趙蘇瑛,蔣 維△,吳 倩

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南京 210029；2.南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇南京 210029)

目前將敗血癥和菌血癥統(tǒng)稱為血流感染，血流感染是一種嚴(yán)重的全身性感染綜合征。近年來，隨著創(chuàng)傷性診療技術(shù)的廣泛開展以及廣譜抗菌藥物、激素和免疫抑制劑的廣泛使用，血流感染的發(fā)病率有逐年增高的趨勢。據(jù)報(bào)道，全球每年大約發(fā)生200 000例血流感染，病死率在25%～60%[1-2]。血流感染的常見菌有金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌，肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌及凝固酶陰性的葡萄球菌等。由于傳統(tǒng)的培養(yǎng)耗時長，細(xì)菌的耐藥性變化大且與細(xì)菌本身的毒力和侵入的途徑和數(shù)量均相關(guān)，發(fā)生血流感染的患者很難在早期獲得有效地治療，而早期診斷早期用藥對降低血流感染病死率，改善預(yù)后至關(guān)重要。當(dāng)前，傳統(tǒng)的血培養(yǎng)仍然是診斷血流感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但是它耗時長，敏感度低并且對于采集時間有嚴(yán)格的要求，更重要的一點(diǎn)是血培養(yǎng)對于某些細(xì)菌是無效的。因此，亟需一種高效快速且能早期診斷血流感染的方法。

在醫(yī)學(xué)微生物的鑒定領(lǐng)域，質(zhì)譜法近年來得到飛速發(fā)展，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)現(xiàn)在已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床微生物的鑒定，但是對于血流感染，必須先獲得純培養(yǎng)才能進(jìn)一步鑒定，相對于傳統(tǒng)方法來說，節(jié)省的時間很有限，而電感耦后等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)可以直接測定血液樣本中的金屬離子含量不需經(jīng)過傳統(tǒng)的培養(yǎng)步驟，因此在血流感染的早期診斷方面擁有廣闊的應(yīng)用 前景。

1 材料與方法

1.1研究對象 本實(shí)驗(yàn)一共收集了58例血流感染患者的血液標(biāo)本，將血液經(jīng)增菌培養(yǎng)后獲得純培養(yǎng)菌落。其中14例患者為葡萄球菌感染，包括金黃色葡萄球菌、人葡萄球菌等，患者平均(65.57±15.82)歲，男11例，女3例；39例為腸桿菌科細(xì)菌感染，包括大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌等；平均(68.64±10.33)歲,男20例，女19例；5例感染腸球菌，主要為屎腸球菌和糞腸球菌，平均(71.00±14.16)歲，男2例，女3例；陰性對照組58例，平均(63.30±8.88)歲,男38例，女15例。

1.2試驗(yàn)材料 5種HPLC級混標(biāo)液購自上海凱萊生物，定標(biāo)液購自中國國家有色金屬及電子材料分析測試中心，實(shí)驗(yàn)用超純水由美國Milli-Q超純水儀制造，所有的試劑和化學(xué)用品均采用分析級。

1.3樣品制備 經(jīng)知情同意后，抽取血流感染患者組和健康對照組5 mL外周血，3 500 r/min離心10 min分離血清，置于-20 ℃保存。使用前在室溫下融解并振蕩混勻5 min，然后在200 μL血清內(nèi)加入600 μL濃硝酸和50 μL內(nèi)標(biāo)液?；旌先芤涸?5℃孵育2.5 h后加入去離子水至5 mL，置于4 ℃待檢。

使用注射器吸取0.5 μL血流感染患者的全血注入10 mL增菌液中37 ℃孵育過夜，然后取1 mL菌液轉(zhuǎn)至新鮮培養(yǎng)基中，調(diào)整OD值使之介于0.3～0.6之間，取2 mL培養(yǎng)基12 000× g離心5 min，收集上清液，重復(fù)上述操作[3]。

1.4金屬元素分析 本試驗(yàn)均采用PICAP Q ICP質(zhì)譜儀(美國，Thermo公司)，一共測定68種金屬元素。

1.5數(shù)據(jù)分析

1.5.1試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 ICP-MS工作站導(dǎo)出的半定量結(jié)果用二維數(shù)據(jù)矩陣表示，金屬元素分布圖用GraphPad prism 6軟件繪制。

1.5.2金屬元素的挑選 為了尋找兩組之間的差異，本文使用SIMCA軟件包(SIMCAP 13.0)對數(shù)據(jù)進(jìn)行多維和一維統(tǒng)計(jì)分析。所有的數(shù)據(jù)在經(jīng)過簡單歸一化后輸入到軟件中，然后進(jìn)行主成分分析(PCA)，找出觀察組之間金屬元素最主要的趨勢。之后再用偏最小二乘判別分析(PLS-DA)分析組間變異性以期更好地揭示群體結(jié)構(gòu)，在PLS-DA中VI1被認(rèn)為組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，本文將VI1的數(shù)據(jù)進(jìn)一步行t檢驗(yàn)[4-5]。此外q檢驗(yàn)被用來降低假陽性率和過擬合。那些同時符合VI1且P<0.05的金屬元素被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可作為潛在的標(biāo)志物[6]。

1.5.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用OriginPro 9進(jìn)行相關(guān)性分析，分析方法選用Pearson檢驗(yàn)，并繪制擬合曲線。

2 結(jié) 果

2.1血流感染時金屬元素分布情況 發(fā)生血流感染時金屬元素的分布如圖1所示。PLS-DA的模型圖如圖2所示，PLS-DA的基本參數(shù)如表1所示，R2Y(累積的因變量指數(shù)) 和Q2Y(交叉驗(yàn)證的有效性指數(shù))均大于0.7，表明該模型穩(wěn)定、可靠，見表1。

2.2潛在標(biāo)志物的選擇 根據(jù)VIP值和P值確定潛在金屬標(biāo)記物，先用VI1初步篩選，再用方差分析進(jìn)一步驗(yàn)證，P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。挑選出的潛在金屬標(biāo)記物如表2所示。為了在其中挑選出有意義的金屬元素，本文進(jìn)一步使用Pearson相關(guān)分析來評估那些濃度水平明顯不同的元素，如表3所示，鈀、金、釷和錫在四種類型的血流感染中均出現(xiàn)了濃度的變化，在3種類型的血流感染中出現(xiàn)濃度變化的有鋰、銻和鋅，而另外的一些元素，如鍶、鈣、鈮和硒等則在其中兩個類型的血流感染中出現(xiàn)明顯的濃度變化，還有一些則在某一特定類型血流感染中出現(xiàn)濃度變化。如表4所示，鈣與金黃色葡萄球菌血流感染呈負(fù)相關(guān)性，鈀和金與大腸埃希菌的血流感染呈正相關(guān)性。

表1 PLS-DA 參數(shù)

注：A為血流感染患者血清金屬元素分布;B為金黃色葡萄球菌血流感染患者血清金屬元素分布;C為大腸埃希菌血流感染患者血清金屬元素分布;D為腸球菌血流感染患者血清金屬元素分布;E為肺炎克雷伯菌血流感染病人血清金屬元素分布

圖1血流感染患者血清中金屬元素分布圖

表2 血流感染患者血清中的DME

續(xù)表2 血流感染患者血清中的DME

注：A為血流感染組；B為金黃色葡萄球菌血流感染組；C為大腸埃希菌血流感染組；D為屎腸球菌血流感染組；E為肺炎克雷伯菌血流感染組

圖2血流感染時金屬元素的PLS-DA模型

表3 不同感染類型濃度明顯改變的元素一覽表

表4 金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌血流感染中 DME的相關(guān)性分析

3 討 論

本研究中筆者共測量了58份標(biāo)本，68種金屬元素，獲得了血流感染患者體內(nèi)的金屬元素分布圖譜，這不僅有助于區(qū)分健康個體與血流感染患者，而且對研究該疾病的發(fā)病途徑也具有重要意義。依托ICP-MS的先進(jìn)技術(shù)，使得在數(shù)小時內(nèi)獲得可靠結(jié)果成為可能，毫無疑問，這將給臨床提供一個微生物感染診斷的新平臺[7]。

很多細(xì)菌感染都伴隨著體內(nèi)微量金屬離子濃度的異常改變。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，越來越多的學(xué)者開始關(guān)注金屬元素與疾病之間的關(guān)系。

生物體內(nèi)元素的變化與體內(nèi)環(huán)境和代謝有關(guān)。在體內(nèi)環(huán)境保持不變的情況下，一些疾病引發(fā)的金屬代謝障礙會導(dǎo)致體內(nèi)元素紊亂，但是具體機(jī)制很復(fù)雜，目前仍在研究中。與對照組相比，發(fā)生血流感染的患者血清中金屬元素有一些發(fā)生了明顯的變化，本文認(rèn)為這些變化與感染及發(fā)生感染的種類有關(guān)。一方面，由于體內(nèi)金屬元素水平的不穩(wěn)定，一些炎癥因子的活性和含量受到影響，從而影響細(xì)胞免疫水平，進(jìn)一步影響血流感染的發(fā)生和進(jìn)展。

在發(fā)生感染時本文檢測到鉑、金、釷和錫的濃度均有改變，除個別患者因?yàn)闄C(jī)體的排泄功能異常導(dǎo)致的元素濃度異常外，本文認(rèn)為這與這些金屬的功能有關(guān)。如本試驗(yàn)中鈀和金在大腸埃希菌血流感染者血清中的濃度與細(xì)菌中濃度呈正相關(guān)性。已有研究發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌的產(chǎn)物可以在溶液中結(jié)合鈀離子[8]。大腸埃希菌至少能產(chǎn)生Hyd-1、Hyd-2和Hyd-3 3種水解酶[9]；Hyd-1和Hyd-2是膜結(jié)合的呼吸同工酶，它們的催化亞單位暴露于膜的胞質(zhì)側(cè)，Hyd-3是甲酸脫氫酶復(fù)合體的一部分，這3種氫化酶都有助于鈀離子還原[10]。因此血液中鈀離子的濃度升高也會使大腸埃希菌的體內(nèi)鈀離子濃度升高，兩者表現(xiàn)一致。另外有研究表明金在特定載體上分散成超微粒子后，對很多物質(zhì)的氧化具有優(yōu)異的催化性能[11]，細(xì)菌能夠迅速還原金離子并將其還原成元素金[12]，生物體內(nèi)的氧化反應(yīng)眾多，因此血清內(nèi)金離子濃度升高會導(dǎo)致細(xì)菌吸附的金離子越多，細(xì)菌體內(nèi)金元素的含量也就越高。

在血流感染中濃度明顯改變的金屬元素還有鋰、鐵、鋅、鈣等。有報(bào)道稱鋰在一些炎性反應(yīng)中能促進(jìn)抑炎因子的分泌同時抑制促炎因子的分泌[13]，因此血流感染時會出現(xiàn)血清鋰濃度的變化。

金屬離子(Cu2+、Zn2+、Sn2+)具有廣譜而強(qiáng)大的抑菌作用，根據(jù)實(shí)驗(yàn)研究，金屬離子系列抑菌性物質(zhì)對大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌等均有殺滅抑制能力。體內(nèi)鐵元素缺乏會導(dǎo)致IL-4和IL-6活性降低，此外，鐵依賴性酶和含鐵的酶類合成也會受阻，同時CD4和CD8活性的改變，導(dǎo)致CD4/CD8比值下降，機(jī)體免疫功能下降[14-15]。鋅在體內(nèi)也參與多種酶的合成[16]，鋅元素缺乏會降低這些酶的活性，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞和體細(xì)胞功能紊亂，皮質(zhì)區(qū)T淋巴細(xì)胞減少，胸腺萎縮，最終出現(xiàn)體液免疫和細(xì)胞免疫功能紊亂，造成免疫缺陷。研究證實(shí)，銫對機(jī)體的細(xì)胞免疫、體液免疫及器官的非特異性免疫有顯著影響，銫濃度的降低會抑制免疫球蛋白和抗體的產(chǎn)生，降低抗體滴度，削弱免疫功能，還會造成中性粒細(xì)胞趨化作用損傷和吞噬細(xì)胞功能低下[17]。本文推測金屬代謝的異常誘發(fā)了代謝性疾病和免疫力低下，從而導(dǎo)致了血流感染的發(fā)生。

血流感染總是伴隨著炎癥，炎癥細(xì)胞浸潤和組織壞死。某些金屬元素的濃度變化可能與炎癥有關(guān)[18]。在本次試驗(yàn)中，本文發(fā)現(xiàn)的大量與血流感染相關(guān)的金屬元素并不屬于體內(nèi)常見的微量元素，這表明與細(xì)菌導(dǎo)致的血流感染相關(guān)的元素可能并不僅僅局限于常見的微量元素。

發(fā)生感染時，游離在血液中的金屬元素與細(xì)菌本身的金屬元素之間的模式比較目前并無報(bào)道，本文在試驗(yàn)中對兩者進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，鈣在金黃色葡萄球菌血流感染者的血清中與在細(xì)菌中的濃度呈負(fù)相關(guān)。金黃色葡萄球菌的毒性與生物膜相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)和模式有關(guān)[19]，而鈣離子以一種濃度依賴性的方式調(diào)節(jié)金黃色葡萄球菌生物膜的結(jié)構(gòu)[20]，歸根到底，金黃色葡萄球菌的毒性與這些蛋白中的鈣離子濃度相關(guān)。鈣離子作為一種生物多樣性必需的堿性金屬離子，高濃度時可以破壞金黃色葡萄球菌的生物膜結(jié)構(gòu)，殺傷靜止期金黃色葡萄球菌，同時可消除病原菌的耐藥性[21]。

鈀除了與大腸埃希菌血流感染呈正相關(guān)性外，在腸球菌血流感染中濃度也與細(xì)菌體內(nèi)濃度呈正相關(guān)性，而鈹在血清中的濃度與細(xì)菌體內(nèi)呈負(fù)相關(guān)性。有數(shù)據(jù)表明鈹會破壞細(xì)胞膜成分和結(jié)構(gòu)，影響細(xì)菌合成細(xì)胞外多糖，導(dǎo)致細(xì)菌間聚集力增加，對細(xì)菌存在抑制作用[22]。因此發(fā)生細(xì)菌感染時，鈹?shù)臐舛冉档褪强梢越忉尩摹?/p>

4 結(jié) 論

本研究提出了一種基于ICP-MS技術(shù)的金屬組學(xué)方法以期應(yīng)用于血流感染的早期診斷，本研究建立了細(xì)菌血流感染時的金屬元素分布圖和不同類型細(xì)菌感染時的特異性金屬分布圖，并初步篩選出了潛在的DME。此外還測定了金屬元素與感染的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)了一些特異性的可以進(jìn)一步深入研究和驗(yàn)證的金屬元素。金屬組學(xué)有望成為一種簡單快速的用于臨床篩檢早期血流感染的有效手段。