亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        過表達INO1基因提高釀酒酵母乙醇耐受性

        2019-05-17 09:36:48黃貞杰陳由強薛婷
        生物技術通報 2019年3期
        關鍵詞:甘蔗汁肌醇耐受性

        黃貞杰 陳由強 薛婷

        (1. 泉州醫(yī)學高等專科學校,泉州 362010;2. 福建師范大學生命科學學院,福州 350108)

        燃料乙醇作為一種可再生的清潔替代能源,具有可持續(xù)發(fā)展的意義,它的發(fā)展備受各國關注。2017年全球燃料乙醇產量是270.5億加侖,中國是8.75億加侖,僅占比3%[1]。國家能源局《生物質能發(fā)展“十三五”規(guī)劃》要求到2020年,燃料乙醇利用規(guī)模達到400萬t。但目前其大規(guī)模發(fā)展也存在一些問題:首先,生產原料受限,歐美等國家主要以玉米、小麥和甜菜等糧食作為生產原料,容易造成“與人爭糧”的局面。其次,利用能源甘蔗生成燃料乙醇可以彌補利用糧食作為原材料的不足。然而,發(fā)酵終點高濃度的乙醇對生產菌株酵母細胞生長和乙醇發(fā)酵具有強烈抑制作用,從而降低了乙醇產量。因此選育乙醇耐性高、產率高的酵母菌株成為研究重點[2-3]。

        肌醇(Inositol)是酵母的生長因子,是磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol,PI)合成的前體。Chi等[4]研究發(fā)現,在酵母乙醇發(fā)酵過程中,當細胞磷脂酰肌醇的含量較高時,其乙醇產率和產量都較高。季冉等[5]通過外加不同濃度的肌醇,考察其對嗜鞣管囊酵母產乙醇能力及耐乙醇能力的影響。研究發(fā)現,當培養(yǎng)基中乙醇起始濃度為10%和12%時,隨著肌醇添加量的增加,乙醇產量也均呈上升趨勢;肌醇濃度為0.2 g/L時,乙醇凈生成量均達到最大。Furukawa等[6]研究也發(fā)現,在乙醇存在下,酵母細胞肌醇含量水平對提高細胞活力、耐高乙醇是極其重要的。以上表明,肌醇對酵母耐高乙醇及產乙醇能力起著重要的作用。

        肌醇的生物合成途徑清晰,其中肌醇-3-磷酸合成酶是關鍵酶。Hisashi等[7]通過過表釀酒酵母肌醇-3-磷酸合成酶基因ino1,獲得了產肌醇的工程菌株。在乙醇脅迫下,ino1基因的表達被證明不可缺少[6]。Hong[8]等研究發(fā)現過表達釀酒酵母 4個內源基因(msn2、hal1、dog1和ino1)能夠提高乙醇的耐性。其中過表達ino1的酵母菌具有最高的乙醇耐性,該菌株在初始葡萄糖濃度為300 g/L培養(yǎng)基中發(fā)酵,乙醇體積產率為1.30 g/L/h,比出發(fā)菌株提高了35%。

        綜上,本研究嘗試通過過表達肌醇生物合成的關鍵酶基因ino1來改造釀酒酵母,使菌體自身大量分泌肌醇,從而提高乙醇耐性,進一步篩選獲取能夠利用甘蔗汁發(fā)酵產燃料乙醇的工程菌株。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 菌種與質粒 釀酒酵母S288C:上海交通大學微生物代謝國家重點實驗室趙心清教授饋贈;釀酒酵母Y01(二倍體)保存于福建師范大學生命科學學院。pSH65載體本實驗室保藏。pURIH本實驗室構建。

        1.1.2 主要試劑和儀器 實驗所用的葡萄糖、蔗糖、酵母粉、蛋白胨、硫酸銨、濃硫酸、七水硫酸鎂、無水乙醇等試劑為國產分析純。肌醇和色譜用葡萄糖、無水乙醇為色譜純。DNA Marker、Plasmid MiniPrep Ki、Fastpfu Fly DNA Polymerase購自北京全式金生物技術有限公司;反轉錄試劑盒購自fermentas公司;G418、Zeocin、瓊脂糖和氨卞青霉素鈉均購自上海生工生物工程有限公司。主要儀器:Applied Biosystems 270 PCR儀;美國thermoD-37520高速冷凍離心機;Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System;Agilent 7890A氣相色譜。

        1.1.3 培養(yǎng)基 (1)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):酵母粉8、蔗糖 200、硫酸銨(NH4)2SO45、磷酸二氫鉀(KH2PO4)2、七水硫酸鎂(MgSO4·7H2O)2。(2)甘蔗汁發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):酵母粉8、硫酸銨(NH4)2SO45、磷酸二氫鉀(KH2PO4)2、七水硫酸鎂(MgSO4·7H2O)2,用煮沸后過濾的甘蔗汁配制,加蔗糖調糖度。(3)YPG誘導培養(yǎng)基(g/L):半乳糖20、蛋白胨20、酵母提取物10。(4)YPD完全培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20、蛋白胨20、酵母提取物10。

        1.2 方法

        1.2.1ino1基因整合表達載體pURIH的構建、轉化pURIH載體的構建、轉化以及ino1表達量的分析方法詳見參考文獻[9-10]。

        1.2.2 過表達菌株的乙醇耐受性分析 接種活化后的出發(fā)菌株Y01和過表達菌株YI2-1、YI2-2于YPD液體培養(yǎng)基中過夜振蕩培養(yǎng);檢測3菌株的菌液濃度,當同步生長時,取菌液做梯度稀釋后,各取2 μL相同濃度的菌液接種于乙醇濃度分別為5%、8%、9%、10%(V/V)的YPD固體培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)30 h。觀察菌落大小。為進一步分析菌株乙醇耐力,分別將過表達菌株和出發(fā)菌株接種到YPD液體培養(yǎng)基,進行30℃搖瓶培養(yǎng)至菌濃(OD600)達0.3,每份菌液中分別加入5%(V/V)的乙醇,或加入5%的水為空白對照。培養(yǎng)1 h后,菌體暴露在含不同乙醇濃度的PYD液體培養(yǎng)基中,在96孔板上孕育2 h。稀釋50倍點樣到YPD平板上培養(yǎng)48 h,觀察細胞生長活力情況。

        1.2.3 乙醇標準曲線的制作 準確吸取色譜用無水乙 醇 1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、7.5 mL和10 mL至50 mL容量瓶中,用ddH2O定容,配置成乙醇濃度分別為2%、4%、6%、8%、10%、15%、20%的標準樣品,用Agilent 7890A氣相色譜檢測。氣相色譜檢測條件:色譜柱為HP-FFAP(19091F-413);FID檢測器,檢測溫度300℃;載氣用氮氣;分流比20∶1;氣化室溫度為200℃;柱箱升溫程序為:130℃穩(wěn)定4 min,后運行200℃ 2.5 min。根據乙醇體積分數與色譜峰面積的關系,以乙醇體積分數為橫坐標,色譜峰面積平均值作為縱坐標,制成乙醇標準曲線。

        1.2.4 葡萄糖標準曲線的制作(3,5-二硝基水楊酸DNS法)稱取無水葡萄糖100 mg,加水定容至50 mL,振蕩搖勻后,得到濃度為2.00 mg/mL的葡萄糖標準溶液。再分別按表1,添加各試劑。

        表1 葡萄糖標準曲線的建立方法

        將各管混勻,置于沸水浴中5 min顯色后,立即置于水中冷卻至室溫,再向每管加入蒸餾水使其總體積為10 mL,振蕩搖勻,在540 nm下用0號管作為對照,分別取1-7號管的葡萄糖濃度為橫坐標,對應的OD540值為縱坐標,繪制葡萄糖的標準曲線。

        1.2.5 菌株蔗糖酶酶活的測定 測定方法參考文獻[11]。取 5 mL 發(fā)酵液 4 000 r/min 離心 6 min 收集菌體,ddH2O洗滌兩次后將細胞重懸于5 mL的乙酸鈉緩沖液中(pH4.6),取200 μL加入到5 mL的乙酸鈉配制的8%蔗糖溶液中,混合后30℃水浴30 min,取出放冰上,立即做適當稀釋,用DNS法測稀釋液中的還原糖。

        1.2.6 釀酒酵母厭氧發(fā)酵培養(yǎng)(1)種子液的培養(yǎng):接種Y01、YI2-1、YI2-1△KP于裝有50 mL YPD液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,30℃、220 r/min,保持通氣良好,過夜培養(yǎng)。次日取2mL菌液測菌濃,培養(yǎng)至各種子液細胞濃度一致。(2)按8%的接種量接種至100 mL的甘蔗汁發(fā)酵培養(yǎng)基中,通氣良好下30℃ 220 r/min培養(yǎng)8 h。(3)在超凈臺內將8層紗布換成滅過菌的發(fā)酵栓,并在發(fā)酵栓里加2 mL 40%的硫酸,以隔絕外界空氣進入。發(fā)酵裝置(圖1)靜置于30℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。

        圖1 發(fā)酵裝置

        1.2.7 發(fā)酵液中乙醇含量的測定 每隔12 h吸取2 mL發(fā)酵液在4℃下6 000 r/min離心5 min,用0.22 μm的過濾器過濾,濾液于樣品瓶內,Agilent 7890A氣相色譜儀分析其乙醇含量,色譜分析的條件參見乙醇標準曲線的制作。

        主要解釋變量分數量和質量兩個部分。(1)數量層面為rta,代表各國每年已經生效實施的區(qū)域貿易協定的數目;(2)質量層面為包括條款覆蓋率(wtoc)和法定承諾率(wtoe)兩個指標, “條款覆蓋率”=協議中涉及WTO+或WTO-X領域的條款數目/總條款數目×100%, “法律承諾率”=涉及WTO+或WTO-X領域具有法律效力的條款數量/協議所涵蓋條款數量×100%。計算時根據區(qū)域貿易協定原文比對計算得出。

        1.2.8 工程菌株的遺傳穩(wěn)定性 將過表達菌株YI2-1、YI2-1△KP接種至YPD液體培養(yǎng)基中30℃,220 r/min搖床培養(yǎng),隔36 h轉接至另一新鮮YPD液體培養(yǎng)基中,連續(xù)轉接20代,取菌液稀釋后涂布于YPD平板上。挑取單菌落用引物rDNA-F、rDNA-R進行PCR驗證,確定其遺傳穩(wěn)定性。

        2 結果

        2.1 過表達ino1釀酒酵母菌株的獲得

        將pURIH載體轉化釀酒酵母Y01,經G418抗性濃度梯度(0.5-2 g/L)平板篩選,PCR驗證,獲得重組菌YI1。為獲得更高ino1表達量的菌株,以YI1菌株為出發(fā)菌株再次轉化。經篩選獲得重組菌株YI2-1、YI2-2。Real-Time PCR分析ino1表達量,結果(圖2)顯示YI2-1、YI2-2菌株ino1基因mRNA轉錄水平分別是Y01的16.235倍和11.163倍。將抗性基因KanMX敲除后的菌株命名為YI2-1△KP。

        2.2 菌株的乙醇耐受性分析

        為驗證過表達菌株的耐乙醇能力,分別在含5%和10%(V/V)乙醇的YPD平板上培養(yǎng),在含5%乙醇濃度下液體培養(yǎng)與平板培養(yǎng)結果相符,菌株的生長狀況沒多大差別(圖3,圖4)。在含10%(V/V)乙醇濃度培養(yǎng)條件下,過表達菌株YI2的生長速率及菌落生長情況較好于出發(fā)菌株(圖5,圖6),表明過表達菌株的乙醇耐受性高于出發(fā)菌株,有較強的細胞活力,ino1的表達水平影響其活力。

        圖2 ino1基因的表達分析

        圖3 菌株在含5%(V/V)乙醇的YPD平板上的生長狀況

        圖4 菌株在含有50 g/L乙醇濃度下的搖瓶培養(yǎng)生長曲線

        圖5 菌株在含10%(V/V)乙醇的YPD平板上的生長狀況

        2.3 過表達菌株的遺傳穩(wěn)定性研究

        圖6 菌株在含有100 g/L乙醇濃度下的搖瓶培養(yǎng)生長曲線

        圖7 YI2-1、YI2-1△KP遺傳穩(wěn)定性驗證

        將過表達菌株連續(xù)轉接傳代20代后,提基因組進行PCR驗證。結果顯示(圖7),電泳條帶大小約為2 667 bp,與預期相符。表明ino1基因通過rDNA介導整合在釀酒酵母基因組上,過表達菌株YI2-1、YI2-1△KP具有很高的遺傳穩(wěn)定性。

        2.4 過表達菌株發(fā)酵性能的分析

        2.4.1 耐高乙醇能力檢測 不同濃度的乙醇耐力分析發(fā)現,YI2-1、YI2-1△KP兩菌株都能在在含9%(V/V)乙醇的YPD平板上生長(圖8),生長狀況沒多大差別。通過進一步的乙醇耐力分析方法處理后,培養(yǎng)結果見圖9,過表達菌YI2-1的乙醇耐性最高,可耐19%(V/V)的乙醇。

        2.4.2 氣相色譜檢測發(fā)酵液中乙醇的含量 乙醇標準曲線的制作:配制不同濃度的乙醇的標準溶液進行氣相色譜分析,繪制乙醇標準曲線(圖10)。其回歸方程為y=428736x+314.24(R2)=0.999 5。

        圖8 過表達菌株在含9%乙醇的YPD平板上的生長狀況(48 h)

        圖9 不同菌株的乙醇耐力分析

        圖10 乙醇標準曲線

        菌提高8.55%。而過表達菌株YI2-1△KP的最大乙醇積累量為13.17%(V/V),較出發(fā)菌提高9.16%。

        2.4.3 高糖度甘蔗汁發(fā)酵實驗 同上接種方法,利用29oBx甘蔗汁發(fā)酵培養(yǎng)基,進行厭氧發(fā)酵。不同時間取樣,測定發(fā)酵醪液的酒精度。結果如表2。過表達菌株表現出相對較突出的的高滲透壓脅迫耐受性,酵母菌YI2-1 72 h的乙醇積累量為16.31%(V/V),較出發(fā)菌株最高乙醇積累量15.24%,提高了7.03%(V/V)。而過表達菌株YI2-1△KP靜止發(fā)酵8 d后,測定的乙醇積累量達到17.14%(V/V)。

        圖11 20oBx甘蔗汁培養(yǎng)基厭氧發(fā)酵乙醇產量變化

        表2 高糖度甘蔗汁(29oBx)厭氧發(fā)酵乙醇產量變化

        2.4.4 蔗糖酶活力分析 為研究肌醇表達量的不同對蔗糖酶分泌的影響,細胞培養(yǎng)72 h后,測定了蔗糖酶比活的大小。根據DNS法測得菌體分泌蔗糖酶酶解蔗糖溶液產生的還原糖,及菌體干重,計算得Y01、YI2-1 和 YI2-1△KP,72 h的蔗糖酶比活分別為76.3 U/mg,81.1 U/mg,83.6 U/mg。過表達菌株比出發(fā)菌株的蔗糖酶比活要高,表明肌醇對蔗糖酶分泌具有一定的調控作用。

        3 討論

        選育乙醇耐受性和發(fā)酵性能優(yōu)良的釀酒酵母菌株,是提高乙醇產量的一條必要途徑。通過基因工程改造選育是熱點[12]。本研究通過過表達釀酒酵母ino1基因,構建獲得重組菌,并對其乙醇耐性和發(fā)酵性能進行了研究。

        在含有100 g/L乙醇濃度下的搖瓶培養(yǎng)生長曲線顯示,過表達菌株對數期菌體生長速率均比出發(fā)菌株快,菌株的高乙醇耐受性分析顯示過表達菌YI2-1可耐19%(V/V)的乙醇,比出發(fā)菌株高,表明乙醇存在下,酵母細胞ino1基因表達量水平對提高細胞活力,耐高乙醇是極其重要的,與Furukawa[6]的研究一致??赡茉蛴校阂环矫?,肌醇量能夠影響細胞膜透性,低濃度肌醇影響細胞內物質的泄漏,如核苷酸、磷和鉀等,進而影響細胞內pH、H+-ATPase的活性,改變細胞質離子穩(wěn)態(tài),影響膜透性屏障。高的肌醇量使ATPase的活性提高,抵償質子流入量,觸發(fā)改變脂質組成,最終提高乙醇耐受性[13]。另一方面,肌醇是磷脂酰肌醇(PI)合成的前體,而在真核細胞中,多種磷酸化形式的PI對于細胞信號傳導、各種生理功能發(fā)揮極其重要作用[11]。

        甘蔗汁培養(yǎng)基發(fā)酵實驗,乙醇產量分析顯示,過表達菌株YI2-1△KP的最大乙醇積累量為13.17%(V/V),較出發(fā)菌提高了9.16%。實驗結果表明,乙醇耐受性實驗可在一定程度上反應乙醇產量,過表達菌株的乙醇耐受性強,從而使乙醇的積累量得到提高。高糖度甘蔗汁(29oBx)厭氧發(fā)酵乙醇產量分析顯示,過表達菌株具有較突出的高滲透壓脅迫耐受性,這與肌醇量能夠影響細胞膜透性是一致的。

        綜上所述,過表達ino1基因能夠明顯的提高釀酒酵母的乙醇耐受性。本研究構建的工程菌株能夠利用能源甘蔗汁發(fā)酵,生產較高體積產率的乙醇。后期需要繼續(xù)對發(fā)酵工藝優(yōu)化等進行研究,有望進一步提高乙醇產量。最后,乙醇耐性機理比較復雜,還尚未明晰。釀酒酵母的乙醇耐受性受多種基因控制,所以研究者仍然需要對酵母菌分子機制做進一步研究。

        4 結論

        在釀酒酵母中過表達ino1基因可提高重組釀酒酵母的乙醇耐受性及產量。對過表達菌株的乙醇耐受性進行分析,YI2-1可耐19%(V/V)的乙醇。為生物安全性考慮,利用YPG誘導培養(yǎng)基,誘導表達cre重組酶切除KanMX抗性基因,獲得無有害抗性基因的過表達菌株YI2-1△KP,并進行了連續(xù)傳代培養(yǎng),結果表明過表達菌株具有很高的遺傳穩(wěn)定性。利用甘蔗汁為碳源進行發(fā)酵培養(yǎng),采用氣相色譜(GC)對發(fā)酵產物乙醇進行檢測,重組菌YI2-1△KP的最大乙醇積累量為13.17%(V/V),與出發(fā)菌株相比提高了9.16%。研究表明通過過表達釀酒酵母ino1基因能夠有效提高菌株細胞活力、乙醇耐受性。

        猜你喜歡
        甘蔗汁肌醇耐受性
        甘蔗汁做的朗姆酒和甘蔗渣做的朗姆酒有什么不同?
        膜過濾技術在甘蔗汁澄清中的應用
        應用化工(2023年8期)2023-10-28 12:29:04
        低蛋白質日糧添加植酸酶和肌醇對蛋雞生產性能、蛋品質及消化道發(fā)育的影響
        中國飼料(2022年6期)2022-04-22 05:14:30
        4個地被菊新品系對濕熱脅迫的耐受性研究
        園林科技(2020年2期)2020-01-18 03:28:18
        甘蔗汁多酚氧化酶的提取研究
        磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在肝細胞癌組織中的表達及臨床意義
        兩性聚丙烯酰胺澄清甘蔗汁的研究
        巴氏醋桿菌核酸修復酶UvrA對大腸桿菌耐受性的影響
        微生物法生產肌醇研究進展
        miR-29b通過靶向PI3K/Akt信號通路降低胃癌細胞對順鉑的耐受性
        在线综合网| 国产精品国产精品国产专区不卡| 人妻久久久一区二区三区| 东京热久久综合久久88| 国产美女av一区二区三区| 亚洲一区二区三区日韩在线观看 | 成人免费无遮挡在线播放| 国产无遮挡a片又黄又爽| 久久99精品波多结衣一区| 日本午夜艺术一区二区| 久久精品国产亚洲av网站| 欧美在线视频免费观看| 色老汉亚洲av影院天天精品| 亚洲av一区二区三区蜜桃| 亚洲精品无码久久久影院相关影片 | 久久精品中文字幕无码绿巨人| 亚洲av无码1区2区久久| 国产h视频在线观看网站免费 | 无码人妻久久一区二区三区不卡| 揄拍成人国产精品视频| 一区二区黄色素人黄色| 伦伦影院午夜理论片| 热re99久久精品国产99热| 91久久国产情侣真实对白| 五月激情四射开心久久久| 综合色区亚洲熟妇另类| 狼人国产精品亚洲| 国产一级一片内射视频在线| 亚洲国产婷婷香蕉久久久久久| 手机在线看永久av片免费| 亚洲国产日韩欧美高清片a| 狂插美女流出白浆视频在线观看| 女人和拘做受全程看视频| 少妇AV射精精品蜜桃专区| 国产性感主播一区二区| 内射中出日韩无国产剧情| 久久这里只精品国产免费10| 久久国产精品男人的天堂av | 国产av91在线播放| 日本一区二区三区高清在线视频| 毛片大全真人在线|