金永梅 馬瑞 于志晶 林秀峰

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，長(zhǎng)春 130124）

自1996年以來(lái)，全球轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物商業(yè)化種植面積和銷售收入均以倍數(shù)增長(zhǎng)。水稻是我國(guó)乃至全世界最重要的糧食作物之一，目前，全球轉(zhuǎn)基因水稻研究進(jìn)展迅速，我國(guó)轉(zhuǎn)基因水稻研發(fā)與世界同步，成功培育出抗螟蟲(chóng)、抗除草劑、耐鹽、氮磷高效轉(zhuǎn)基因和優(yōu)質(zhì)等系列轉(zhuǎn)基因水稻品種/品系，為我國(guó)轉(zhuǎn)基因水稻的產(chǎn)業(yè)化提供了技術(shù)和品種儲(chǔ)備［1］。

通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以將外源基因?qū)氲绞荏w中，改良目標(biāo)農(nóng)藝性狀。外源基因的插入改變了一個(gè)基因與其鄰近基因或其鄰近染色質(zhì)的位置關(guān)系，隨著外源基因的整合區(qū)域的不同可發(fā)生位置效應(yīng)，從而影響宿主植物的特定功能及表型。因此，研究T-DNA插入位點(diǎn)的旁側(cè)序列及其插入位點(diǎn)就顯得尤為重要［2］。利用農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入的外源基因在宿主基因組的插入位點(diǎn)是隨機(jī)的，每個(gè)轉(zhuǎn)化事件中外源基因和基因組DNA拼接組成的旁側(cè)序列具有唯一性。因此，T-DNA旁側(cè)序列分析一直是轉(zhuǎn)基因植物研究的熱點(diǎn)，它對(duì)于闡述T-DNA整合方式、染色體定位、轉(zhuǎn)基因表達(dá)活性等具有重要意義。T-DNA整合過(guò)程是個(gè)復(fù)雜的異常重組過(guò)程，包括植物基因組整合位點(diǎn)的刪除和重復(fù)，T-DNA序列的刪除和重復(fù)，以及染色體上的易位和到位等現(xiàn)象［3-4］。

染色體步移（Chromosome walking）是指從生物基因組或基因組文庫(kù)中的已知序列出發(fā)，逐步探知其旁鄰的未知序列或與已知序列呈線性關(guān)系的目標(biāo)序列的方法。分離旁側(cè)序列的染色體步移方法主要采用基于PCR擴(kuò)增的染色體步移技術(shù)中的半隨機(jī)引物PCR策略。半隨機(jī)引物PCR策略中的熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR（Tail-PCR）是將目標(biāo)序列旁的已知序列中設(shè)計(jì)的3個(gè)嵌套的特定引物（Special primer SP1，SP2，SP3）分別與1個(gè)具有低Tm值的隨機(jī)簡(jiǎn)并引物（Arbitary degenerate Primer，AD）相結(jié)合，根據(jù)引物的長(zhǎng)短和特異性的差異設(shè)計(jì)不對(duì)稱的溫度循環(huán)，通過(guò)分級(jí)反應(yīng)來(lái)擴(kuò)增特異產(chǎn)物的方法，該方法準(zhǔn)確性高、操作相對(duì)簡(jiǎn)單［5］。

根據(jù)所分離的旁側(cè)序列，通過(guò)與NCBI的比對(duì)分析確定T-DNA在基因組中的整合位點(diǎn)。該序列是不同轉(zhuǎn)基因作物品系的特異性身份標(biāo)識(shí)，根據(jù)其建立的品系特異性檢測(cè)方法能快速、準(zhǔn)確地鑒定不同轉(zhuǎn)基因作物品系［6-7］，保證了轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)的準(zhǔn)確性和專一性，為監(jiān)管轉(zhuǎn)基因作物的育種、生產(chǎn)、加工和銷售提供了可靠的技術(shù)支撐［8-9］。利用外源基因在受體基因組上整合位點(diǎn)的唯一性，可以建立品系特異性檢測(cè)方法，該方法可根據(jù)外源DNA與旁側(cè)植物基因組連接區(qū)序列為靶標(biāo)設(shè)計(jì)引物，利用PCR方法擴(kuò)增出對(duì)照和轉(zhuǎn)基因品系特異的PCR條帶［10］。

Bt抗蟲(chóng)基因cry1C所編碼的殺蟲(chóng)蛋白可以抑制和殺死鱗翅目害蟲(chóng)，是在野生型Cry1Ca5基因的基

礎(chǔ)上通過(guò)序列優(yōu)化人工合成的抗蟲(chóng)基因［11］。目前，利用生物技術(shù)手段將cry1C基因?qū)氲礁鞣N植物中，包括水稻［12-14］、大豆［15-16］、玉米［17-18］等作物，成功獲得了對(duì)抗鱗翅目害蟲(chóng)具有抗性的轉(zhuǎn)基因植物。前期研究中，我們利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將cry1C基因?qū)氲剿酒贩N吉粳88中，獲得了抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因水稻吉生粳3號(hào)［19］。本研究旨在通過(guò)染色體步移方法獲得吉生粳3號(hào)的左、右邊界旁側(cè)序列，依據(jù)旁側(cè)序列確定T-DNA在基因組中的插入位點(diǎn)，并建立吉生粳3號(hào)品系特異性PCR方法，為吉生粳3號(hào)的身份識(shí)別提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)基因水稻吉生粳3號(hào)由本課題組培育保存；非轉(zhuǎn)基因水稻吉粳88由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 將種子播種在1/2MS培養(yǎng)基中，7 d后取樣保存。采用CTAB方法提取0.1g水稻樣品中的基因組DNA［20］。DNA樣品的純度和濃度用NanoDrop進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因植株吉生粳3號(hào)的Southern Blot 利用CTAB法提取水稻葉片的基因組DNA，利用DIGHigh Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I（Roche公司）進(jìn)行Southern雜交，方法參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。具體步驟為：取60 μg基因組DNA，用限制性內(nèi)切酶SacI（TaKaRa）進(jìn)行完全酶切。酶切產(chǎn)物用0.8% 瓊脂糖凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)膜（Amersham），用地高辛標(biāo)記的cry1C探針進(jìn)行雜交，再用X-光膠片化學(xué)發(fā)光自顯影。

擴(kuò)增探針引物序列為：cry1C-F：5'-TTCTACTGGGGAGGACATCG-3'，cry1C-R ：5'-CGGTATCTTGGGTGATTGG-3'。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因水稻吉生粳3號(hào)的右邊界旁側(cè)序列的獲取 采用染色體步移試劑盒（TaKaRa GenomeWalking Kit，Code No.6108）分離吉生粳3號(hào)中外源載體插入位點(diǎn)處的旁側(cè)序列。在已知的T-DNA序列右邊界設(shè)計(jì)3條同向且退火溫度較高的特異性引物（表 1）。

以1 μL（200 ng 左右）吉生粳3號(hào)基因組DNA為模板，使用右邊界特異性引物和試劑盒中的簡(jiǎn)并引物AP1、AP2、AP3、AP4進(jìn)行巢式PCR。

表1 T-DNA右邊界巢式引物序列

巢式PCR擴(kuò)增體系為：1st PCR 反應(yīng)在50 μL體系中進(jìn)行，以1 μL基因組DNA，0.5 μL TaKaRa LA Taq（5 U/μL），5 μL 的 10×LA PCR Buffer II（Mg2+plus），8 μL 的 dNTP Mixture（2.5 mM each），1 μL的 AP1、AP2、AP3、AP4 引 物（100 pmol/μL），1 μL的SP1引物（10 pmol/μL）進(jìn)行擴(kuò)增；2nd和3rd PCR反應(yīng)分別將上一輪PCR反應(yīng)液稀釋1 000倍后，取 1 μL作為 PCR 反 應(yīng) 模 板，1 μL的 AP1、AP2、AP3、AP4 引物（100 pmol/μL）分別與 1 μL 的 SP2和SP3引物（10 pmol/μL）進(jìn)行擴(kuò)增PCR擴(kuò)增體系同上；巢式PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序按照染色體步移試劑盒（TaKaRa GenomeWalking Kit，Code No.6108） 中的方法進(jìn)行。

取1st，2nd，3rd PCR反應(yīng)液各5 μL，使用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，分析PCR擴(kuò)增條帶并篩選有義引物組合，切膠回收被選條帶，利用pMDTM 19-T Vector（Takara，Code No.6013）進(jìn)行 TA 克?。═aKaRa DNA Ligation Kit，TaKaRa，Code No.6022），陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序獲得右邊界旁側(cè)序列，測(cè)序引物為5'-CCAGTTCAGCTAATCTTCTT-3'。引物合成及PCR擴(kuò)增條帶的測(cè)序均由寶生物有限公司完成。

1.2.4 旁側(cè)序列比對(duì)分析及插入位點(diǎn)的確定 利用NCBI BLAST 軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST），將PCR擴(kuò)增條帶的測(cè)序結(jié)果分別與水稻基因組序列和T-DNA序列進(jìn)行同源比對(duì)分析，確定外源T-DNA在吉生粳3號(hào)基因組中的插入位點(diǎn)。

1.2.5 吉生粳3號(hào)的左邊界旁側(cè)序列獲取 在吉生粳3號(hào)基因組中T-DNA插入位點(diǎn)的左側(cè)設(shè)計(jì)正向引物（C10-1496F），在T-DNA左邊界設(shè)計(jì)3條同向巢式引物（C10F-SP4，C10F-SP5，C10F-SP6），進(jìn)行PCR擴(kuò)增以進(jìn)一步確認(rèn)插入位點(diǎn)的正確性。引物序列見(jiàn)表2。

表2 T-DNA左邊界巢式引物序列

PCR 擴(kuò)增體系為：總體系20 μL，康為世紀(jì)2×Es Taq MasterMix 10 μL（含有 Es Taq DNA Polymerase，PCR buffer，3 mmol/L MgCl2，400 μmol/L dNTP mix），引物各 1 μL（10 μmol/L），水稻 DNA 2 μL（100 ng/μL），剩余用ddH2O 補(bǔ)足；PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 1 min；94℃ 10 s，55℃ 1 min，72℃ 40 s，35 個(gè)循環(huán) ；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)回收、純化、測(cè)序獲得左邊界旁側(cè)序列。

1.2.6 吉生粳3號(hào)特異性PCR檢測(cè) 提取非轉(zhuǎn)基因?qū)φ掌贩N（吉粳88）和吉生粳3號(hào)基因組DNA進(jìn)行特異性PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)在25 μL體系中進(jìn)行 ：12.5 μL 的 康 為 世 紀(jì) 2×Es Taq MasterMix（ 含有 Es Taq DNA Polymerase，PCR buffer，3 mmol/L MgCl2，400 μmol/L dNTP mix），1 μL 10 μmol/L 正向引物，1 μL 10 μmol/L 反向引物，1 μL T-DNA 特異性引物，水稻基因組 DNA 2 μL（100 ng/μL），剩余用ddH2O 補(bǔ)足。反應(yīng)條件為：94℃ PCR預(yù)變性2 min，94℃變性 30 s，55℃退火 30 s，35循環(huán)，72℃10 min，引物序列如下：正向引物為C10-F：TGCACGCCTACTCCACATTA，反向引物為C10-R：TGCTTGCTAGACTCACCACA，T-DNA特異性引物為C10-TDNAR：TCACCACTCGATACAGGCAG。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)基因水稻吉生粳3號(hào)右邊界旁側(cè)序列及插入位點(diǎn)

通過(guò)農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化法，將Bt抗蟲(chóng)基因cry1C的P3300-cry1C植物表達(dá)載體，導(dǎo)入到吉林省水稻品種吉粳88中，獲得了抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因水稻獨(dú)立轉(zhuǎn)化植株。通過(guò)分子檢測(cè)和抗性分離比分析，從49個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化植株中篩選出8個(gè)單拷貝株系。分別提取和非轉(zhuǎn)基因水稻和吉生粳3號(hào)的基因組DNA，用限制性內(nèi)切酶SacI和DraI分別進(jìn)行酶切，地高辛標(biāo)記的cry1C探針進(jìn)行雜交，篩選出外源目的基因cry1C為單拷貝的轉(zhuǎn)基因水稻株系吉生粳3號(hào)（圖1）。

圖1 植物表達(dá)載體示意圖與Southern blot

為了獲取吉生粳3號(hào)右邊界旁側(cè)序列，提取基因組DNA，利用染色體步移方法獲得PCR特征條帶。T-DNA序列右邊界3條同向巢式引物C10R-SP1、C10R-SP2、C10R-SP3，分別與簡(jiǎn)并引物AP1、AP2、AP3、AP4進(jìn)行3輪PCR擴(kuò)增。結(jié)果（圖2）表明，3輪PCR所有引物組合均獲得比較清晰的PCR條帶，但只有簡(jiǎn)并引物AP2與3條巢式引物組合所獲得的條帶大小呈遞減趨勢(shì)（泳道4-6），因此可以判斷為吉生粳3號(hào)右邊界旁側(cè)序列的特異性條帶。

切膠回收C10R-SP3與AP2引物組合擴(kuò)增出的PCR條帶（圖2-B中泳道6，約1.8 kb），通過(guò)TA克隆方法獲得包含目的片段的載體，經(jīng)過(guò)目的片段的測(cè)序最終獲得目的片段的核苷酸序列。

將吉生粳3號(hào)右邊界旁側(cè)序列（圖3-A），利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的 BLAST工具進(jìn)行比對(duì)，確定了T-DNA在吉生粳3號(hào)基因組中的插入位點(diǎn)。比對(duì)分析結(jié)果表明，吉生粳3號(hào)右邊界旁側(cè)序列中1-67 bp區(qū)段與載體序列右邊界的部分序列有100%的相似性，68-732 bp區(qū)段與水稻基因組（日本晴）2號(hào)染色體上的基因間區(qū)（非編碼區(qū)）2 790 589-2 789 925 bp區(qū)段具有99%的相似性，因此插入位點(diǎn)初步可以判斷為2 790 589（圖3-B）。

圖2 吉生粳3號(hào)右邊界旁側(cè)序列巢式PCR

2.2 吉生粳3號(hào)左邊界旁側(cè)序列及插入位點(diǎn)

根據(jù)吉生粳3號(hào)右邊界旁側(cè)序列確定的插入位點(diǎn)，在吉生粳3號(hào)插入位點(diǎn)左側(cè)基因組中設(shè)計(jì)正向引物（C10-Chr2-1496F），在T-DNA左邊界區(qū)段設(shè)計(jì)3條同向T-DNA特異性巢式引物（C10F-SP4，C10F-SP5，C10F-SP6）（表 2）進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，進(jìn)一步確認(rèn)插入位點(diǎn)的正確性。PCR結(jié)果獲得了3條大小遞減的PCR特征條帶，對(duì)其中一條PCR條帶（泳道3）進(jìn)行了回收、克隆、測(cè)序（圖4）。測(cè)序獲得的序列分別與載體序列和水稻基因組序進(jìn)行列比對(duì)確定插入位點(diǎn)，結(jié)果插入位點(diǎn)確定為水稻基因組（日本晴）2號(hào)染色體上的2790685。

圖4 吉生粳3號(hào)左邊界PCR

2.3 吉生粳3號(hào)的T-DNA插入位點(diǎn)及品系特異性PCR檢測(cè)

根據(jù)右邊界旁側(cè)序列可以判斷T-DNA在吉生粳3號(hào)基因組中的插入位點(diǎn)為2號(hào)染色體上的2 790 589位，根據(jù)左邊界旁側(cè)序列可以插入位點(diǎn)為2號(hào)染色體上的2 790 685位。因此，根據(jù)左、右邊界旁側(cè)序列可以確定T-DNA的插入位點(diǎn)為2號(hào)染色體上的2 790 685-2 790 589位點(diǎn)，水稻基因組序列發(fā)生了96個(gè)堿基的缺失（圖5-A）。

在吉生粳3號(hào)基因組中T-DNA的插入位點(diǎn)兩側(cè)分別設(shè)計(jì)正向引物和反向引物（C10-F和C10-R），在T-DNA的左邊界設(shè)計(jì)特異性引物（C10F-TDNAR），進(jìn)行吉生粳3號(hào)特異性PCR檢測(cè)。提取非轉(zhuǎn)基因?qū)φ铡⒓?號(hào)、和其它兩個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻株系的基因組DNA，用上述3條引物同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序中延伸時(shí)間限定為40 s，因此在吉生粳3號(hào)中引物C10-F和C10F-TDNAR可進(jìn)行擴(kuò)增，在非轉(zhuǎn)基因?qū)φ蘸推渌蜣D(zhuǎn)基因水稻株系中引物C10-F和C10-R可進(jìn)行擴(kuò)增。PCR結(jié)果（圖5-B）發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因水稻吉生粳3號(hào)中擴(kuò)增出一條428 bp的轉(zhuǎn)基因特異性片段，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ蘸推渌鼉蓚€(gè)轉(zhuǎn)基因株系中擴(kuò)增出一條1 023 bp的非轉(zhuǎn)基因特異性片段，與預(yù)期大小一致，說(shuō)明引物C10-F、C10-R、C10F-TDNAR能夠特異性地識(shí)別吉生粳3號(hào)水稻。

圖5 T-DNA在吉生粳3號(hào)基因組中的插入位點(diǎn)及品系特異性PCR

3 討論

在轉(zhuǎn)基因生物中外源基因的T-DNA旁側(cè)序列具有非常重要的意義，利用它可以分析T-DNA在宿主生物基因組中的整合方式、染色體定位、對(duì)內(nèi)源基因的表達(dá)影響等情況。目前，分離旁側(cè)序列的方法有Tail-PCR、反向PCR、質(zhì)粒拯救、染色體步移、全基因組測(cè)序等。李亞麗等［21］通過(guò)Tail-PCR方法分離了轉(zhuǎn)mCherry基因水稻T-DNA旁側(cè)序列并確定了它在基因組中的整合位點(diǎn)；Cao等［22］利用染色體步移方法分離轉(zhuǎn)基因小麥品系B10201-2的旁側(cè)序列，并建立了品系特異性PCR方法；Guo等［23］利用全基因組測(cè)序方法，在轉(zhuǎn)基因大豆中分離了G2EPSPS基因和GAT基因的旁側(cè)序列并確定了基因組中的插入位點(diǎn)。

轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的整合區(qū)域與外源基因的穩(wěn)定表達(dá)及宿主基因組中上下游基因的正常表達(dá)密切相關(guān)。如果T-DNA整合進(jìn)入內(nèi)含子，外源基因容易造成基因沉默，導(dǎo)致目的基因不表達(dá)；如果T-DNA整合進(jìn)入功能基因內(nèi)部，會(huì)影響功能基因的正常表達(dá)并會(huì)對(duì)基因功能造成影響。因此，轉(zhuǎn)化事件篩選過(guò)程中的眾多指標(biāo)中選擇T-DNA整合進(jìn)入基因間區(qū)的轉(zhuǎn)化事件是重要指標(biāo)之一。有研究表明，外源基因片段易整合進(jìn)入植物基因組中轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域或染色體的末端［24-25］；在轉(zhuǎn)基因擬南芥中T-DNA整合位點(diǎn)與染色體上基因分布的密度相關(guān)，T-DNA插入位點(diǎn)傾向于基因間區(qū)域，整合在外顯子與內(nèi)含子區(qū)域的頻率沒(méi)有顯著性差異［26］。為了分析外源基因T-DNA在抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因水稻吉生粳3號(hào)中的整合區(qū)域與插入位點(diǎn)，我們通過(guò)染色體步移方法分離了吉生粳3號(hào)的右邊界旁側(cè)序列。根據(jù)右邊界旁側(cè)定位外源基因在轉(zhuǎn)基因水稻吉生粳3號(hào)基因組中的插入位點(diǎn)并分離出右邊界旁側(cè)序列。由于吉生粳3號(hào)轉(zhuǎn)基因水稻的外源基因T-DNA區(qū)域插入到水稻基因組2號(hào)染色體的基因間區(qū)，因此，外源片段的插入不會(huì)使吉生粳3號(hào)產(chǎn)生位置效應(yīng)。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻吉生粳3號(hào)多個(gè)世代的外源目的基因遺傳穩(wěn)定性分析表明，cry1C基因在DNA水平、RNA水平和蛋白水平上表達(dá)穩(wěn)定；農(nóng)藝性狀和目標(biāo)性狀鑒定分析發(fā)現(xiàn)，除了抗蟲(chóng)性之外其他農(nóng)藝性狀與對(duì)照品種沒(méi)有顯著差異，并且保持穩(wěn)定，說(shuō)明T-DNA在吉生粳3號(hào)基因組中的插入位點(diǎn)對(duì)外源基因自身的穩(wěn)定表達(dá)和水稻內(nèi)源基因的表達(dá)均沒(méi)有造成不利影響（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。

吉生粳3號(hào)的左右邊界旁側(cè)序列分析表明，在外源基因的整合過(guò)程中T-DNA右邊界旁側(cè)序列的斷裂點(diǎn)在A、T堿基處，左邊界斷裂點(diǎn)在C、T堿基處，水稻基因組序列缺失了96 bp，載體序列未發(fā)生堿基缺失或易位等變化。有研究表明轉(zhuǎn)基因水稻T-DNA左右邊界及邊界內(nèi)側(cè)序列的斷裂點(diǎn)主要集中在A、T堿基處［20］；Tzfira等［27］認(rèn)為T(mén)-DNA 整合進(jìn)宿主基因組的主要路徑為雙鏈斷裂修復(fù)機(jī)制，T-DNA整合過(guò)程中農(nóng)桿菌中的稀有位點(diǎn)限制性內(nèi)切酶在宿主中表達(dá)，使宿主基因組DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂，并且在宿主體內(nèi)消化T-DNA，導(dǎo)致宿主基因組序列的缺失和T-DNA的丟失。

轉(zhuǎn)基因作物品系特異性檢測(cè)方法特異性高，適合轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定性和定量檢測(cè)，是對(duì)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行監(jiān)督管理、保障其健康發(fā)展的重要技術(shù)基礎(chǔ)。郭超等［28］利用hiTail-PCR方法獲得了轉(zhuǎn)基因水稻BarKasalath-01中外源基因在基因組上的旁側(cè)序列并建立了該轉(zhuǎn)化事件特異性檢測(cè)方法；金蕪軍［29］等人于2013年基于轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻品系TT51-1的旁側(cè)序列建立了鑒定純合型轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻品系TT51-1 的方法。本研究中，根據(jù)外源基因T-DNA在吉生粳3號(hào)基因組中的整合位點(diǎn)，在整合位點(diǎn)兩側(cè)和T-DNA左邊界共設(shè)計(jì)3條引物，建立了吉生粳3號(hào)品系特異性PCR檢測(cè)方法。本研究所建立的cry1C轉(zhuǎn)基因吉生粳3號(hào)品系水稻特異性檢測(cè)方法，對(duì)提高該品系的鑒定效率及準(zhǔn)確性具有重要意義。

4 結(jié)論

本研究利用染色體步移方法，獲得轉(zhuǎn)cry1C基因抗蟲(chóng)水稻吉生粳3號(hào)的外源基因旁側(cè)序列及其水稻基因組中的插入位點(diǎn)，并建立了吉生粳3號(hào)品系特異性PCR檢測(cè)方法。該結(jié)果為吉生粳3號(hào)的身份識(shí)別提供了準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)技術(shù)手段。