孫澤寧,吳 冰,2,劉夢(mèng)迪,李金榮,田 衛(wèi),2,周云濤,2△

(1.華北理工大學(xué)附屬唐山市工人醫(yī)院，河北唐山 063000;2.唐山市臨床分子診斷與治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北唐山 063000；3.保定市第一中心醫(yī)院，河北保定 071000)

孤立低高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)表型是一種單純的HDL-C水平減低，而三酰甘油(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)值正常的一種表現(xiàn)[1]。孤立低HDL-C表型在亞裔人種中的發(fā)生率高于非亞裔人種，與冠心病、卒中的風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[2]。不僅如此，心血管疾病治療過(guò)程中，盡管他汀類藥物強(qiáng)化治療已經(jīng)進(jìn)一步減低了心血管事件和病死風(fēng)險(xiǎn)，但是“剩留風(fēng)險(xiǎn)”問(wèn)題卻更加凸顯出來(lái)[3]。低HDL-C血癥是“剩留風(fēng)險(xiǎn)”發(fā)生的重要因素之一。近年來(lái)，低HDL-C表型與相關(guān)疾病間的分子機(jī)制研究已經(jīng)成為脂代謝領(lǐng)域中的一個(gè)重要部分。

miRNA是一類長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的非蛋白編碼的RNA。通過(guò)轉(zhuǎn)錄后翻譯抑制作用，在分子水平參與基因表達(dá)和調(diào)控。miRNA9(miR-9)是一個(gè)靶向調(diào)節(jié)沉默信息調(diào)節(jié)因子2家族基因sirtuin-1(SIRT1)的RNA分子，參與糖代謝和脂代謝途徑的調(diào)節(jié)，與胰島素抵抗關(guān)系密切[4]。研究顯示，孤立低HDL-C表型人群，除了低HDL-C水平外，也常伴有胰島素抵抗特征。MIR28是一個(gè)通過(guò)靶向抑制ERK2，上調(diào)HDL-C代謝調(diào)節(jié)關(guān)鍵基因三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ABCA1)的RNA分子，在HDL-C代謝途徑發(fā)揮作用[5]。本研究旨在利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)技術(shù)，檢測(cè)miR-9-3p和miR-28-5p在孤立低HDL-C表型人群血漿中的表達(dá)水平，并探討其與血清HDL-C水平的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取唐山市工人醫(yī)院2014年1月至2015年12月健康體檢者共174例，其中脂代謝表型正常組86例和孤立低HDL-C表型異常組88例。分組參照中國(guó)脂代謝異常防治指南、唐山地區(qū)健康居民體檢血清HDL-C分布特征等[6]，TG<1.7 mmol/L和LDL-C<3.30 mmol/L、血清HDL-C<1.04 mmol/L(男性)或1.16 mmol/L(女性)判別為孤立低HDL-C表型異常組。排除標(biāo)準(zhǔn)：糖尿病、心腦血管病史、代謝綜合征等病史。本研究經(jīng)唐山市工人醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，征得受試者的知情同意，并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1血漿RNA提取 參照mirVana RNA分離試劑盒(美國(guó)Ambion公司)操作手冊(cè)。簡(jiǎn)易操作流程如下：(1) 兩步離心法分離血漿樣本(4 ℃，3 000 r/min離心15 min，4 ℃，12 000 r/min離心15 min)；(2) 500 μL血漿，經(jīng)過(guò)變性液、酸化苯酚、無(wú)水乙醇、洗脫液等處理步驟，分離液相至RNeasy Mini吸附柱內(nèi)；(3)加入預(yù)熱90 μL稀釋液，靜置1 min，8 000×g離心1 min。經(jīng)血漿RNA分離，起始體積500 μL的血漿樣本轉(zhuǎn)化為90 μL RNA樣本。

1.2.2血漿miRNA qPCR檢測(cè) 利用TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqMan miRNA檢測(cè)試劑盒、TaqMan通用PCR試劑盒(美國(guó)ABI公司)，完成miRNA反轉(zhuǎn)錄和PCR定量檢測(cè)(ABI 7500定量PCR儀,美國(guó)ABI公司)。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括：8.6 μL RNA，0.1 μL 100 mmol/L dNTPs，0.1 μL RNase inhibitor (20 U/μL)，1.5 μL miRNA特異度引物,0.5 μL MultiScribeTM反轉(zhuǎn)錄酶 (50 U/μL)；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)步驟：16 ℃孵育1 h；42 ℃孵育 1.5 h；85 ℃孵育5 min。定量PCR擴(kuò)增體系包括：6 μL 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，10 μL 2×TaqMan通用PCR緩沖液，0.5 μL TaqMan miRNA水解探針(2.5 μmol/L)，3.5 μL H2O(無(wú)RNA酶和DNA酶)；反應(yīng)條件：95 ℃變性15 s，60 s退火/延伸1 min，共50個(gè)循環(huán)。miRNA相對(duì)表達(dá)定量分析以miR-191-5p為參照，采用ΔCt方法，計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平，2-ΔCt表示血漿樣本中的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1孤立低HDL-C表型組與脂代謝表型正常組一般資料比較 一般臨床資料如表1所示，兩組間TC、TG和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)血清水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均在正常參考值范圍。

表1 研究對(duì)象的臨床特征

注：TC為總膽固醇;HDL-C為高密度脂蛋白膽固醇;LDL-C為低密度脂蛋白膽固醇;TG為三酰甘油;FG空腹血糖;ALT為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶;AST為門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶;GGT為谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶;HGB為血紅蛋白濃度;PLT為血小板計(jì)數(shù);WBC為白細(xì)胞;RBC為紅細(xì)胞;NEU為中性粒細(xì)胞;LYM為淋巴細(xì)胞

2.2血漿miR-9-3p和miR-28-5p的檢出率 脂代謝表型正常組和孤立低HDL-C表型組血漿中miR-9-3p的檢出率分別為86.05%(74/86)和64.77%(57/88)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.58,P=0.001),見表2，但性別分組條件下，miR-9-3p在各組間的檢出率，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.66,P=0.882)。miR-28-5p的檢出率分別為94.19%(81/86)和100%(88/88)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表觀健康體檢者血漿中miR-9-3p和miR-28-5p的總檢出率分別為75.29%(131/174)和97.13%(169/174)。

表2 血漿miR-9-3p的檢出率(n)

注：χ2=10.58,P=0.001，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.3血漿miR-9-3p和miR-28-5p表達(dá)水平 如圖1所示，孤立低HDL-C異常表型組與脂代謝正常表型組血漿樣本中miR-9-3p相對(duì)表達(dá)水平分別為0.024(0.009,0.039)和0.026(0.012,0.065)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.167)，圖1A；miR-28-5p的相對(duì)表達(dá)水平分別為0.004(0.002,0.010)和0.004(0.002,0.011)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.871)。見圖1B。

圖1 血漿miR-9-3p和miR-28-5p的相對(duì)表達(dá)水平

注：A為性別與表型交互分組情況下血漿miR-9-3p比較分析；B為性別分組情況下血漿miR-9-3p比較分析；C為性別與表型交互分組情況下血漿miR-28-5p比較分析；D為性別分組情況下血漿miR-28-5p比較分析；●表示正常脂表型；○表示孤立低HDL-C表型

圖2性別分組下血漿miR-9-3p和miR-28-5p的相對(duì)表達(dá)水平

2.4性別分組情況下，血漿miR-9-3p和miR-28-5p表達(dá)水平 如圖2所示，miR-9-3p在女性脂代謝正常組和孤立低HDL-C異常表型組血漿樣本中的表達(dá)水平均高于男性組，見圖2A，與未表型分組情況下女性組高于男性組的分析結(jié)果相一致[0.038(0.023,0.082)vs.0.014(0.007,0.033),P<0.001]，見圖2B。而在性別和HDL-C異常表型分組條件下，各組間血漿miR-28-5p的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2C，僅在未表型分組情況下女性組高于男性組[0.003(0.002,0.008)vs.0.004(0.003,0.011),P=0.028)，見圖2D。

2.5血漿miR-9-3p和miR-28-5p與臨床指標(biāo)的線性回歸分析 如表3所示，線性回歸分析顯示血漿miR-9-3p與性別因素(P<0.001)、血清HDL-C水平(P=0.041)、空腹血糖(P=0.044)相關(guān)，見表3；而miR-28-5p表達(dá)水平與血清HDL-C水平、空腹血糖、性別等指標(biāo)均無(wú)相關(guān)性。

表3 健康體檢者血漿miR-9-3p的線性回歸分析

注：多元線性回歸模型中包括年齡、血脂、肝功能、血常規(guī)細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)等指標(biāo)，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)經(jīng)自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，回歸模型經(jīng)年齡等因素調(diào)整后R2=0.215,P=0.002

3 討 論

孤立低HDL-C表型是心腦血管疾病的一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因素。該表型人群常表現(xiàn)出內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、HDL亞組份功能異常[7]、抗炎作用削弱[8]、血小板過(guò)渡活化[9]等病理生理特征，而這些改變與心腦血管疾病的發(fā)生與發(fā)展關(guān)系密切。

研究表明，HDL-C代謝過(guò)程中，有多種miRNA參與，包括miR-33[10]，miR-28[11]，miR-144[12]等。研究表明，miR-9調(diào)節(jié)胰島素分泌[13]，參與膽固醇代謝及心肌細(xì)胞血管新生過(guò)程[14-15]。冠心病患者常伴有降低的HDL-C水平，并發(fā)糖尿病。因此，本研究選取miR-28和miR-9作為研究對(duì)象，探討在孤立低高密度脂蛋白膽固醇表型下的血漿miR-9-3p和miR-28-5p變化模式。結(jié)果顯示，脂代謝表型正常組和孤立低HDL-C表型組血漿中miR-9-3p的檢出率分別為86.05%(74/86)和64.77%(57/88)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)在女性脂代謝正常表型組和孤立低HDL-C表型組的表達(dá)水平均高于男性表型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，在不考慮性別因素情況下，脂代謝正常表型和孤立低HDL-C表型組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。線性回歸分析顯示性別、血清HDL-C水平和空腹血糖水平是血漿miR-9-3p的主要影響因素，尤其是性別因素，支持了血漿miR-9-3p在脂代謝正常表型和孤立低HDL-C表型中的分布特征。國(guó)內(nèi)外對(duì)于孤立低高密度脂蛋白表型的血漿miR-9水平鮮有報(bào)道。本研究首次利用孤立低HDL-C表型和正常血脂表型間的微弱差別，證實(shí)了血漿miR-9-3p的基線特征及其關(guān)聯(lián)因素，為其在動(dòng)脈硬化性疾病和糖尿病的關(guān)聯(lián)研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。人類miR-9基因定位于3個(gè)不同的染色體(1號(hào)、5號(hào)和15號(hào))基因座位，增加了其轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式復(fù)雜性，有可能影響血漿miR-9-3p的分布水平。其不同基因座位對(duì)血漿miR-9-3p表達(dá)模式的影響有待于進(jìn)一步深入研究，以期為亞臨床、臨床疾病診療的轉(zhuǎn)化與應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

miR-28屬于內(nèi)含子型的miRNA分子，與LIM域脂肪瘤優(yōu)先運(yùn)輸輔基編碼基因(LPP)協(xié)同轉(zhuǎn)錄加工。研究表明LPP基因及其內(nèi)含子型miR-28分子與動(dòng)脈粥樣硬化性疾病關(guān)系密切。本研究未發(fā)現(xiàn)血漿miR-28-5p在健康體檢血脂正常表型和孤立低HDL-C表型中存在差異，提示血漿miR-28-5p不是孤立低HDL-C表型的分子病理特征。當(dāng)前HDL-C的亞組分研究提示，抗動(dòng)脈粥樣硬化的HDL 顆粒是由一組異質(zhì)亞組分組成，不僅大小和密度不同，其化學(xué)成分和生理功能也有所不同[16]。臨床實(shí)踐中，冠心病患者常常伴有其他代謝性疾病，如糖尿病、高脂血癥等，其相互關(guān)聯(lián)的因子十分復(fù)雜。借助新型miRNA分子譜系特征，能為孤立低HDL-C表型的診療以及心血管事件風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)提供新的研究思路和潛在的干預(yù)靶標(biāo)，從而實(shí)現(xiàn)心血管疾病的精準(zhǔn)醫(yī)療。

4 結(jié) 論

血漿miR-9-3p是孤立低HDL-C表型的分子病理特征之一。性別、血清HDL-C、空腹血糖是其循環(huán)水平變化的主要關(guān)聯(lián)因素。血漿miR-9-3p在孤立低HDL-C表型的基線特征及其關(guān)聯(lián)因素的發(fā)現(xiàn)，將有助于臨床工作中更加全面地了解心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)因素?cái)y帶者亞臨床表型的分子病理特征，為心血管病的早期防控提供潛在的分子靶標(biāo)。