米力坎木·哈司木，努爾比亞·玉蘇甫，田 剛

(1.新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院藥學部，新疆喀什 844000；2.天津市公安醫(yī)院檢驗科，天津 300040)

胞漿型磷脂酶A2(CPLA2)家族包含6個胞內(nèi)酶，其中胞漿型磷脂酶A2γ(cPLA2γ)是 cPLA2家族具有獨特結構的成員[1-2]。有報道cPLA2家族的其他成員與結腸、小腸和肺部腫瘤的發(fā)生有密切的聯(lián)系，特別近年來研究發(fā)現(xiàn)cPLA2α在乳腺癌侵襲轉移中有一定的作用[3-5]，但cPLA2γ與腫瘤的關系只處于理論推斷上，國內(nèi)外未見詳細的報道。本研究試圖從cPLA2γ角度探索乳腺癌侵襲轉移的信號傳導通路及其對乳腺癌細胞遷移侵襲能力的影響，為遏制此類疾病的發(fā)生提供一些有價值的幫助。

1 材料與方法

1.1一般材料

1.1.1組織標本和細胞系 乳腺癌患者組來自新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院(以下簡稱“本院”)2015年1月至2017年2月手術切除的139例乳腺癌患者。其對應的乳腺癌旁正常組織標本作為對照組。139例乳腺癌患者的病歷資料經(jīng)住院部病案室查閱，結合隨訪資料完善基本資料分析。其中乳腺癌患者年齡分布范圍為30～65歲，平均(48.8±4.1)歲。入選標準符合世界衛(wèi)生組織(WHO)的乳腺癌診斷標準。乳腺癌MDA-MB-231細胞株由本院研究所實驗中心提供。

1.1.2試劑與儀器 cPLA2γ(圣克魯斯生物技術公司)；cofilin和p-cofilin(細胞信號轉導生物技術公司)；p-Akt和p-PKCζ (艾博抗生物技術公司)；Akt和PKCζ (圣克魯斯生物技術公司)；StealthTMRNA轉染試劑盒(大連寶生物)；cPLA2γ免疫組化試劑盒(北京中杉生物公司)；兔抗人β-actin多克隆抗體(英杰生命技術有限公司)。超凈工作臺(細胞培養(yǎng)專用，中國安泰生物技術公司)；Olympus IX70倒置顯微鏡(日本 奧林巴斯)；轉膜儀(伯樂生物醫(yī)學有限公司)；凝膠成像系統(tǒng) (美國柯達公司)；Transwell小室(美國密理博公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人乳腺癌細胞系MDA-MB-231常規(guī)培養(yǎng)，待細胞進入對數(shù)生長期后，用PBS清洗兩次，0.25%胰酶消化，用1 mL完全培養(yǎng)基終止消化后吹打為單細胞懸液，接種到6孔板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)準備后續(xù)試驗。

1.2.2抑制cPLA2γ的表達及其檢測 設計3段cPLA2γ靶Stealth siRNA 序列(si#1,si#2 and si#3 siRNA)轉染MDA-MB-231細胞，同時用一段無關序列轉染MDA-MB-231細胞作為轉染對照組(scr表示)，未進行轉染的細胞作為對照組。48～72 h后裂解細胞，用Western blot檢測cPLA2γ的表達情況。用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測mRNA水平。

1.2.3StealthTM-RNA轉染 采用脂質體復合物滴加細胞表面的方法轉染，6 h后換成常用RPMI-1640培養(yǎng)液；細胞轉染72 h后，取細胞進行下一次轉染，細胞經(jīng)轉染兩次后進行下一步實驗。

1.2.4免疫組化檢測cPLA2γ表達 應用免疫組化檢測臨床乳腺癌標本石蠟切片中cPLA2γ蛋白的表達情況。按照操作說明書進行，染色結果由兩名中級職稱以上病理科醫(yī)生采用雙盲原則評定。結果判定胞漿出現(xiàn)淺黃至棕黃色顆粒為陽性。

1.2.5劃痕實驗 6孔培養(yǎng)板每孔接種5×105個細胞孵育過夜，然后用無菌移液槍頭在培養(yǎng)皿表面劃均勻直線一道。觀察劃線周邊細胞移動距離，分別測量3處取均值繪制曲線。

1.2.6Western blot檢測cofilin、PKCζ及其磷酸化抗體和Akt及其磷酸化抗體的表達 細胞培養(yǎng)進入對數(shù)生長期，向6孔板中加入細胞裂解液(300 μL/孔，其中PMSF濃度為0.1%)，冰上裂解后用10% SDS-PAGE膠進行電泳，分別用cofilin、p-cofilin、PKCζ、p-PKCζ、Akt和p-Akt(ser473和Thr308)的兔抗人單克隆一抗(1∶1 000)室溫下孵育2 h，再用過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1∶5 000稀釋)室溫下孵育30 min。

1.2.7穩(wěn)定轉染MDA-MB-231細胞挑選抑制cPLA2γ表達的克隆細胞 穩(wěn)定轉染MDA-MB-231細胞，欲獲得抑制cPLA2γ表達的MDA-MB-231穩(wěn)定克隆細胞(用shcPLA2γ MDA-MB-231細胞表示)，Western blot檢測挑選的穩(wěn)定克隆細胞抑制cPLA2γ表達的效果。shcPLA2γ MDA-MB-231細胞的cPLA2γ蛋白表達比scr MDA-MB-231細胞的明顯降低。

1.2.8體內(nèi)侵襲實驗 實驗動物采用免疫缺陷SCID小鼠，均來自中科院動物中心，4～6周齡，雌性，清潔級；選取經(jīng)過篩選的scr細胞和穩(wěn)定轉染有cPLA2γ shRNA的MDA-MB-231細胞，調(diào)整細胞濃度為5×106個/mL，懸液20 μL以微量注射器注射于小鼠尾靜脈(各10只，分別作為對照組和實驗組)。注入小鼠腫瘤細胞后2周觀察自發(fā)轉移和定向轉移情況，處死小鼠，取出小鼠的肺，觀察臟器表面腫瘤結節(jié)數(shù)和大小。

2 結 果

2.1免疫組化檢測cPLA2γ在乳腺癌組織中表達 139例乳腺疾病患者中淋巴結轉移的89例，淋巴結未轉移的50例。在89例淋巴結轉移病例中，有80例cPLA2γ表達陽性。然而，在無淋巴結轉移的50例病例中，只有4例cPLA2γ表達陽性。兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。配對的正常乳腺組織中無cPLA2γ表達(圖1)。提示cPLA2γ的表達與乳腺癌轉移具有相關性。本研究未發(fā)現(xiàn)cPLA2γ的表達與腫瘤大小和組織學分級有關。

圖1 cPLA2γ在乳腺導管癌組織和乳腺癌旁組織中的表達(40×)

2.2StealthTM-RNAi技術分析MDA-MB-231細胞中cPLA2γ表達情況

2.2.1抑制cPLA2γ表達的MDA-MB-231細胞mRNA和蛋白表達水平 轉染si#1、si#2和si#3 siRNA的MDA-MB-231細胞cPLA2γ的蛋白表達水平明顯比對照組和scr細胞的cPLA2γ蛋白表達水平降低，且si#3 siRNA的效果最明顯。RT-PCR結果也同樣顯示MDA-MB-231細胞的cPLA2γ的mRNA表達水平明顯比對照組降低。

2.2.2抑制cPLA2γ表達的MDA-MB-231細胞遷移能力影響 應用小RNA干擾技術瞬時轉染MDA-MB-231細胞，抑制了cPLA2γ的表達，細胞遷移和定向運動能力明顯比對照組降低(圖2)。

圖2 瞬時轉染MDA-MB-231細胞抑制cPLA2γ的表達抑制細胞遷移

2.2.3抑制cPLA2γ表達對MDA-MB-231細胞周期的影響 流式細胞術分析表明對照組MDA-MB-231細胞G0/G1期為45.3%±3.1%，S期為34.9%±2.9%，G2/M期為20.8%±1.8%。抑制cPLA2γ表達的MDA-MB-231細胞G0/G1期為39.0%±3.0%，S期為35.9%±5.7%，G2/M期為25.1%±3.4%。結果顯示抑制cPLA2γ表達的MDA-MB-231細胞S期以及G2/M期生長沒有受影響，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，進一步說明細胞遷移功能的改變不依賴于細胞增殖。

2.3cPLA2γ抑制后細胞侵襲能力變化 計數(shù)聚碳酸酯膜中央部分和周圍部分5個隨機視野(200×)內(nèi)侵襲細胞的數(shù)目，經(jīng)過統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)Scr細胞和通過siRNA抑制PLA2γ(sicPLA2γ)/MDA-MB-231細胞平均每個視野侵襲細胞為243.15個和50.12個，sicPLA2γ/MDA-MB-231細胞穿透matrigel膠的能力明顯低于Scr組，與Scr組相比侵襲能力下降了79.4%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見圖3。

圖3 抑制cPLA2γ表達的MDA-MB-231細胞侵襲能力的影響

2.4cPLA2γ調(diào)節(jié)EGF誘導的細胞信號分子Akt、cofilin和PKC磷酸化活性 在sicPLA2γ MDA-MB-231細胞內(nèi)，EGF刺激5 min內(nèi)，cofilin的磷酸化表達水平與對照組相比有明顯下降的趨勢。Akt在cofilin的信號通路上游，同時檢測了EGF誘導的Akt 473和308位點的磷酸化水平，結果sicPLA2γ MDA-MB-231細胞內(nèi)Akt 473和308位點的磷酸化蛋白表達水平比對照組明顯降低。另外Akt也是PKC的上游調(diào)節(jié)分子，sicPLA2γ MDA-MB-231細胞PKC磷酸化活性明顯比對照細胞低。提示抑制cPLA2γ表達對細胞遷移降低作用機制，與PI3K/Akt通路有關。

2.5抑制cPLA2γ表達對SCID鼠體內(nèi)乳腺癌細胞肺轉移的影響 尾靜脈注入shcPLA2γ MDA-MB-231細胞的SCID小鼠肺表面的腫瘤結節(jié)數(shù)明顯比對照組注入scr MDA-MB-231細胞的少。兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

3 討 論

作為近年來發(fā)現(xiàn)的cPLA2家族成員之一cPLA2γ具有獨特的結構已引起學術界廣泛的關注。它是唯一鈣離子非依賴型的膜結合磷脂酶A，有兩個保守的模序即C端的異戊烯化和N端的十四烷?；痆5-8]。CAAX的法尼基模序的突變將引起其在胞漿內(nèi)定位的改變。另外cPLA2γ缺乏PLA1的活性，從sn-1和sn-2位脫?；饔冕尫庞退?、花生四烯酸和其他不飽和脂肪酸。其活性功能的潛在上游信號分子研究的還不十分清楚[9]。但本研究的結果充分體現(xiàn)cPLA2γ在EGF誘導的乳腺癌侵襲轉移中扮演著重要的角色。

應用免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)，cPLA2γ在乳腺癌組織浸潤性導管癌中有淋巴結轉移的比無淋巴結轉移的表達率高。經(jīng)統(tǒng)計學分析cPLA2γ的表達與臨床病理參數(shù)的關系可見，cPLA2γ的表達升高與淋巴結轉移相關。在不同的乳腺癌細胞系中cPLA2γ的表達(不同于cPLA2其他亞型)是均勻的[10-12]。抑制cPLA2γ表達的乳腺癌細胞不能改變其生長周期，這些與cPLA2γ功能的獨特性有關[13]。所有的研究數(shù)據(jù)表明cPLA2γ在腫瘤的發(fā)生和轉移中起非常重要的作用。侵襲和轉移是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，抑制癌基因及其受體的表達將是切斷腫瘤蔓延生長的根本。本研究發(fā)現(xiàn)腫瘤發(fā)生的新靶點cPLA2γ將為臨床小分子抑制癌細胞生長提供新思路。

以前的文獻曾報道PKCζ在乳腺癌遷移中起著非常關鍵的作用[14]。PKCζ的活化通過PDK1/Akt2/Rictor調(diào)節(jié)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)cPLA2γ調(diào)節(jié)乳腺癌細胞的遷移是通過PI3K/Akt通路。EGF誘導的Akt473、Akt308和cofilin的磷酸化水平在抑制cPLA2γ表達后受到抑制也表明，cPLA2γ可能參與PI3K/Akt通路下游分子的定位和活化。cPLA2γ也可作為抑制腫瘤信號傳導集簇應答的新靶點。

對SCID鼠體內(nèi)乳腺癌細胞肺轉移的影響觀察可見，鼠尾靜脈注射抑制cPLA2γ表達的乳腺癌細胞，SCID小鼠肺表面的腫瘤結節(jié)數(shù)明顯比對照組小鼠少。說明抑制cPLA2γ表達影響了乳腺癌細胞的被動轉移和定向轉移。臨床上抑制腫瘤細胞的目的是延長患者生存期，動物模型實驗更進一步闡明cPLA2γ表達與乳腺癌細胞生長及侵襲轉移有關，預示其可作為患者生存期延長的關鍵因子。

4 結 論

cPLA2γ參與EGF誘導的乳腺癌細胞的遷移和侵襲。抑制cPLA2γ表達對乳腺癌細胞遷移起著抑制作用。本研究為進一步闡明乳腺癌侵襲轉移機制提供新思路，cPLA2γ的調(diào)控與Akt通路有關。Akt信號通路中的靶分子cPLA2γ可能成為腫瘤基因治療的新靶點。