鄧玲艷,王 旭,李輝軍
(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院檢驗科,湖北武漢 430030)
原發(fā)性醛固酮增多癥(PA),簡稱原醛癥,是指腎上腺皮質(zhì)病變分泌過多的醛固酮,導致體內(nèi)潴鈉排鉀,血容量增多,以及腎素-血管緊張素系統(tǒng)受抑制,以血漿高醛固酮和低腎素水平為主要特征,臨床癥狀表現(xiàn)為高血壓伴有(或不伴有)低血鉀的綜合征[1],是繼發(fā)性高血壓的主要病因之一,約占難治性高血壓的10%左右[2]。研究表明,高血壓人群中采用血漿醛固酮與血漿腎素比值(ARR)篩查后,原醛癥檢出率提高了10倍左右[3]。美國《原發(fā)性醛固酮增多癥患者診斷治療指南》[1]和中國《原發(fā)性醛固酮增多癥診治專家共識》[4]均推薦ARR作為原醛癥的首選篩查指標。
由于原醛癥患者腎素水平低,且腎素是ARR的分母,故腎素測定的準確性在很大程度上決定了ARR結(jié)果的準確性。腎素測定的傳統(tǒng)方法是放射免疫法,其原理是根據(jù)腎素可將血管緊張素原轉(zhuǎn)化成血管緊張素I,通過測定血管緊張素I的生成速率來間接反映血漿腎素活性(PRA)。近年來,全自動化學發(fā)光法測定血漿直接腎素濃度(DRC),由于其操作相對放射免疫法測定PRA受影響因素更少、操作更簡易、更易于標準化且無放射性污染,逐漸應(yīng)用于臨床[5-6]。
樣本穩(wěn)定性是影響檢測結(jié)果準確性的一個重要因素。研究表明溫度不僅影響PRA[7],也會影響DRC[8-11]。因為不同實驗室DRC穩(wěn)定性結(jié)果并不完全相同[8-11],所以本研究的目的是調(diào)查本實驗室血漿中DRC在不同存儲溫度下的穩(wěn)定性,為日常工作提供參考。
1.1一般資料 隨機選擇健康體檢者65例,男35例,女30例,年齡22~56歲,肝腎功能正常,影像學檢查顯示心臟、肺、肝、脾、腎及腎上腺、子宮及附件、前列腺等重要臟器未見明顯異常,未服用任何影響腎素-醛固酮系統(tǒng)的藥物[1]。
1.2儀器與試劑 血漿直接腎素濃度在意大利索靈化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng) (儀器型號:LIAISON XL) 上進行檢測,嚴格按試劑說明書進行操作。
1.3方法 采用伯樂內(nèi)分泌質(zhì)控品進行嚴格的質(zhì)量控制,批號40311,累積均值73.9 μIU/mL,CV為3.65%;批號40313,累積均值107.3 μIU/mL,CV4.19%,均值累積時間超過3個月。自制混合血漿,按CLSI文件EP5-A2 驗證精密度,濃度14.4 μIU/mL 批內(nèi)不精密度CV1.0%,總不精密度 3.3%;濃度42.2 μIU/mL 批內(nèi)不精密度CV2.2%,總不精密度 3.0%。
采用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝真空采血管(BD,美國)于上午7:30-8:30采集空腹靜脈血6 mL(立位),上下顛倒混勻,室溫離心(3 000×g,10 min)分離血漿并分裝(30 min內(nèi)完成),排除嚴重脂血、溶血、黃疸以及血樣體積不足的樣本。新鮮樣本立即上機檢測作為即刻值(基線水平),其他樣本按以下方案儲存。
室溫穩(wěn)定性:20支樣本,每支分成5等份,分別在室溫(25 ℃)放置0、2、4、6、8 h后檢測;冷藏穩(wěn)定性:20支樣本,每支分成5等份,分別冷藏(4 ℃)0、2、4、6、8 h后檢測;冷凍穩(wěn)定性:20支樣本(由于操作失誤,最終只有17支樣本檢測值納入計算)每支分成4等份,除新鮮樣本外,分別保存在-20 ℃條件下4、8、12周后在37 ℃水浴中快速解凍,并立即檢測;凍融穩(wěn)定性:5支樣本,每支分成4等份,新鮮樣本立即檢測作為基線值,其他3組樣本立即凍存于-20 ℃。 第2天,第4組樣本在37 ℃水浴中快速解凍,隨后再凍存于-20 ℃(解凍-凍存在5 min內(nèi)完成);第3天同一時間,第3組、第4組樣本重復相同操作;第4天同一時間,3組樣本在37 ℃水浴中快速解凍,并立即上機檢測。這樣,第2組、第3組、第4組樣本分別凍融1次、2次、3次。
2.1受試者的一般資料比較 本研究一共選擇65例受試者,按照其血壓,分成理想血壓組(收縮壓:90~120 mm Hg、舒張壓:60~80 mm Hg)42例;以及正常血壓高值組(收縮壓:>120 mm Hg~<140 mm Hg、舒張壓:>80 mm Hg~<90 mm Hg)23例。正常血壓高值組與理想血壓組在收縮壓、舒張壓、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、血清鈉離子濃度、血清肌酐、腎小球濾過率(eGFR)的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而DRC、年齡、血清K+濃度在這兩組的差異無統(tǒng)計學意義(見表1)。
表1 受試者一般資料
2.2計算DRC差異率可接受標準 查閱文獻,DRC在健康人中CVb為30.1%[14]。CVa來源于本實驗室質(zhì)控累積不精密度和驗證不精密度:3.3%、3.0%、3.65%、4.19%,計算TCL分別為17.6%、17.2%、18.1%、19.0%。本實驗以17%作為腎素濃度差異率可接受標準。
2.3DRC在室溫條件下的穩(wěn)定性 在室溫條件下,DRC隨放置時間的延長有降低趨勢,詳見表2。盡管從放置在室溫2 h起,DRC檢測值與即刻值相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),但是放置2 h和放置4 h所有樣本DRC的差異率均在17%以內(nèi)。當室溫放置6 h,20例樣本中僅有1例DRC測定值從3.63 μIU/mL降至2.79 μIU/mL,差異率為-23.2%。故樣本采集后,室溫放置6 h內(nèi)檢測,絕大多數(shù)DRC降低幅度臨床可接受。
表2 室溫條件下血漿直接腎素穩(wěn)定性
注:差異率>17%認為差異臨床不可接受;-表示無數(shù)據(jù)
2.4DRC在冷藏條件下的穩(wěn)定性 冷藏條件下,DRC隨放置時間延長有升高趨勢,見表3。研究發(fā)現(xiàn),從冷藏2 h開始,DRC檢測值與即刻值相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而直到冷藏4 h開始,有2個樣本的差異率超過了TCL(分別為2.48 μIU/mL升高至2.94 μIU/mL,差異率18.6%,19.02 μIU/mL升高至25.14 μIU/mL,差異率32.2%),并且隨冷藏時間延長,差異率超過TCL的比例逐漸增多。
表3 冷藏條件下血漿直接腎素穩(wěn)定性
注:差異率>17%認為差異臨床不可接受;-表示無數(shù)據(jù)
2.5DRC在冷凍條件下的穩(wěn)定性 研究DRC在冷凍條件下的穩(wěn)定性之前,先觀察DRC的凍融穩(wěn)定性。凍融可使DRC降低,并且隨著凍融次數(shù)增加,DRC檢測值逐漸降低,見表4。當分離后的血漿樣本保存在-20 ℃條件下12周時,DRC的降低幅度臨床可接受,見表5。
表4 血漿直接腎素凍融穩(wěn)定性
表5 冷凍條件下血漿直接腎素穩(wěn)定性
注:差異率>17%認為差異臨床不可接受;-表示無數(shù)據(jù)
腎素由腎小球旁細胞合成,或由腎素原在一定條件下轉(zhuǎn)化生成[15]。腎素原是腎素的前體,在血漿中以兩種構(gòu)象存在,一種是無活性形式,其活性位點被它N段的一個多肽片段封閉,大概占總量的98%;另一種是活性形式,雖然也含有prosegment,但活性位點未被封閉,這種有活性的含量非常少,不到2%,故健康者外周血中,腎素原的活性非常低。但在低溫(-5 ℃~4 ℃)條件下,無活性腎素原的prosegment可以打開,變成有活性的形式,這一過程被稱為腎素原的冷激活[15]。由于血漿中的腎素原濃度約為腎素的10倍,在腎素分泌受抑制的患者(如原醛癥患者)體內(nèi),腎素原的濃度可較腎素濃度高100倍[15],所以少量腎素原激活都會使腎素濃度檢測產(chǎn)生較大影響。
基于腎素原上述特性,當血液樣本置于低溫環(huán)境時,腎素原被冷激活轉(zhuǎn)換為活性腎素,從而影響腎素測定值的準確性。然而,若樣本放置在室溫時間過長,腎素也可能由于氧化、變性和構(gòu)象變化等原因?qū)е聺舛冉档?。相關(guān)指南和共識[1,4]建議,用于腎素檢測的樣本,從采集、轉(zhuǎn)運到分離血漿的時間不宜超過30 min,這在日常工作中往往難以做到,尤其當需要將樣本轉(zhuǎn)運至第三方機構(gòu)檢測時。本研究表明,腎素不穩(wěn)定,直接腎素離體后,不管是保存在室溫還是冷藏條件下,短時間(2 h)內(nèi)的變化差異有統(tǒng)計學意義。進一步分析表明,血漿放置在室溫6 h及冷藏2 h時,DRC變化幅度可接受。由于樣本冷藏運輸較常溫運輸繁瑣,因此樣本宜保存在室溫并在采集后的6 h內(nèi)送到實驗室。當分離出的血漿樣本冷凍(-20 ℃)12周時,直接腎素的變化幅度可接受,這與李溪月等[11]的建議一致。此外,本實驗首次研究直接腎素的凍融穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)凍融會使DRC降低,僅能凍融一次。
查閱文獻,在相同的檢測系統(tǒng),GRUSON等[8]發(fā)現(xiàn)DRC放置在室溫有下降趨勢,6 h差異開始有統(tǒng)計學意義,他們建議樣本采集后6 h內(nèi)送檢,與本文的建議相同;GLINICKI等[9]研究表明在樣本采集后20~30 min內(nèi),DRC在室溫條件下變化不顯著;LOCSEI等[10]發(fā)現(xiàn)當樣本放置在室溫2 h時,DRC顯著降低,但在0℃~5℃條件下2 h,DRC變化不顯著。李溪月等[11]發(fā)現(xiàn)室溫放置6 h,冷藏3 h,DRC的差異均有統(tǒng)計學意義。本研究結(jié)果顯示,在冷凍或冷藏2 h后,與基線值比,DRC的均值差異均有統(tǒng)計學意義。幾個實驗室對均值統(tǒng)計的結(jié)果的不一樣,可能與人種不同,實驗室環(huán)境不同等因素有關(guān)。但是,上述其他國內(nèi)外的研究在數(shù)據(jù)分析時,僅對血漿DRC的均值做了χ2分析或t檢驗,都未將檢測系統(tǒng)的分析變異和個體內(nèi)生物學變異考慮在內(nèi),這可能是導致本次研究結(jié)果和其他研究結(jié)果不完全相同的主要原因。
在臨床上,由于血漿腎素與醛固酮一起,主要用于原醛癥的篩查及原發(fā)性高血壓的病因分析,而正常血壓高值往往認為是原發(fā)性高血壓的前期。因此,在本研究中,筆者對納入的健康人群進行了理想血壓和正常血壓高值的分組,發(fā)現(xiàn)DRC在兩組中差異無統(tǒng)計學意義。然而,血漿中DRC被抑制是原醛癥的特征之一,不同貯存條件是否會影響原醛癥的篩查效率,有待進一步的研究。此外,本研究驗證另外一個有趣的現(xiàn)象,即在健康體檢者中,DRC明顯異于說明書推薦的參考區(qū)間(立位:4.4~46.1 mIU/L),可能與種族不同有關(guān)[16]。
本實驗研究顯示,外周血中腎素濃度不穩(wěn)定。在室溫條件下,隨保存時間延長降低;在冷藏條件下,隨保存時間延長升高;本實驗首次研究DRC凍融穩(wěn)定性,DRC隨凍融次數(shù)增加而降低。因此,樣本采集后應(yīng)在6 h內(nèi)送檢并檢測,若來不及檢測,可凍存于-20 ℃至少12周,應(yīng)避免反復凍融。