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        保存溫度及時(shí)間對(duì)化學(xué)發(fā)光法測(cè)定直接腎素濃度的影響

        2019-05-17 02:08:22鄧玲艷李輝軍
        關(guān)鍵詞:腎素凍融室溫

        鄧玲艷,王 旭,李輝軍

        (華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科,湖北武漢 430030)

        原發(fā)性醛固酮增多癥(PA),簡(jiǎn)稱(chēng)原醛癥,是指腎上腺皮質(zhì)病變分泌過(guò)多的醛固酮,導(dǎo)致體內(nèi)潴鈉排鉀,血容量增多,以及腎素-血管緊張素系統(tǒng)受抑制,以血漿高醛固酮和低腎素水平為主要特征,臨床癥狀表現(xiàn)為高血壓伴有(或不伴有)低血鉀的綜合征[1],是繼發(fā)性高血壓的主要病因之一,約占難治性高血壓的10%左右[2]。研究表明,高血壓人群中采用血漿醛固酮與血漿腎素比值(ARR)篩查后,原醛癥檢出率提高了10倍左右[3]。美國(guó)《原發(fā)性醛固酮增多癥患者診斷治療指南》[1]和中國(guó)《原發(fā)性醛固酮增多癥診治專(zhuān)家共識(shí)》[4]均推薦ARR作為原醛癥的首選篩查指標(biāo)。

        由于原醛癥患者腎素水平低,且腎素是ARR的分母,故腎素測(cè)定的準(zhǔn)確性在很大程度上決定了ARR結(jié)果的準(zhǔn)確性。腎素測(cè)定的傳統(tǒng)方法是放射免疫法,其原理是根據(jù)腎素可將血管緊張素原轉(zhuǎn)化成血管緊張素I,通過(guò)測(cè)定血管緊張素I的生成速率來(lái)間接反映血漿腎素活性(PRA)。近年來(lái),全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光法測(cè)定血漿直接腎素濃度(DRC),由于其操作相對(duì)放射免疫法測(cè)定PRA受影響因素更少、操作更簡(jiǎn)易、更易于標(biāo)準(zhǔn)化且無(wú)放射性污染,逐漸應(yīng)用于臨床[5-6]。

        樣本穩(wěn)定性是影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的一個(gè)重要因素。研究表明溫度不僅影響PRA[7],也會(huì)影響DRC[8-11]。因?yàn)椴煌瑢?shí)驗(yàn)室DRC穩(wěn)定性結(jié)果并不完全相同[8-11],所以本研究的目的是調(diào)查本實(shí)驗(yàn)室血漿中DRC在不同存儲(chǔ)溫度下的穩(wěn)定性,為日常工作提供參考。

        1 資料與方法

        1.1一般資料 隨機(jī)選擇健康體檢者65例,男35例,女30例,年齡22~56歲,肝腎功能正常,影像學(xué)檢查顯示心臟、肺、肝、脾、腎及腎上腺、子宮及附件、前列腺等重要臟器未見(jiàn)明顯異常,未服用任何影響腎素-醛固酮系統(tǒng)的藥物[1]。

        1.2儀器與試劑 血漿直接腎素濃度在意大利索靈化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng) (儀器型號(hào):LIAISON XL) 上進(jìn)行檢測(cè),嚴(yán)格按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

        1.3方法 采用伯樂(lè)內(nèi)分泌質(zhì)控品進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制,批號(hào)40311,累積均值73.9 μIU/mL,CV為3.65%;批號(hào)40313,累積均值107.3 μIU/mL,CV4.19%,均值累積時(shí)間超過(guò)3個(gè)月。自制混合血漿,按CLSI文件EP5-A2 驗(yàn)證精密度,濃度14.4 μIU/mL 批內(nèi)不精密度CV1.0%,總不精密度 3.3%;濃度42.2 μIU/mL 批內(nèi)不精密度CV2.2%,總不精密度 3.0%。

        采用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝真空采血管(BD,美國(guó))于上午7:30-8:30采集空腹靜脈血6 mL(立位),上下顛倒混勻,室溫離心(3 000×g,10 min)分離血漿并分裝(30 min內(nèi)完成),排除嚴(yán)重脂血、溶血、黃疸以及血樣體積不足的樣本。新鮮樣本立即上機(jī)檢測(cè)作為即刻值(基線(xiàn)水平),其他樣本按以下方案儲(chǔ)存。

        室溫穩(wěn)定性:20支樣本,每支分成5等份,分別在室溫(25 ℃)放置0、2、4、6、8 h后檢測(cè);冷藏穩(wěn)定性:20支樣本,每支分成5等份,分別冷藏(4 ℃)0、2、4、6、8 h后檢測(cè);冷凍穩(wěn)定性:20支樣本(由于操作失誤,最終只有17支樣本檢測(cè)值納入計(jì)算)每支分成4等份,除新鮮樣本外,分別保存在-20 ℃條件下4、8、12周后在37 ℃水浴中快速解凍,并立即檢測(cè);凍融穩(wěn)定性:5支樣本,每支分成4等份,新鮮樣本立即檢測(cè)作為基線(xiàn)值,其他3組樣本立即凍存于-20 ℃。 第2天,第4組樣本在37 ℃水浴中快速解凍,隨后再凍存于-20 ℃(解凍-凍存在5 min內(nèi)完成);第3天同一時(shí)間,第3組、第4組樣本重復(fù)相同操作;第4天同一時(shí)間,3組樣本在37 ℃水浴中快速解凍,并立即上機(jī)檢測(cè)。這樣,第2組、第3組、第4組樣本分別凍融1次、2次、3次。

        2 結(jié) 果

        2.1受試者的一般資料比較 本研究一共選擇65例受試者,按照其血壓,分成理想血壓組(收縮壓:90~120 mm Hg、舒張壓:60~80 mm Hg)42例;以及正常血壓高值組(收縮壓:>120 mm Hg~<140 mm Hg、舒張壓:>80 mm Hg~<90 mm Hg)23例。正常血壓高值組與理想血壓組在收縮壓、舒張壓、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、血清鈉離子濃度、血清肌酐、腎小球?yàn)V過(guò)率(eGFR)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而DRC、年齡、血清K+濃度在這兩組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表1)。

        表1 受試者一般資料

        2.2計(jì)算DRC差異率可接受標(biāo)準(zhǔn) 查閱文獻(xiàn),DRC在健康人中CVb為30.1%[14]。CVa來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控累積不精密度和驗(yàn)證不精密度:3.3%、3.0%、3.65%、4.19%,計(jì)算TCL分別為17.6%、17.2%、18.1%、19.0%。本實(shí)驗(yàn)以17%作為腎素濃度差異率可接受標(biāo)準(zhǔn)。

        2.3DRC在室溫條件下的穩(wěn)定性 在室溫條件下,DRC隨放置時(shí)間的延長(zhǎng)有降低趨勢(shì),詳見(jiàn)表2。盡管從放置在室溫2 h起,DRC檢測(cè)值與即刻值相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但是放置2 h和放置4 h所有樣本DRC的差異率均在17%以?xún)?nèi)。當(dāng)室溫放置6 h,20例樣本中僅有1例DRC測(cè)定值從3.63 μIU/mL降至2.79 μIU/mL,差異率為-23.2%。故樣本采集后,室溫放置6 h內(nèi)檢測(cè),絕大多數(shù)DRC降低幅度臨床可接受。

        表2 室溫條件下血漿直接腎素穩(wěn)定性

        注:差異率>17%認(rèn)為差異臨床不可接受;-表示無(wú)數(shù)據(jù)

        2.4DRC在冷藏條件下的穩(wěn)定性 冷藏條件下,DRC隨放置時(shí)間延長(zhǎng)有升高趨勢(shì),見(jiàn)表3。研究發(fā)現(xiàn),從冷藏2 h開(kāi)始,DRC檢測(cè)值與即刻值相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而直到冷藏4 h開(kāi)始,有2個(gè)樣本的差異率超過(guò)了TCL(分別為2.48 μIU/mL升高至2.94 μIU/mL,差異率18.6%,19.02 μIU/mL升高至25.14 μIU/mL,差異率32.2%),并且隨冷藏時(shí)間延長(zhǎng),差異率超過(guò)TCL的比例逐漸增多。

        表3 冷藏條件下血漿直接腎素穩(wěn)定性

        注:差異率>17%認(rèn)為差異臨床不可接受;-表示無(wú)數(shù)據(jù)

        2.5DRC在冷凍條件下的穩(wěn)定性 研究DRC在冷凍條件下的穩(wěn)定性之前,先觀察DRC的凍融穩(wěn)定性。凍融可使DRC降低,并且隨著凍融次數(shù)增加,DRC檢測(cè)值逐漸降低,見(jiàn)表4。當(dāng)分離后的血漿樣本保存在-20 ℃條件下12周時(shí),DRC的降低幅度臨床可接受,見(jiàn)表5。

        表4 血漿直接腎素凍融穩(wěn)定性

        表5 冷凍條件下血漿直接腎素穩(wěn)定性

        注:差異率>17%認(rèn)為差異臨床不可接受;-表示無(wú)數(shù)據(jù)

        3 討 論

        腎素由腎小球旁細(xì)胞合成,或由腎素原在一定條件下轉(zhuǎn)化生成[15]。腎素原是腎素的前體,在血漿中以?xún)煞N構(gòu)象存在,一種是無(wú)活性形式,其活性位點(diǎn)被它N段的一個(gè)多肽片段封閉,大概占總量的98%;另一種是活性形式,雖然也含有prosegment,但活性位點(diǎn)未被封閉,這種有活性的含量非常少,不到2%,故健康者外周血中,腎素原的活性非常低。但在低溫(-5 ℃~4 ℃)條件下,無(wú)活性腎素原的prosegment可以打開(kāi),變成有活性的形式,這一過(guò)程被稱(chēng)為腎素原的冷激活[15]。由于血漿中的腎素原濃度約為腎素的10倍,在腎素分泌受抑制的患者(如原醛癥患者)體內(nèi),腎素原的濃度可較腎素濃度高100倍[15],所以少量腎素原激活都會(huì)使腎素濃度檢測(cè)產(chǎn)生較大影響。

        基于腎素原上述特性,當(dāng)血液樣本置于低溫環(huán)境時(shí),腎素原被冷激活轉(zhuǎn)換為活性腎素,從而影響腎素測(cè)定值的準(zhǔn)確性。然而,若樣本放置在室溫時(shí)間過(guò)長(zhǎng),腎素也可能由于氧化、變性和構(gòu)象變化等原因?qū)е聺舛冉档?。相關(guān)指南和共識(shí)[1,4]建議,用于腎素檢測(cè)的樣本,從采集、轉(zhuǎn)運(yùn)到分離血漿的時(shí)間不宜超過(guò)30 min,這在日常工作中往往難以做到,尤其當(dāng)需要將樣本轉(zhuǎn)運(yùn)至第三方機(jī)構(gòu)檢測(cè)時(shí)。本研究表明,腎素不穩(wěn)定,直接腎素離體后,不管是保存在室溫還是冷藏條件下,短時(shí)間(2 h)內(nèi)的變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步分析表明,血漿放置在室溫6 h及冷藏2 h時(shí),DRC變化幅度可接受。由于樣本冷藏運(yùn)輸較常溫運(yùn)輸繁瑣,因此樣本宜保存在室溫并在采集后的6 h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室。當(dāng)分離出的血漿樣本冷凍(-20 ℃)12周時(shí),直接腎素的變化幅度可接受,這與李溪月等[11]的建議一致。此外,本實(shí)驗(yàn)首次研究直接腎素的凍融穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)凍融會(huì)使DRC降低,僅能凍融一次。

        查閱文獻(xiàn),在相同的檢測(cè)系統(tǒng),GRUSON等[8]發(fā)現(xiàn)DRC放置在室溫有下降趨勢(shì),6 h差異開(kāi)始有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,他們建議樣本采集后6 h內(nèi)送檢,與本文的建議相同;GLINICKI等[9]研究表明在樣本采集后20~30 min內(nèi),DRC在室溫條件下變化不顯著;LOCSEI等[10]發(fā)現(xiàn)當(dāng)樣本放置在室溫2 h時(shí),DRC顯著降低,但在0℃~5℃條件下2 h,DRC變化不顯著。李溪月等[11]發(fā)現(xiàn)室溫放置6 h,冷藏3 h,DRC的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果顯示,在冷凍或冷藏2 h后,與基線(xiàn)值比,DRC的均值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)均值統(tǒng)計(jì)的結(jié)果的不一樣,可能與人種不同,實(shí)驗(yàn)室環(huán)境不同等因素有關(guān)。但是,上述其他國(guó)內(nèi)外的研究在數(shù)據(jù)分析時(shí),僅對(duì)血漿DRC的均值做了χ2分析或t檢驗(yàn),都未將檢測(cè)系統(tǒng)的分析變異和個(gè)體內(nèi)生物學(xué)變異考慮在內(nèi),這可能是導(dǎo)致本次研究結(jié)果和其他研究結(jié)果不完全相同的主要原因。

        在臨床上,由于血漿腎素與醛固酮一起,主要用于原醛癥的篩查及原發(fā)性高血壓的病因分析,而正常血壓高值往往認(rèn)為是原發(fā)性高血壓的前期。因此,在本研究中,筆者對(duì)納入的健康人群進(jìn)行了理想血壓和正常血壓高值的分組,發(fā)現(xiàn)DRC在兩組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而,血漿中DRC被抑制是原醛癥的特征之一,不同貯存條件是否會(huì)影響原醛癥的篩查效率,有待進(jìn)一步的研究。此外,本研究驗(yàn)證另外一個(gè)有趣的現(xiàn)象,即在健康體檢者中,DRC明顯異于說(shuō)明書(shū)推薦的參考區(qū)間(立位:4.4~46.1 mIU/L),可能與種族不同有關(guān)[16]。

        4 結(jié) 論

        本實(shí)驗(yàn)研究顯示,外周血中腎素濃度不穩(wěn)定。在室溫條件下,隨保存時(shí)間延長(zhǎng)降低;在冷藏條件下,隨保存時(shí)間延長(zhǎng)升高;本實(shí)驗(yàn)首次研究DRC凍融穩(wěn)定性,DRC隨凍融次數(shù)增加而降低。因此,樣本采集后應(yīng)在6 h內(nèi)送檢并檢測(cè),若來(lái)不及檢測(cè),可凍存于-20 ℃至少12周,應(yīng)避免反復(fù)凍融。

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