雷香菊,陳 萍#,何雪琴,姜雪強,李 毅,陳 武△
(湖北醫(yī)藥學院附屬東風醫(yī)院:1.醫(yī)學檢驗部;2.感染病科,湖北十堰 442001)
乙型肝炎病毒(HBV)是導致肝硬化、肝細胞癌(HCC)的主要原因[1]。目前全球約有2.6億慢性乙型肝炎(CHB)患者,導致每年20%~30%發(fā)展為肝硬化、HCC,約84萬人死亡。近年來的研究表明,HBV基因型可能影響CHB患者的臨床表現(xiàn),以及肝硬化、肝癌的發(fā)展[2-3];此外,核苷(酸)類藥物(NAs)是目前FDA批準的唯一抗HBV化學藥物,但易引起耐藥性基因突變,導致病毒學、生物化學突破[4-5]。然而,其對CHB患者肝臟病變的影響目前還報道較少[6]。因此,本文調(diào)查了本地HBV基因型、逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)主要耐藥基因突變與CHB患者肝硬化、HCC的關(guān)系,從而為預防和治療CHB提供參考。
1.1一般資料 回顧性分析2015年4月至2017年12月,在本地住院治療的540例HBV-DNA定量陽性(DNA拷貝數(shù)>1×103/mL)CHB患者,平均(47.8±13.1)歲。根據(jù)2015年乙型肝炎防治指南[7],將患者分為慢性乙肝組、肝硬化代償組、肝硬化失代償組、HCC組。排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染和可能導致肝臟病變的其他疾病,并記錄前期NAs用藥史?;颊哂谧≡浩陂g清晨抽取靜脈血送醫(yī)學檢驗部,檢測HBV基因型和RT區(qū)主要耐藥基因突變,以及血清透明質(zhì)酸酶(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原N端肽(PCⅢNP)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、糖類抗原125(CA125)、糖類抗原199(CA199)水平。
1.2儀器設(shè)備 熒光定量PCR儀RG-6000(Corbett Research公司)、分子雜交儀HBHM-9000A(廣東凱普生物科技有限公司)、基因芯片閱讀儀YN2009(深圳亞能生物技術(shù)有限公司)、美國Beckman-coulter公司(DxC 600型)生化免疫一體機。
1.3檢測方法 血清肝纖維化、腫瘤標記物采用免疫化學發(fā)光法測定(美國Abbott診斷公司,500次/盒)。HBV-DNA提取和RT-PCR采用熒光定量試劑盒(廣州達安基因股份有限公司,48次/盒);HBV基因型、耐藥基因突變類型采用巢式PCR和反向雜交法測定(深圳亞能生物技術(shù)有限公司,25次/盒):參照試劑盒說明,在保證顯色控制點、陽性質(zhì)控品正常顯色而陰性質(zhì)控不顯色情況下,通過芯片閱讀儀判讀,得到HBV基因型和耐藥基因突變結(jié)果,檢測的RT區(qū)主要突變模式為M204V、M204I、L180M、A181V、V207I、N236T。
2.1一般性資料 收集的540例HBV-DNA 陽性CHB患者中,19例因未檢測出基因型而排除。其他521例CHB患者中,200例有CHB相關(guān)肝硬化或肝細胞癌(38.4%),322例無肝臟病變(61.6%)。兩者間年齡差異有統(tǒng)計學意義,且4組年齡呈明顯遞增趨勢(F=18.059,P<0.001);兩者間性別差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),但男女性HCC比例差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.543,P=0.006)。此外,521例CHB患者中,272例有NAs用藥史,249例無NAs用藥史,前者肝臟病變率明顯低于后者,差異有統(tǒng)計學意義(表1)。
2.2基因型、耐藥基因突變與CHB肝硬化、肝癌相關(guān)性 521例CHB患者中,檢出B、C、D和BC混合基因型分別為323例(62.0%)、187例(35.9%)、3例(0.6%)和8例(1.5%)。由于D型、BC混合型例數(shù)較少,因此未計入統(tǒng)計分析。C基因型CHB患者中肝臟病變的比例高于B基因型,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。272例有NAs用藥史的CHB患者中,113例檢出RT區(qū)主要耐藥基因突變(41.5%),突變型患者中肝臟病變的比例與野生型無統(tǒng)計學意義。見表2。
2.3HBV基因型、耐藥基因突變與血清肝纖維化指標的相關(guān)性 血清腫瘤標記物水平經(jīng)取ln對數(shù)后均滿足正態(tài)分布,結(jié)果顯示:C基因型血清ln、PⅢPNP、Ⅳ-C水平均高于B型,差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05);血清HA水平亦高于B基因型,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在272例有NAs用藥史的CHB患者中,突變型各血清肝纖維化指標與野生型差異均無統(tǒng)計學意義。見表3。
表1 慢性乙肝患者的臨床分組和特征
注:*CHB合并肝臟病變患者與單純CHB患者的比較
表2 慢性乙肝患者基因型、耐藥基因突變與肝臟病變的關(guān)系[n(%)]
注:a由于D型、BC混合型例數(shù)較少未計入統(tǒng)計分析;b有NAs用藥史
表3 基因型、耐藥基因突變與血清肝纖維化指標的關(guān)系
注:*有NAs用藥史;-表示無數(shù)據(jù)
表4 基因型、耐藥基因突變與血清腫瘤標志物的關(guān)系
注:*有NAs用藥史;-表示無數(shù)據(jù)
2.4基因型、耐藥基因突變與血清腫瘤標記物的相關(guān)性 血清腫瘤標記物水平經(jīng)取ln對數(shù)后均滿足正態(tài)分布,結(jié)果顯示:C基因型CHB患者血清AFP、CA125水平高于B基因型,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);血清CEA、CA199水平亦高于B基因型,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。而耐藥基因突變型各血清腫瘤標記物均高于野生型,但差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。
2.5基因型、性別與血清腫瘤標記物的相關(guān)性 由于不同腫瘤的發(fā)生率與性別有關(guān),因此本文分別比較了男女性B、C基因型腫瘤標記物的差異。結(jié)果表明:男性兩基因型只有AFP差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);而女性中兩基因型AFP、CEA、CA125差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);而兩者CA199均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
表5 基因型、性別與血清腫瘤標志物的關(guān)系
注:-表示無數(shù)據(jù)
目前根據(jù)HBV全基因組序列差異大于8%,將其分為A~J等10種基因型,且基因型呈明顯的地域分布[2]。我國北方及部分南方地區(qū)以C型為主,湖北、湖南、江西、福建、臺灣等部分地區(qū)以B型為主[8]。本地CHB住院患者中,B基因型比例高達63.9%(包括混合型)[9],這對研究B型HBV的特點提供了良好的條件。已有的研究表明,C基因型具有較慢的血清乙型肝炎E抗原(HBeAg)轉(zhuǎn)換、對干擾素治療不敏感[6]。本文前期的研究也表明:C基因型CHB患者血清HBV-DNA、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、酶學水平高于B型,且更易發(fā)生NAs耐藥基因突變[9]。然而,其與肝硬化、肝癌的關(guān)系還有待調(diào)查。
已有的幾項亞洲人群的調(diào)查顯示出不一致的結(jié)果:一項對臺灣地區(qū)2 762例HBV攜帶者的調(diào)查顯示,C基因型攜帶者HCC發(fā)生率接近B型的兩倍[10];另一項對香港地區(qū)CHB患者的調(diào)查結(jié)果也表明,C基因型是HCC獨立的風險因素[11];然而一項對大陸地區(qū)9省1 096例HBV攜帶者的調(diào)查,卻未發(fā)現(xiàn)基因型與肝硬化、HCC有相關(guān)性[12];而近年來的一項meta分析則顯示:C型HBV攜帶者發(fā)展為肝硬化、HCC的風險分別是B基因型的3.89、4.40倍[8]。本次調(diào)查的521例急性住院CHB患者,平均年齡47.8歲,排除不同HBV基因型患者間年齡、性別的差異,結(jié)果表明HBV基因型與CHB肝硬化、肝癌臨床診斷、血清標記物均有相關(guān)性,C基因型相對B基因型肝硬化、肝癌的風險更高,其OR值分別為1.34(1.04~1.73)、1.84(1.04~3.26)。幾項對日本、澳大利亞CHB患者的調(diào)查也顯示:C基因型發(fā)展為HCC的年齡更低[13-14],提示年齡、性別、疾病狀態(tài)可能影響HBV基因型與HCC的相關(guān)性,這可能是上述結(jié)果不一致性的原因。
另一方面,NAs藥物的廣泛使用可導致耐藥基因突變,然而其對CHB患者肝硬化、肝癌的影響目前報道卻較少。本次調(diào)查結(jié)果顯示:在同樣有NAs用藥史的CHB患者中,耐藥基因突變型患者肝硬化、HCC比例與野生型差異無統(tǒng)計學意義,提示RT區(qū)主要耐藥基因突變與CHB肝硬化、HCC可能無相關(guān)性。盡管有研究表明:BCP區(qū)突變與HCC有關(guān),但與RT區(qū)突變的關(guān)系目前尚不清楚[6]。此外,本次調(diào)查中還發(fā)現(xiàn)有NAs用藥史的CHB患者中,肝硬化、HCC比例低于無NAs用藥史患者,其OR值為0.75(0.60~0.93),提示NAs抗病毒治療可降低肝硬化、HCC的發(fā)生率;而近來一項大型Meta分析也證實了這一點[15]。
總之,本次從臨床癥狀、實驗室指標兩個方面調(diào)查了521例急性CHB患者,結(jié)果表明:CHB患者肝硬化、HCC與基因型有相關(guān)性,而與逆轉(zhuǎn)靈酶區(qū)主要耐藥基因突變無相關(guān)性,且NAs用藥史與低的肝硬化、HCC發(fā)生率有關(guān)。考慮到本次調(diào)查的例數(shù)有限,且主要是住院患者,其結(jié)果還有待大規(guī)模前瞻性的研究進行證實。由于B、C基因型是我國HBV攜帶者兩種主要的基因型,因此探討其對肝硬化、HCC的影響對CHB的預防和治療具有重要意義。