胡晶晶,蔡嬋慧,張憶聰,李 星,許 玲,劉 淵,李顯箏

(廣東省婦幼保健院醫(yī)學遺傳中心，廣東廣州 511442)

隨著二孩政策的放開、促排卵藥的運用以及輔助生殖技術(shù)的不斷進步，我國雙胎妊娠的發(fā)生率逐年提高。雙胎妊娠作為一種特殊的高危妊娠，其出生缺陷率、死亡率、流產(chǎn)率、早產(chǎn)率、染色體異常和其特有的母胎并發(fā)癥發(fā)生率均較單胎妊娠要高[1]。據(jù)原國家衛(wèi)生和計劃生育委員會公益性行業(yè)項目10家參加單位的統(tǒng)計結(jié)果顯示，雙胎的出生缺陷率約為6.3%[2]。同時，雙胎妊娠較單胎妊娠的產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷的準確性差，其咨詢難度也更大。在檢測染色體異常的方法中，目前染色體G顯帶核型分析仍然是金標準，染色體微陣列分析(CMA)能夠在全基因組水平檢測染色體不平衡的拷貝數(shù)變異(CNV)，尤其是對于檢測染色體組微小缺失、重復等不平衡性重排具有突出優(yōu)勢[3-4]。本文擬將在本院近3年來進行介入性產(chǎn)前診斷雙胎的染色體和染色體微陣列結(jié)果進行回顧性分析和總結(jié)。

1 資料與方法

1.1一般資料 2015年4月至2017年12月在本院醫(yī)學遺傳中心進行介入性產(chǎn)前診斷的雙胎孕婦187例(374個胎兒)，孕婦年齡16～49歲，平均32歲。術(shù)前孕婦均已簽署知情同意書。按孕婦不同孕周選擇不同的穿刺手術(shù)，其中孕11～14周行絨毛穿刺術(shù)14例(28個胎兒)，孕16～25周行羊膜腔穿刺術(shù)153例(306個胎兒)和孕25～31周臍血穿刺術(shù)20例(40個胎兒)，并分別將獲得的絨毛、羊水和臍血共計374個胎兒樣本進行染色體G顯帶和染色體微陣列分析。按介入性指征統(tǒng)計，因單純高齡(≥35歲)、唐篩高風險或者高齡合并唐篩高風險而進行介入性產(chǎn)前診斷雙胎孕婦25例；因NIPT高風險而進行介入性產(chǎn)前診斷雙胎孕婦10例；因超聲發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)異常(包括雙胎和雙胎之一結(jié)構(gòu)畸形和軟指標異常)而進行介入性產(chǎn)前診斷雙胎孕婦140例；因父母雙方之一染色體異常而進行介入性產(chǎn)前診斷雙胎孕婦7例；因不良生育史而進行介入性產(chǎn)前診斷雙胎孕婦5例。按妊娠方式統(tǒng)計，自然妊娠77例，孕婦平均年齡31歲；輔助妊娠97例，孕婦平均年齡33歲；另13例妊娠方式未記錄。按胎兒絨毛膜性統(tǒng)計，雙絨毛膜雙羊膜囊雙胎(DCDA)145例，單絨毛膜雙羊膜囊雙胎(MCDA)40例，絨毛膜性不詳2例，每個胎兒均分別取樣。

1.2方法

1.2.1染色體G顯帶分析 將B超引導下穿刺獲得的絨毛(20～30 mg)、羊水(20 mL)和臍帶血(1 mL)用于體外培養(yǎng)，其中絨毛和羊水為原位培養(yǎng)，臍血直接接種入3瓶培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)。經(jīng)收獲、吉姆薩染色制片。在顯微鏡下，絨毛和羊水計數(shù)15～20個克隆，每個克隆分析1～2個核型；臍帶血計數(shù)20個核型，至少分析5個核型,如有嵌合則增加計數(shù)至100個核型。結(jié)果依據(jù)人類細胞基因組學國際命名體系(ISCN 2013)對染色體核型進行命名。絨毛和羊水的G顯帶分辨率為350～420條帶，臍帶血G顯帶分辨率為550條帶[5-7]。

1.2.2CMA 將B超引導下穿刺獲得的絨毛(50～100 μg)、羊水(5 mL)和臍帶血(0.3 mL)用于提取基因組DNA。使用美國Affymatrix公司的CytoScan 750k芯片，按照該公司提供的標準化操作流程完成全部檢測(DNA的提取、酶切、連接、PCR、PCR產(chǎn)物純化、定量、片段化、標記、雜交、洗滌、染色和掃描)，得到數(shù)據(jù)后經(jīng)ChAS3.1.0.15軟件進行結(jié)果分析,最終結(jié)果判讀參照OMIM、UCSC、ISCA、DGV、DECIPHER等數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié) 果

2.1染色體G顯帶分析結(jié)果 187例雙胎孕婦的胎兒染色體G顯帶分析結(jié)果中，正常核型155例，多態(tài)性核型6例，異常核型26例，除多態(tài)性核型外的異常率為13.90%(26/187)，其中雙胎之一胎核型異常21例(80.77%,21/26)，雙胎核型均異常5例(19.23%,5/26)。

374個胎兒染色體G顯帶分析結(jié)果共檢出335個正常核型胎兒，8個多態(tài)性核型胎兒，31個異常核型胎兒，除多態(tài)性核型外的異常率為8.29%(31/374)。

異常核型中以染色體數(shù)目異常最多見，有19個，占異常核型的61.29%(19/31)；嵌合體4個(12.90%，4/31)；結(jié)構(gòu)異常10個，占異常核型的32.26%(10/31)，胎兒異常核型分類見表1。具體核型結(jié)果見表2。

表1 31個異常核型胎兒的核型分類

注：“-”表示無數(shù)據(jù)

2.2187例雙胎孕婦的胎兒CMA結(jié)果中，共計異常有31例，異常率16.58%。31例異常結(jié)果中發(fā)現(xiàn)數(shù)目異常16例，嵌合體異常3例，結(jié)構(gòu)異常12例。

374個胎兒CMA結(jié)果中，共計有36個異常，異常率9.63%(36/374)。36個異常結(jié)果中發(fā)現(xiàn)數(shù)目異常18個(50%，18/36)，嵌合體遺產(chǎn)3個(8.33%，3/36)，結(jié)構(gòu)異常15個(41.67%，15/36)。15個CMA結(jié)構(gòu)異常胎兒中發(fā)現(xiàn)雜合性缺失2個；微缺失或微重復13個，其中有7例是致病性拷貝數(shù)變異(pCNV )，5例為臨床意義不明CNVs，1例為良性CNVs。胎兒MA異常結(jié)果分類見表3。在染色體核型正常的343個胎兒中，共檢出CMA異常胎兒11個，額外檢出率為3.21%(11/343)。

聯(lián)合兩種檢測方法結(jié)果，374個胎兒中共檢測出異常胎兒42個，總異常率11.23%(42/374)，其中染色體G顯帶和CMA均異常胎兒25個占6.68%(25/374)，染色體G顯帶異常而CMA正常胎兒6個占1.60%(6/374)，染色體G顯帶正常而CMA異常胎兒11個占2.94%(11/374)。具體異常染色體G顯帶和CMA見表2。

表2 胎兒異常染色體G顯帶和CMA結(jié)果

續(xù)表2 胎兒異常染色體G顯帶和CMA結(jié)果

表3 36個胎兒CMA異常結(jié)果分類

3 討 論

目前，雙胎妊娠的非整倍體異常還沒有最佳的篩查方案。據(jù)文獻報道，唐氏綜合征在雙胎妊娠孕中期血清學篩查的檢出率為45%，其假陽性率為10%[8]，因此，不建議對雙胎妊娠進行單獨的血清學篩查。近年來，隨著NIPT在產(chǎn)前篩查中的廣泛應用，NIPT在雙胎妊娠產(chǎn)前篩查中的應用效果雖然明顯優(yōu)于傳統(tǒng)血清學篩查，但其檢出率也僅可達到93.7%[9]。因此，對于有指征的雙胎孕婦進行介入性產(chǎn)前診斷顯得非常重要。

本研究成功對有指征的184例雙胎孕婦進行介入性穿刺手術(shù)共取得374個胎兒樣本。在374個胎兒中，染色體G顯帶核型分析的異常率為8.29%(31/374)，CMA的異常率為9.63%(36/374)，在染色體核型正常的343個胎兒中，共檢出CMA異常胎兒11個，額外檢出率為3.21%(11/343)。據(jù)現(xiàn)有文獻報道，CMA對染色體核型正常的產(chǎn)前樣本檢測的額外檢出率達到0.8%～5.5%[10-13]。盡管如此，相對于G顯帶核型分析技術(shù)，CMA也有其不足：(1)不能檢測平衡易位、倒位等平衡性染色體重排異常；(2)不能檢測出四倍體和低比例嵌合，對于異常細胞≥30%的嵌合體檢測結(jié)果比較可靠[4]。(3)不能檢測出探針未覆蓋的染色體區(qū)域異常，如異染色質(zhì)區(qū)和隨體區(qū)域。在本研究中，有7例11個胎兒(病例3、19、22、24、25、26、27)的G顯帶核型結(jié)果異常而CMA未檢出明確異常?？梢?，兩種方法可以相輔相成，以各自的優(yōu)點彌補對方的缺點，提高胎兒染色體異常的檢出率。

本研究中共檢測出2例2個胎兒(病例4胎A和病例31胎A)的LOH，其是否有致病性還有待進一步研究。在本研究中，還檢測出13個胎兒有CNV，其中包括1個部分單體和部分三體胎兒(病例3胎A)、7個微重復和5個微缺失胎兒；在13個有CNV的胎兒中，7個是pCNV，5個為臨床意義不明CNVs，1個為良性CNVs。對于7個pCNV胎兒的遺傳咨詢，需向孕婦及家屬充分告知胎兒不良結(jié)局的可能。而對于5個為臨床意義不明CNVs胎兒的遺傳咨詢，由于目前還缺少相關(guān)數(shù)據(jù)的支持，也應該向孕婦及家屬充分告知該檢測結(jié)果的局限性，最好建議胎兒父母雙方做染色體微陣列檢測以明確該CNVs是否遺傳自父母雙方之一，這對胎兒預后的判斷會有非常重要的幫助。

本研究中，發(fā)現(xiàn)兩例(病例18和22)單絨毛膜雙胎兩個胎兒的染色體核型不一致。其中病例18胎A核型結(jié)果為45,X，CMA結(jié)果為arr(1-22)×2,(X)×1，胎B核型結(jié)果為46,XX，CMA結(jié)果為arr(1-22,X)×2；病例22胎A核型結(jié)果為mos 46,XY,i(20)(q10)[14]/46,XY[14]，CMA結(jié)果為arr(1-22)×2,(X,Y)×1，胎B核型結(jié)果為46,XY，CMA結(jié)果為arr(1-22)×2,(X,Y)×1。理論上，單絨毛膜雙胎兩個胎兒由一個受精卵發(fā)育而來，遺傳物質(zhì)應該相同，但事實上并非如此。目前國內(nèi)外均有報道單絨毛膜雙胎兩個胎兒染色體不一致[14-15]。這種不一致的情況可以是性染色體非整倍體異常，也可以是常染色體非整倍體異常，其中以特納綜合征最常見。這種不一致的異常可以是單純的非整倍體異常，也可以是嵌合型的非整倍體異常。有報道，單卵雙胎出現(xiàn)一胎染色體(基因)異常的概率約為10%，遠高于雙卵雙胎和單胎妊娠 (1%～2%) 。其發(fā)生機制可能為合子在分裂前即處于染色體嵌合狀態(tài)、受精卵在分裂為雙胎時其中一胎發(fā)生染色體不分離、合子分裂后基因突變、X染色體失活偏離、基因組印記改變、 基因的甲基化或組蛋白修飾[16]，但其確切機制還需要深入的研究。

4 結(jié) 論

由于雙胎妊娠的產(chǎn)前篩查較單胎的產(chǎn)前篩查準確性低，雙胎妊娠又由于其自身的特殊性，其發(fā)生出生缺陷的風險較單胎妊娠高且復雜，產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢難度也更大。因此，對于有指征的雙胎，應更嚴格地進行介入性產(chǎn)前診斷，最好是在進行染色體核型分析的同時進行CMA檢測，利用兩種方法的優(yōu)點相互彌補對方的缺點，盡可能地提高染色體異常的檢出率，減少出生缺陷的發(fā)生。