黃貞杰 陳由強 薛婷

（1. 泉州醫(yī)學高等專科學校，泉州 362010；2. 福建師范大學生命科學學院，福州 350108）

燃料乙醇作為一種可再生的清潔替代能源，具有可持續(xù)發(fā)展的意義，它的發(fā)展備受各國關注。2017年全球燃料乙醇產量是270.5億加侖，中國是8.75億加侖，僅占比3%［1］。國家能源局《生物質能發(fā)展“十三五”規(guī)劃》要求到2020年，燃料乙醇利用規(guī)模達到400萬t。但目前其大規(guī)模發(fā)展也存在一些問題：首先，生產原料受限，歐美等國家主要以玉米、小麥和甜菜等糧食作為生產原料，容易造成“與人爭糧”的局面。其次，利用能源甘蔗生成燃料乙醇可以彌補利用糧食作為原材料的不足。然而，發(fā)酵終點高濃度的乙醇對生產菌株酵母細胞生長和乙醇發(fā)酵具有強烈抑制作用，從而降低了乙醇產量。因此選育乙醇耐性高、產率高的酵母菌株成為研究重點［2-3］。

肌醇（Inositol）是酵母的生長因子，是磷脂酰肌醇（Phosphatidylinositol，PI）合成的前體。Chi等［4］研究發(fā)現，在酵母乙醇發(fā)酵過程中，當細胞磷脂酰肌醇的含量較高時，其乙醇產率和產量都較高。季冉等［5］通過外加不同濃度的肌醇，考察其對嗜鞣管囊酵母產乙醇能力及耐乙醇能力的影響。研究發(fā)現，當培養(yǎng)基中乙醇起始濃度為10%和12%時，隨著肌醇添加量的增加，乙醇產量也均呈上升趨勢；肌醇濃度為0.2 g/L時，乙醇凈生成量均達到最大。Furukawa等［6］研究也發(fā)現，在乙醇存在下，酵母細胞肌醇含量水平對提高細胞活力、耐高乙醇是極其重要的。以上表明，肌醇對酵母耐高乙醇及產乙醇能力起著重要的作用。

肌醇的生物合成途徑清晰，其中肌醇-3-磷酸合成酶是關鍵酶。Hisashi等［7］通過過表釀酒酵母肌醇-3-磷酸合成酶基因ino1，獲得了產肌醇的工程菌株。在乙醇脅迫下，ino1基因的表達被證明不可缺少［6］。Hong［8］等研究發(fā)現過表達釀酒酵母 4個內源基因（msn2、hal1、dog1和ino1）能夠提高乙醇的耐性。其中過表達ino1的酵母菌具有最高的乙醇耐性，該菌株在初始葡萄糖濃度為300 g/L培養(yǎng)基中發(fā)酵，乙醇體積產率為1.30 g/L/h，比出發(fā)菌株提高了35%。

綜上，本研究嘗試通過過表達肌醇生物合成的關鍵酶基因ino1來改造釀酒酵母，使菌體自身大量分泌肌醇，從而提高乙醇耐性，進一步篩選獲取能夠利用甘蔗汁發(fā)酵產燃料乙醇的工程菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質粒 釀酒酵母S288C：上海交通大學微生物代謝國家重點實驗室趙心清教授饋贈；釀酒酵母Y01（二倍體）保存于福建師范大學生命科學學院。pSH65載體本實驗室保藏。pURIH本實驗室構建。

1.1.2 主要試劑和儀器 實驗所用的葡萄糖、蔗糖、酵母粉、蛋白胨、硫酸銨、濃硫酸、七水硫酸鎂、無水乙醇等試劑為國產分析純。肌醇和色譜用葡萄糖、無水乙醇為色譜純。DNA Marker、Plasmid MiniPrep Ki、Fastpfu Fly DNA Polymerase購自北京全式金生物技術有限公司；反轉錄試劑盒購自fermentas公司；G418、Zeocin、瓊脂糖和氨卞青霉素鈉均購自上海生工生物工程有限公司。主要儀器：Applied Biosystems 270 PCR儀；美國thermoD-37520高速冷凍離心機；Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System；Agilent 7890A氣相色譜。

1.1.3 培養(yǎng)基 （1）發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉8、蔗糖 200、硫酸銨（NH4）2SO45、磷酸二氫鉀（KH2PO4）2、七水硫酸鎂（MgSO4·7H2O）2。（2）甘蔗汁發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉8、硫酸銨（NH4）2SO45、磷酸二氫鉀（KH2PO4）2、七水硫酸鎂（MgSO4·7H2O）2，用煮沸后過濾的甘蔗汁配制，加蔗糖調糖度。（3）YPG誘導培養(yǎng)基（g/L）：半乳糖20、蛋白胨20、酵母提取物10。（4）YPD完全培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20、蛋白胨20、酵母提取物10。

1.2 方法

1.2.1ino1基因整合表達載體pURIH的構建、轉化pURIH載體的構建、轉化以及ino1表達量的分析方法詳見參考文獻［9-10］。

1.2.2 過表達菌株的乙醇耐受性分析 接種活化后的出發(fā)菌株Y01和過表達菌株YI2-1、YI2-2于YPD液體培養(yǎng)基中過夜振蕩培養(yǎng)；檢測3菌株的菌液濃度，當同步生長時，取菌液做梯度稀釋后，各取2 μL相同濃度的菌液接種于乙醇濃度分別為5%、8%、9%、10%（V/V）的YPD固體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)30 h。觀察菌落大小。為進一步分析菌株乙醇耐力，分別將過表達菌株和出發(fā)菌株接種到YPD液體培養(yǎng)基，進行30℃搖瓶培養(yǎng)至菌濃（OD600）達0.3，每份菌液中分別加入5%（V/V）的乙醇，或加入5%的水為空白對照。培養(yǎng)1 h后，菌體暴露在含不同乙醇濃度的PYD液體培養(yǎng)基中，在96孔板上孕育2 h。稀釋50倍點樣到YPD平板上培養(yǎng)48 h，觀察細胞生長活力情況。

1.2.3 乙醇標準曲線的制作 準確吸取色譜用無水乙 醇 1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、7.5 mL和10 mL至50 mL容量瓶中，用ddH2O定容，配置成乙醇濃度分別為2%、4%、6%、8%、10%、15%、20%的標準樣品，用Agilent 7890A氣相色譜檢測。氣相色譜檢測條件：色譜柱為HP-FFAP（19091F-413）；FID檢測器，檢測溫度300℃；載氣用氮氣；分流比20∶1；氣化室溫度為200℃；柱箱升溫程序為：130℃穩(wěn)定4 min，后運行200℃ 2.5 min。根據乙醇體積分數與色譜峰面積的關系，以乙醇體積分數為橫坐標，色譜峰面積平均值作為縱坐標，制成乙醇標準曲線。

1.2.4 葡萄糖標準曲線的制作（3，5-二硝基水楊酸DNS法）稱取無水葡萄糖100 mg，加水定容至50 mL，振蕩搖勻后，得到濃度為2.00 mg/mL的葡萄糖標準溶液。再分別按表1，添加各試劑。

表1 葡萄糖標準曲線的建立方法

將各管混勻，置于沸水浴中5 min顯色后，立即置于水中冷卻至室溫，再向每管加入蒸餾水使其總體積為10 mL，振蕩搖勻，在540 nm下用0號管作為對照，分別取1-7號管的葡萄糖濃度為橫坐標，對應的OD540值為縱坐標，繪制葡萄糖的標準曲線。

1.2.5 菌株蔗糖酶酶活的測定 測定方法參考文獻［11］。取 5 mL 發(fā)酵液 4 000 r/min 離心 6 min 收集菌體，ddH2O洗滌兩次后將細胞重懸于5 mL的乙酸鈉緩沖液中（pH4.6），取200 μL加入到5 mL的乙酸鈉配制的8%蔗糖溶液中，混合后30℃水浴30 min，取出放冰上，立即做適當稀釋，用DNS法測稀釋液中的還原糖。

1.2.6 釀酒酵母厭氧發(fā)酵培養(yǎng)（1）種子液的培養(yǎng)：接種Y01、YI2-1、YI2-1△KP于裝有50 mL YPD液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃、220 r/min，保持通氣良好，過夜培養(yǎng)。次日取2mL菌液測菌濃，培養(yǎng)至各種子液細胞濃度一致。（2）按8%的接種量接種至100 mL的甘蔗汁發(fā)酵培養(yǎng)基中，通氣良好下30℃ 220 r/min培養(yǎng)8 h。（3）在超凈臺內將8層紗布換成滅過菌的發(fā)酵栓，并在發(fā)酵栓里加2 mL 40%的硫酸，以隔絕外界空氣進入。發(fā)酵裝置（圖1）靜置于30℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。

圖1 發(fā)酵裝置

1.2.7 發(fā)酵液中乙醇含量的測定 每隔12 h吸取2 mL發(fā)酵液在4℃下6 000 r/min離心5 min，用0.22 μm的過濾器過濾，濾液于樣品瓶內，Agilent 7890A氣相色譜儀分析其乙醇含量，色譜分析的條件參見乙醇標準曲線的制作。

主要解釋變量分數量和質量兩個部分。(1)數量層面為rta，代表各國每年已經生效實施的區(qū)域貿易協定的數目；(2)質量層面為包括條款覆蓋率(wtoc)和法定承諾率(wtoe)兩個指標， “條款覆蓋率”=協議中涉及WTO+或WTO-X領域的條款數目/總條款數目×100%， “法律承諾率”=涉及WTO+或WTO-X領域具有法律效力的條款數量/協議所涵蓋條款數量×100%。計算時根據區(qū)域貿易協定原文比對計算得出。

1.2.8 工程菌株的遺傳穩(wěn)定性 將過表達菌株YI2-1、YI2-1△KP接種至YPD液體培養(yǎng)基中30℃，220 r/min搖床培養(yǎng)，隔36 h轉接至另一新鮮YPD液體培養(yǎng)基中，連續(xù)轉接20代，取菌液稀釋后涂布于YPD平板上。挑取單菌落用引物rDNA-F、rDNA-R進行PCR驗證，確定其遺傳穩(wěn)定性。

2 結果

2.1 過表達ino1釀酒酵母菌株的獲得

將pURIH載體轉化釀酒酵母Y01，經G418抗性濃度梯度（0.5-2 g/L）平板篩選，PCR驗證，獲得重組菌YI1。為獲得更高ino1表達量的菌株，以YI1菌株為出發(fā)菌株再次轉化。經篩選獲得重組菌株YI2-1、YI2-2。Real-Time PCR分析ino1表達量，結果（圖2）顯示YI2-1、YI2-2菌株ino1基因mRNA轉錄水平分別是Y01的16.235倍和11.163倍。將抗性基因KanMX敲除后的菌株命名為YI2-1△KP。

2.2 菌株的乙醇耐受性分析

為驗證過表達菌株的耐乙醇能力，分別在含5%和10%（V/V）乙醇的YPD平板上培養(yǎng)，在含5%乙醇濃度下液體培養(yǎng)與平板培養(yǎng)結果相符，菌株的生長狀況沒多大差別（圖3，圖4）。在含10%（V/V）乙醇濃度培養(yǎng)條件下，過表達菌株YI2的生長速率及菌落生長情況較好于出發(fā)菌株（圖5，圖6），表明過表達菌株的乙醇耐受性高于出發(fā)菌株，有較強的細胞活力，ino1的表達水平影響其活力。

圖2 ino1基因的表達分析

圖3 菌株在含5%（V/V）乙醇的YPD平板上的生長狀況

圖4 菌株在含有50 g/L乙醇濃度下的搖瓶培養(yǎng)生長曲線

圖5 菌株在含10%（V/V）乙醇的YPD平板上的生長狀況

2.3 過表達菌株的遺傳穩(wěn)定性研究

圖6 菌株在含有100 g/L乙醇濃度下的搖瓶培養(yǎng)生長曲線

圖7 YI2-1、YI2-1△KP遺傳穩(wěn)定性驗證

將過表達菌株連續(xù)轉接傳代20代后，提基因組進行PCR驗證。結果顯示（圖7），電泳條帶大小約為2 667 bp，與預期相符。表明ino1基因通過rDNA介導整合在釀酒酵母基因組上，過表達菌株YI2-1、YI2-1△KP具有很高的遺傳穩(wěn)定性。

2.4 過表達菌株發(fā)酵性能的分析

2.4.1 耐高乙醇能力檢測 不同濃度的乙醇耐力分析發(fā)現，YI2-1、YI2-1△KP兩菌株都能在在含9%（V/V）乙醇的YPD平板上生長（圖8），生長狀況沒多大差別。通過進一步的乙醇耐力分析方法處理后，培養(yǎng)結果見圖9，過表達菌YI2-1的乙醇耐性最高，可耐19%（V/V）的乙醇。

2.4.2 氣相色譜檢測發(fā)酵液中乙醇的含量 乙醇標準曲線的制作：配制不同濃度的乙醇的標準溶液進行氣相色譜分析，繪制乙醇標準曲線（圖10）。其回歸方程為y=428736x+314.24（R2）=0.999 5。

圖8 過表達菌株在含9%乙醇的YPD平板上的生長狀況（48 h）

圖9 不同菌株的乙醇耐力分析

圖10 乙醇標準曲線

菌提高8.55%。而過表達菌株YI2-1△KP的最大乙醇積累量為13.17%（V/V），較出發(fā)菌提高9.16%。

2.4.3 高糖度甘蔗汁發(fā)酵實驗 同上接種方法，利用29oBx甘蔗汁發(fā)酵培養(yǎng)基，進行厭氧發(fā)酵。不同時間取樣，測定發(fā)酵醪液的酒精度。結果如表2。過表達菌株表現出相對較突出的的高滲透壓脅迫耐受性，酵母菌YI2-1 72 h的乙醇積累量為16.31%（V/V），較出發(fā)菌株最高乙醇積累量15.24%，提高了7.03%（V/V）。而過表達菌株YI2-1△KP靜止發(fā)酵8 d后，測定的乙醇積累量達到17.14%（V/V）。

圖11 20oBx甘蔗汁培養(yǎng)基厭氧發(fā)酵乙醇產量變化

表2 高糖度甘蔗汁（29oBx）厭氧發(fā)酵乙醇產量變化

2.4.4 蔗糖酶活力分析 為研究肌醇表達量的不同對蔗糖酶分泌的影響，細胞培養(yǎng)72 h后，測定了蔗糖酶比活的大小。根據DNS法測得菌體分泌蔗糖酶酶解蔗糖溶液產生的還原糖，及菌體干重，計算得Y01、YI2-1 和 YI2-1△KP，72 h的蔗糖酶比活分別為76.3 U/mg，81.1 U/mg，83.6 U/mg。過表達菌株比出發(fā)菌株的蔗糖酶比活要高，表明肌醇對蔗糖酶分泌具有一定的調控作用。

3 討論

選育乙醇耐受性和發(fā)酵性能優(yōu)良的釀酒酵母菌株，是提高乙醇產量的一條必要途徑。通過基因工程改造選育是熱點［12］。本研究通過過表達釀酒酵母ino1基因，構建獲得重組菌，并對其乙醇耐性和發(fā)酵性能進行了研究。

在含有100 g/L乙醇濃度下的搖瓶培養(yǎng)生長曲線顯示，過表達菌株對數期菌體生長速率均比出發(fā)菌株快，菌株的高乙醇耐受性分析顯示過表達菌YI2-1可耐19%（V/V）的乙醇，比出發(fā)菌株高，表明乙醇存在下，酵母細胞ino1基因表達量水平對提高細胞活力，耐高乙醇是極其重要的，與Furukawa［6］的研究一致?？赡茉蛴校阂环矫?，肌醇量能夠影響細胞膜透性，低濃度肌醇影響細胞內物質的泄漏，如核苷酸、磷和鉀等，進而影響細胞內pH、H+-ATPase的活性，改變細胞質離子穩(wěn)態(tài)，影響膜透性屏障。高的肌醇量使ATPase的活性提高，抵償質子流入量，觸發(fā)改變脂質組成，最終提高乙醇耐受性［13］。另一方面，肌醇是磷脂酰肌醇（PI）合成的前體，而在真核細胞中，多種磷酸化形式的PI對于細胞信號傳導、各種生理功能發(fā)揮極其重要作用［11］。

甘蔗汁培養(yǎng)基發(fā)酵實驗，乙醇產量分析顯示，過表達菌株YI2-1△KP的最大乙醇積累量為13.17%（V/V），較出發(fā)菌提高了9.16%。實驗結果表明，乙醇耐受性實驗可在一定程度上反應乙醇產量，過表達菌株的乙醇耐受性強，從而使乙醇的積累量得到提高。高糖度甘蔗汁（29oBx）厭氧發(fā)酵乙醇產量分析顯示，過表達菌株具有較突出的高滲透壓脅迫耐受性，這與肌醇量能夠影響細胞膜透性是一致的。

綜上所述，過表達ino1基因能夠明顯的提高釀酒酵母的乙醇耐受性。本研究構建的工程菌株能夠利用能源甘蔗汁發(fā)酵，生產較高體積產率的乙醇。后期需要繼續(xù)對發(fā)酵工藝優(yōu)化等進行研究，有望進一步提高乙醇產量。最后，乙醇耐性機理比較復雜，還尚未明晰。釀酒酵母的乙醇耐受性受多種基因控制，所以研究者仍然需要對酵母菌分子機制做進一步研究。

4 結論

在釀酒酵母中過表達ino1基因可提高重組釀酒酵母的乙醇耐受性及產量。對過表達菌株的乙醇耐受性進行分析，YI2-1可耐19%（V/V）的乙醇。為生物安全性考慮，利用YPG誘導培養(yǎng)基，誘導表達cre重組酶切除KanMX抗性基因，獲得無有害抗性基因的過表達菌株YI2-1△KP，并進行了連續(xù)傳代培養(yǎng)，結果表明過表達菌株具有很高的遺傳穩(wěn)定性。利用甘蔗汁為碳源進行發(fā)酵培養(yǎng)，采用氣相色譜（GC）對發(fā)酵產物乙醇進行檢測，重組菌YI2-1△KP的最大乙醇積累量為13.17%（V/V），與出發(fā)菌株相比提高了9.16%。研究表明通過過表達釀酒酵母ino1基因能夠有效提高菌株細胞活力、乙醇耐受性。