ㄏ嘤袠O性官能團(tuán)修飾(如氨基、酰胺基等),所以對極性化合物保留強(qiáng),適合分離多肽、糖、核酸等物質(zhì)[16]。通過親水性色譜柱對6 種ATP 關(guān)聯(lián)化合物進(jìn)行分離,結(jié)果見圖2。親水性色譜對6 種ATP 關(guān)聯(lián)化合物進(jìn)行了較好的分離,與反相色譜相比,各物質(zhì)的出峰順序發(fā)生了變化,這是由于親水色譜與反相色譜的分離機(jī)理不同,在反相色譜中增大有機(jī)相比例,洗脫能力增強(qiáng),而在親水色譜中要增大水相比例,洗脫能力才增強(qiáng)。在親水色譜中ATP 的出峰最慢并且有些拖尾,這是由于ATP 分子帶有的磷酸基團(tuán)最多,極性最強(qiáng),親水色譜對其保留性最強(qiáng),各物質(zhì)的分離度均大于1.5。

        2.3 磷酸二氫鉀濃度的影響

        親水性色譜在分離時(shí)只使用單一成分的磷酸二氫鉀,而不用配制磷酸緩沖溶液,試驗(yàn)中分別配制了2.0,4.0,6.0,8.0 mmol/L 的磷酸二氫鉀溶液,流動(dòng)相為磷酸二氫鉀溶液20%,乙腈80%。結(jié)果顯示,磷酸二氫鉀濃度主要影響ATP 的峰形,對其它5 種物質(zhì)的出峰時(shí)間和峰形影響不大,隨著磷酸二氫鉀濃度的增加,ATP 的出峰時(shí)間提前,峰形更差,拖尾嚴(yán)重。這可能是因?yàn)殡S著磷酸二氫鉀濃度的增加,流動(dòng)相中的離子強(qiáng)度增加,進(jìn)一步抑制了ATP 分子與固定相之間的作用,從而使固定相對其保留能力減弱。因此,選擇2.0 mmol/L 的磷酸二氫鉀溶液作為流動(dòng)相。

        2.4 流動(dòng)相中乙腈比例的影響

        色譜常用流動(dòng)相中乙腈與甲醇相比具有更小的紫外吸收,最適宜用于紫外檢測器。在相同情況下,使用乙腈的柱壓也小于甲醇,這有利于色譜柱的長期正常使用。而且甲醇是質(zhì)子型試劑,在分離過程中能與ATP 關(guān)聯(lián)物分子中的極性基團(tuán)形成氫鍵,從而降低固定相對物質(zhì)的保留作用,而乙腈是非質(zhì)子型試劑,不會(huì)與分析物形成氫鍵[17]。試驗(yàn)比較了乙腈與2.0 mmol/L 磷酸二氫鉀溶液的比例分別為95∶5,90∶10,80∶20,70∶30 情況下,對分析測定的影響。結(jié)果顯示,不同比例的流動(dòng)相對各組分的峰面積影響不大,只對出峰時(shí)間有影響,親水色譜中流動(dòng)相的洗脫能力隨著水相比例的增大而加強(qiáng),2.0 mmol/L 磷酸二氫鉀溶液比例小于10%(體積比)時(shí),色譜的出峰時(shí)間顯著延長,因此本試驗(yàn)選用乙腈與2.0 mmol/L 磷酸二氫鉀溶液的比例為80∶20,可以使樣品在20 min 內(nèi)完成分析,各組分的峰型也基本良好。

        圖1 反相色譜分析色譜圖Fig.1 Chromatogram of Reversed phase HPLC

        圖2 親水色譜分析色譜圖Fig.2 Chromatogram of HILIC HPLC

        圖3 8.0 mmol/L 磷酸二氫鉀溶液色譜圖Fig.3 Chromatogram of mobile phase containing 8.0 mmol/L KH2PO4

        2.5 線性關(guān)系、檢出限及定量限

        試驗(yàn)考察了6 種ATP 關(guān)聯(lián)化合物在一定濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系和相關(guān)系數(shù)。以6 種化合物的摩爾濃度(x,μmol/L)為橫坐標(biāo),以峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù),同時(shí)以色譜峰的信噪比(S/N)大于3 時(shí)為方法檢出限,(S/N) 大于10 時(shí)為定量限,結(jié)果見表1。由表1可以看出6 種物質(zhì)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.9950。

        表1 回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table1 Regression equations,correlation coefficients,detection limits and quantitation limits

        2.6 精密度與回收率

        將標(biāo)準(zhǔn)品加入到2.0 g 樣品中,各配制成3 個(gè)濃度梯度的加標(biāo)量,進(jìn)行樣品提取和色譜分析,每個(gè)加標(biāo)量做6 個(gè)平行,計(jì)算回收率。由表2可見,6種物質(zhì)的平均回收率在82.0%~108.2%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差0.8%~6.4%,保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差0.5%~2.0%。說明本方法重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度較好。

        2.7 水產(chǎn)品中ATP 關(guān)聯(lián)化合物的測定

        應(yīng)用本方法對不同保藏溫度下的銀鯧中ATP關(guān)聯(lián)化合物進(jìn)行測定。結(jié)果見圖4、圖5和表3。

        根據(jù)K 值計(jì)算公式:

        銀鯧4 ℃保藏10 d,K 值78.4%,-40 ℃保藏10 d,K 值16.5%。一般認(rèn)為即殺魚的K 值在10%以下,新鮮魚K 值大約在20%以下,20%~40%為二級(jí)鮮度,60%~80%為初期腐敗魚[3]。-40 ℃保藏10 d 的銀鯧K 值16.5%為新鮮魚,4 ℃保藏10 d的K 值78.4%已處于初期腐敗。魚體死后肌肉組織中的三磷酸腺苷(ATP)的降解途徑是三磷酸腺苷 (ATP)→二磷酸腺苷 (ADP)→單磷酸腺苷(AMP)→肌苷酸(IMP)→次黃嘌呤核苷(HxR)→次黃嘌呤(Hx)。從測定圖譜和結(jié)果上可見,兩種保藏條件下的銀鯧在IMP 含量上的差異,比其它5種物質(zhì)更加明顯,這是因?yàn)锳MP 在脫氨酶作用下,脫氨形成肌苷酸(IMP),而IMP 形成后的降解過程相對緩慢,而且降解速度直接受肌肉保存溫度的影響[18]。-40 ℃的保藏溫度顯著降低了魚肉中IMP 的降解過程。

        表2 加標(biāo)回收率和精密度 (n=6)Table2 Determination results of sample and recoveries (n=6)

        圖4 4 ℃保藏10 d 銀鯧中ATP 關(guān)聯(lián)化合物Fig.4 HPLC chromatogram of Pampus argenteus preserved in 4 ℃for 10 days

        圖5 -40 ℃保藏10 d 銀鯧中ATP 關(guān)聯(lián)化合物Fig.5 HPLC chromatogram of Pampus argenteus preserved in -40 ℃for 10 days

        表3 不同保藏條件下的銀鯧ATP 關(guān)聯(lián)化合物含量(n=3)Table3 Determination of ATP related compounds in Pampus argenteus under different preservation conditions (n=3)

        3 結(jié)論

        以乙腈-2.0 mmol/L 磷酸二氫鉀為流動(dòng)相,用BEH Amide 親水性色譜柱,在254 nm 處對6 種ATP 關(guān)聯(lián)化合物進(jìn)行分離,與C18 反相色譜柱測定相比分離效果更優(yōu)。在親水性色譜中極性化合物更易被保留,流動(dòng)相的洗脫能力隨著水相比例的增加而增加,6 種ATP 關(guān)聯(lián)化合物的出峰順序與C18 反相色譜體系不同,依次是次黃嘌呤、次黃嘌呤核苷、單磷酸腺苷、肌苷酸、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷。本方法6 種ATP 關(guān)聯(lián)化合物保留時(shí)間RSD 為0.5%~2.0%,峰面積RSD 為0.8%~6.4%,3個(gè)濃度梯度加標(biāo)回收率在82.0%~108.2%,表明本方法重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度較好,是一種可靠性、實(shí)用性強(qiáng)的測定方法。

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